Рекомбинантные вакцины против вируса "синего языка", их применение

Рекомбинантные вакцины против вируса "синего языка", их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Данная заявка заявляет преимущество предварительной заявки США порядковый №61/313,164, поданной 12 марта 2010, и предварительной заявки США порядковый №61/366,363 поданной 21 июля 2010.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к композициям, предназначенным для борьбы с инфекцией вирусом «синего языка» (BTV) у животных. Настоящее изобретение предоставляет фармацевтические композиции, содержащие антиген BTV, способы вакцинации против BTV и наборы, для применения с такими способами и композициями.

Известный уровень техники

«Синий язык» (ВТ) представляет собой передающееся членистоногими инфекционное вирусное заболевание жвачных животных. Крупный рогатый скот и козы могут быть легко инфицированы вирусом «синего языка» (BTV), являющимся причиной болезни, однако при этом отсутствует обширное сосудистое повреждение, и, следовательно, у этих видов в большинстве случаев не наблюдаются выраженные клинические симптомы. В противоположность этому, заболевание у овец характеризуется катаральным воспалением слизистых оболочек рта, носа и переднего отдела желудка, а также воспалением венчика копыт и основы кожи копыт.Происходит отделение (экскориация) эпителия и в конечном итоге некроз слизистой оболочки щеки; опухший и воспаленный язык и рот могут принять синюю окраску, из-за которой болезнь получила свое название (Spreull 1905). Процент смертности среди овец оценивается на уровне 1-30%.

BTV представляет собой прототип вируса рода Orbivirus (семейство Reoviridae) и состоит, по меньшей мере, из 24 различных серотипов (Wilson and Mecham 2000). Различные штаммы BTV выявлены по всей территории тропических и умеренных зон по всему миру. Инфекция BTV встречается до 45° с.ш. в Европе, до 50° с.ш. в Азии и Северной Америке и до 35° на юг. BTV не передается между жвачными животными, следовательно распространение BTV зависит от присутствия членистоногих переносчиков вида coides sp. (мокрецы), причем разных видов-переносчиков в различных регионах мира. Последние данные подтверждают, что дрейф генов и эффект основателя способствует разнообразию отдельных генных сегментов полевых штаммов BTV (Bonneau, Mullens et al. 2001).

Инфекция BTV у жвачных животных является транзиторной (кратковременной), тогда как инфекция, переносимая насекомыми рода Culicoides, является персистирующей. Продолжительность вирусемии (наличия вируса в крови) зависит от вида животного и штамма BTV. Сообщалось, что вирусемия у овец может быть очень кратковременной и может длиться до 41 дня у особей, инфицированных BTV, до 42 дней у коз и до 100 дней у крупного рогатого скота. Так как инфицирование крупного рогатого скота вирусом BTV часто приводит к затянувшейся, но не постоянной вирусемии, крупный рогатый скот служит источником, из которого переносчик рода Culicoides может получить вирус и затем передать его другим жвачным животным (Anderson, Stott et al. 1985; MacLachlan 1994; MacLachlan and Pearson 2004). Экология многих видов переносчиков рода Culicoides плохо изучена, места их размножения в основном неохарактеризованы, и неизвестна скорость их распространения. Основным переносчиком BTV в Северной Америке является Culicoides sonorensis. Самки насекомых Culicoides становятся постоянно инфицированными вирусом BTV и могут передавать вирус после внешнего инкубационного периода, длящегося до 14 дней (Mullens, Tabachnick et al. 1995). BTV, перезимовавший в температурных зонах, может передаваться вертикально у инфицированных насекомых-переносчиков, хотя последние данные указывают, что наблюдается пониженная экспрессия генов внешнего капсида во время персистирующей инфекции BTV на личиночных стадиях насекомых-переносчиков (White, Wilson et al. 2005).

Вирионы BTV имеют диаметр ~69 нм вместе с двойной оболочкой (капсид), который иногда окружен липопротеиновой "псевдо-оболочкой", возникающей из клеточных мембран инфицированных клеток. Геном BTV включает 10 различных сегментов двухцепочечной РНК, которые совместно кодируют семь структурных (с VP1 по VP7) и четыре неструктурных (NS1, NS2, NS3 и NS3a) белка (Roy 1996). Девять из геномных сегментов являются моноцистронными, в то время как сегмент 10 кодирует и NS3 и NS3A с помощью второго инициирующего кодона, находящегося внутри рамки считывания. Икосаэдрическая частица вириона содержит геномную РНК, заключенную в белковый капсид с двухслойной оболочкой (Verwoerd, Els et al. 1972). Сердцевина икосаэдра состоит из двух основных (VP3 и VP7) и трех минорных (VP1, VP4, VP6) белков и окружена внешней капсидной оболочкой, состоящей из VP2 и VP5, которые соответственно кодируются геномными сегментами 2 и 5 (Roy 1996). VP2 является ответственным за связывание и вход BTV в клетки, нейтрализацию, серотип-специфичность и гемагглютинацию. Мультимерные формы VP2 (димеры и тримеры) занимают значительную часть поверхности каркаса VP5 на внешней поверхности вирусных частиц (Hassan and Roy 1999). VP2 варьирует больше всего среди 24 BTV серотипов, при этом уровни анти-VP2 антител коррелируют с нейтрализацией вируса in vitro и in vivo (Huismans and Erasmus 1981). VP5 также заметно варьирует между разными серотипами и штаммами BTV (de Mattos, de Mattos et al. 1994; DeMaula, Bonneau et al. 2000), и, хотя до настоящего времени VP5-специфичные нейтрализующие MAb's не установлены, данные наводят на мысль, что этот белок играет роль в нейтрализации и установлении серотипа посредством его конформационного влияния на VP2 (Huismans and Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al. 1990; DeMaula et al., 2000). Очищенный VP2, иммуноабсорбированный с сывороткой против сердцевины BTV для удаления следового количества VP7, обеспечивает защиту от инфекции овец тем же самым BTV серотипом (Huismans, van der Walt et al. 1987). Недавние результаты показывают, что VP2 и NS1 экспрессируют эпитопы, распознаваемые цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) (Andrew, Whiteley et al. 1995), в то время как маловероятно, что VP7 и VP5 имеют CTL эпитопы. На настоящий момент VP3, VP4, VP6, NS2 и NS3 не стимулировали CTL ответ у овец (Lobato, Coupar et al. 1997).

Lobato и Coupar (Lobato, Coupar et al. 1997) разработали векторы экспрессии на основе вируса осповакцины, содержащие различные вставки, соответствующие нуклеотидным последовательностям, кодирующим структурные белки VP2, VP5 и VP7 вируса BTV для исследований как in vivo так и in vitro. Эти экспрессионные векторы были введены кроликам и овцам для оценки иммунного ответа с помощью ELISA и титра нейтрализующих антител, и была проверена эффективность защиты конструктов VP2 и VP5 у овец. Экспрессированные вирусом осповакцины VP2, VP5 и VP2+VP5 проявили защитные свойств, причем наиболее воспроизводимый защитный эффект наблюдался у животных, иммунизированных и VP2 и VP5, однако защита даже с помощью этого конструкта была изменчива и не вполне эффективна. Были предприняты попытки разработать составы рекомбинантных BTV-вакцин, например, в опубликованной патентной заявке США 2007/280960. Другие авторы описали BTV-иммунологические композиции, содержащие различные BTV-антигены, вырабатываемые, например, бакуловирусом (см., например, патенты США №5,833,995 и 5,690,938).

Таким образом, полезно было бы предоставить усовершенствованные иммуногенные композиции и вакцины против BTV и способы изготовления и применения таких композиций, включая композиции, которые предназначаются для разных способов диагностики, анализов и наборов.

В последнее время исследуется возможность использования растений в качестве источников для получения таких терапевтических средств, как вакцины, антитела и биофармацевтические препараты. Однако, получение вакцин, антител, белков и биофармацевтических препаратов из растений далеко от корректного процесса, при этом существуют многочисленные затруднения, с которыми обычно связано получение таких вакцин. Ограничения, связанные с успешным получением растительных вакцин, включают низкий выход биопродукта или экспрессированного антигена (Chargelegue et al., Trends in Plant Science 2001, 6, 495-496), нестабильность белка, несоответствие качества продукта (Schillberg et al., Vaccine 2005, 23, 1764-1769) и недостаточную способность получать вирусоподобные продукты предполагаемого размера и иммуногенности (Arntzen et al., Vaccine 2005, 23, 1753-1756). Как возможные стратегии для решения этих проблем рассматриваются оптимизация кодонов, тщательные подходы к получению и очистке растительных продуктов, использование частей растений, таких как хлоропласта, для увеличения усвоения сырья и усовершенствованный подбор внутриклеточных мишеней (Koprowski, Vaccine 2005, 23, 1757-1763).

Принимая во внимание восприимчивость животных к BTV, способ предотвращения инфицирования BTV и защиты животных имеет существенное значение. Таким образом, существует необходимость в эффективной вакцине против BTV.

Раскрытие изобретения

Предоставляются композиции, содержащие антигенный BTV-полипептид и его фрагменты и варианты. Антигены BTV и их фрагменты и варианты обладают иммуногенными и защитными свойствами. BTV антигены могут быть получены в растении или водоросли.

Антигенные полипептиды и их фрагменты и варианты могут заключаться в состав вакцин и/или фармацевтических композиций. Такие вакцины можно использовать для вакцинирования животного и обеспечения защиты, по меньшей мере, от одного штамма BTV.

Способы изобретения включают способы получения антигенных полипептидов в растении или водоросли. Способы также включают способы применения, включающие введение животному эффективного количества антигенного полипептида или его фрагмента или варианта с целью получения защитного иммуногенного ответа. После получения в растении или водоросли, антигенный полипептид может быть частично или практически очищенным для использования в качестве вакцины.

Краткое описание чертежей

Следующее подробное описание, представленное как пример, не предназначается для ограничения изобретения только до конкретных описанных вариантов осуществления и может быть лучше понято в совокупности с прилагаемыми чертежами, на которых:

Фигура 1 представляет таблицу, суммирующую SEQ ID NO, соответствующие последовательностям ДНК и белков.

Фигура 2 представляет плазмиду pCG102, кодирующую BTV1 VP5 (SEQ ID NO:10), использованную в качестве положительного контроля при скрининге.

Фигура 3 представляет плазмиду pCG100, кодирующую BTV1 VP2 (SEQ ID NO:4), использованную в качестве положительного контроля при скрининге.

Фигура 4 представляет плазмиду pCG101, кодирующую BTV1 VP2-с-тус (SEQ ID NO:6), использованную в качестве положительного контроля при скрининге.

Фигура 5 демонстрирует Вестерн-блот лизатов клеток линии СНО, показывающий, что антитело AHSV VP5 10АЕ12 селективно обнаруживает белок BTV1 VP5 экспрессированный pCG102 (SEQ ID NO:10).

Фигура 6 представляет Вестерн-блот лизатов клеток линии СНО, показывающий, что мышиные анти-с-Myc антитела селективно обнаруживают с-Myc-меченый белок VP2 BTV1 экспрессированный pCG101 (SEQ ID NO:6), но не обнаруживает немеченый белок BTV1 VP2 экспрессированный pCG100 (SEQ ID NO:4).

Фигуры 7а и 7b представляют Вестерн-блоты лизатов клеток линии СНО, которые были трансфицированы указанными конструктами. И L167 и L168 поликлональные BTV1 VP2 антитела селективно обнаруживали белок VP2 (SEQ ID NO:4), экспрессированный в клетках, трансфицированных pCG100.

Фигура 8 показывает выравнивание последовательностей полинуклеотидов, кодирующих BTV VP2, и процент идентичности последовательностей.

Фигура 9 показывает выравнивание последовательностей полинуклеотидов, кодирующих BTV VP5, и процент идентичности последовательностей.

Фигура 10 показывает идентичность и расположение оптимизированных для ряски BTV1 антигенов для 4 экспрессирующих конструкций.

Фигура 11 показывает плазмиду pMerD01, содержащую локализованные в цитоплазме VP2 и VP5, расположенные последовательно.

Фигура 12 представляет плазмиду MerD02, содержащую цитоплазматически локализованный VP2 с оптимизированным 5'UTR и VP5, расположенные последовательно.

Фигура 13 представляет плазмиду MerD03, содержащую только локализующийся в цитоплазме VP2 отдельно.

Фигура 14 представляет плазмиду MerD04, содержащую только локализующийся в цитоплазме VP2 с оптимизированным 5'UTR.

Фигура 15 показывает характерные Вестерн-блоты лизатов из ряски, экспрессирующей различные MerD конструкции, полученные при использовании VP2 антител.

Фигура 16 показывает характерные Вестерн-блоты лизатов из ряски, экспрессирующей MerD01 конструкцию, полученные при использовании VP2 и VP5 антител.

Фигура 17 показывает VP2 Вестерн-блоты лизатов из ряски, экспрессирующей MerD01, MerD02, MerD03 и Mer04.

Фигура 18 представляет Вестерн-блот лизатов из ряски, экспрессирующей MerD01 и MerD02, полученные с использованием VP5 моноклональных антител клона #10АЕ12

Фигура 19 показывает характерное изображение денситометрического анализа VP2 при помощи Agilent 2100 Bioanalyzer.

Фигура 20 показывает средний размер местных реакций в месте инъекции.

Фигура 21 показывает ректальную температуру после первой вакцинации BTV.

Фигура 22 показывает ректальную температуру после второй вакцинации BTV.

Фигура 23 показывает ректальную температуру после контрольного заражения BTV.

Фигура 24 показывает клинические признаки после контрольного заражения BTV.

Фигура 25 показывает титр BTV1 антител при нейтрализации сывороткой.

Фигура 26 показывает средний титр вирусемии, измеренный с помощью qRT-PCR в каждой лечебной группе.

Фигура 27 показывает выравнивание белковой последовательности BTV1 VP2 и процент идентичности последовательностей.

Фигура 28 показывает выравнивание белковых последовательностей семи последовательностей BTV1 VP5 и одной BTV2 VP5 и процент идентичности последовательностей.

Подробное описание изобретения

Предоставляются композиции, содержащие BTV-полипептид, антиген и его фрагменты и варианты, вызывающие иммуногенный ответ у животного. Антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты получают в растении или водорослях. Антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты могут быть включены в состав вакцин или фармацевтических композиций и могут использоваться для того, чтобы вызвать или стимулировать защитный ответ у животного. В одном варианте осуществления полипептидный антиген представляет собой BTV VP2 или BTV VP5 полипептид или его активный фрагмент или вариант.

Показано, что антигенные полипептиды изобретения могут быть полноразмерными полипептидами или их активными фрагментами или вариантами. Под термином "активные фрагменты" или "активные варианты" имеется в виду, что фрагменты или варианты сохраняют антигенную природу полипептида. Таким образом, настоящее изобретение включает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген BTV, вызывающий иммуногенный ответ у животного. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген BTV может быть любым полипептидом, антигеном, эпитопом или иммуногеном BTV, таким как, но не ограничиваясь этим, белок, пептид или его фрагмент или вариант, вызывающий, индуцирующий или стимулирующий ответ у животного, такого как овца, корова или коза.

Настоящее изобретение имеет отношение к вакцинам для овец, коров или коз или композициям, которые могут содержать эффективное количество рекомбинантного BTV-антигена и приемлемый фармацевтически или с точки зрения ветеринарии носитель, эксципиент, адъювант или разбавитель.

В некоторых вариантах осуществления вакцины дополнительно содержат адъюванты, например, эмульсии масло-в-воде (O/W), описанные в патенте США 7371395.

В следующих вариантах осуществления адъюванты включают EMULSIGEN®, гидроксид алюминия и сапонин, CpG или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления реакция у животного представляет собой защитный иммунный ответ.

Под термином "животное" имеются в виду млекопитающие, птицы и т.п. Животное или хозяин включает млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из представителей семейств лошадиных (например, лошади), псовых (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки и другие виды кошачьих, включая гепардов и рысей), овечьих (например, овца), бычьих (например, рогатый скот), свиньих (например, свиньи), козлиных (например, козы), птичьих (например, курица, утка, гусь, индюк, перепел, фазан, попугай, зяблик, ястреб, ворон, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяны, долгопяты, обезьяны, гиббоны, человекообразные обезьяны) и рыб. Термин "животное" также включает отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональную и зародышевую стадии.

Термин "растение" при использовании в описании включает и двудольные и однодольные растения. Двудольные растения включают, но не ограничиваются этим, "растения из семейства бобовых, такие как горох, люцерна и соя, морковь, сельдерей, помидор, картофель, табак, перец, масличный рапс, свекла, капуста, цветная капуста, брокколи, салат-латук, арахис и т.п. Однодольные растения включают, но не ограничиваются этим, зерновые культуры, такие как пшеница, ячмень, сорго и просо, рожь, тритикале, кукуруза, рис и овес, сахарный тростник, ряску, злаковые травы и т.п. Термин "растение" также относится к нецветковым растениям, включая, но не ограничиваясь этим, папоротники, хвощи, плауны, лишайники, печеночники, антоцеровые, водоросли. Термин "водоросли" и "водоросль" при использовании в описании включает любой штамм водорослей, способный продуцировать полипептид или его фрагмент или вариант.Водоросли могут включать красные, коричневые и зеленые водоросли, гаметофиты и тому подобное. Водоросли могут быть микроводорослями. Микроводоросли могут быть Thraustochytriaceae, например, Schizochytrium, Thraustochytrium, Labyrinthuloides и Japonochytrium.

В случае, когда не объясняется иначе, все технические и научные термины, использованные в описании, имеют то же самое значение, которое обычно понятно среднему специалисту в области техники, к которой относится это раскрытие. Термины в единственном числе включают объекты во множественном числе, если контекст явно не диктует иначе. Подобным образом, слово "или" предназначается для включения "и", если контекст явно не указывает иначе.

Следует отметить, что в этом раскрытии и в частности в пунктах формулы изобретения и/или параграфах, такие термины как "содержит", "содержащий" и тому подобные могут иметь значение, придаваемое им в законе США о патентах; например, они могут означать "включает", "включенный", "включающий" и тому подобное; и что термины, такие как "состоящий в основном из" и "состоит в основном из" имеют значение, данное им в законе США о патентах, например, они допускают включение элементов, которые непосредственно в них не указаны, но исключают элементы, которые найдены в известном уровне техники или затрагивают основную или новую характеристику изобретения.

Антигенные полипептиды изобретения способны защищать от BTV. То есть они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Под "антигеном" или "иммуногеном" имеется в виду субстанция (вещество), которая вызывает специфическую иммунную реакцию у животного-хозяина. Антиген может являться целым организмом, убитым, ослабленным или живым; субъединицей или частью организма; рекомбинантным вектором, содержащим вставку с иммуногенными свойствами; частью или фрагментом ДНК, способным вызвать иммунный ответ после презентирования животному-хозяину; полипептидом, эпитопом, гаптеном или любой их комбинацией. Альтернативно, иммуноген или антиген может содержать токсин или антитоксин.

Термин "иммуногенный белок, полипептид или пептид" при использовании в описании включает полипептиды, являющиеся иммунологически активными в том смысле, что сразу после введения хозяину они способны вызвать иммунный ответ гуморального или клеточного типа, направленный против белка. Предпочтительно белковый фрагмент является таким, что он в основном обладает той же самой иммунологической активностью, как полный белок. Таким образом, белковый фрагмент согласно изобретению содержит или состоит в основном из или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. "Иммуногенный" белок или полипептид при использовании в описании включает полную последовательность белка, его аналоги или его иммуногенные фрагменты. Под "иммуногенным фрагментом" имеется в виду фрагмент белка, включающий один или более эпитопов, и таким образом вызывающий иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты можно установить с помощью ряда методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены с помощью, например, одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых подложках, данные пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и проведения реакции пептидов с антителами в то время как пептиды являются все еще прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США №4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Подобным образом, конформационные эпитопы легко установить путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеноструктурного анализа и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше.

Как было сказано выше, изобретение включает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин "иммуногенный белок, полипептид или пептид" дополнительно охватывает последовательности с делециями, вставками и заменами, при условии, что полипептид действует и вызывает иммунологический ответ, как определено в описании. Термин "консервативное изменение" обозначает замену остатка аминокислоты другим биологически подобным остатком, или такую замену нуклеотида в нуклеиновокислотной последовательности, что кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или заменяется на биологически сходный остаток. В этом отношении, особенно предпочтительными заменами являются в большинстве "случаев консервативные по природе, т.е. те замены, которые происходят внутри семейства аминокислот. Например, аминокислоты делятся на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда относят к ароматическим аминокислотам. Примеры консервативных изменений включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин и метионин на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и тому подобное; или сходную консервативную замену аминокислоты структурно родственной аминокислотой, не оказывающей большого влияния на биологическую активность. Белки, имеющие в основном ту же самую аминокислотную последовательность, как исходная молекула, однако имеющие незначительные аминокислотные замены, не влияющие существенно на иммуногенность белка попадают, следовательно, под определение исходного полипептида. Сюда включаются все полипептиды, полученные в результате этих модификаций. Термин "консервативное изменение" также включает использование замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты, при условии, что антитела индуцированные к замещенному полипептиду, также вступают в иммунореакцию с незамещенным полипептидом.

Термин "эпитоп" относится к месту (сайту) на антигене или гаптене, на который реагируют специфические В-клетки и/или Т-клетки. Этот термин также используется взаимозаменяемым образом с термином "антигенная детерминанта" или "сайт антигенной детерминанты". Антитела, распознающие один и тот же эпитоп, могут быть установлены с помощью простого иммуноанализа, показывающего способность одного антитела препятствовать связыванию другого антитела с антигеном-мишенью.

"Иммунологический ответ" на композицию или вакцину - это развитие у хозяина клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на интересующую композицию или вакцину. В большинстве случаев "иммунологический ответ" включает, но не ограничивается этим, один или более из следующих эффектов: выработку антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в интересующую композицию или вакцину. Предпочтительно, что хозяин будет демонстрировать или терапевтический или защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет увеличиваться и/или снижаться клиническая тяжесть болезни. Такую защиту можно обнаружить по уменьшению или отсутствию симптомов, обычно наблюдаемых у инфицированного хозяина, более быстрому времени восстановления и/или более низкому титру вируса у инфицированного хозяина.

Синтетические антигены также включаются в определение, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или полученные синтетическим путем антигены. См., например, Bergmaim et al., 1993; Bergmaim et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения в большинстве случаев будут включать, по меньшей мере, около 3 аминокислот, по меньшей мере, около 5 аминокислот, по меньшей мере, около 10-15 аминокислот или около 15-25 аминокислот или более аминокислот молекулы. Не существует критического верхнего предела для длины фрагмента, который может содержать почти полную длину белковой последовательности, или даже гибридный белок, содержащий по меньшей мере один эпитоп белка.

Соответственно, минимальная структура полинуклеотида, экспрессирующего эпитоп, - это структура, которая содержит или состоит в основном из или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту BTV полипептида. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент BTV полипептида, может содержать или состоять в основном из или состоять минимум из 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 или по меньшей мере 57, 87 или 150 последовательных или соседних нуклеотидов последовательности, кодирующей полипептид. При использовании изобретения на практике можно применять такие методы определения эпитопов, как создание перекрывающихся пептидных библиотек (Hemmer et al., 1998), систему Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999;

PCT/US2004/022605).

Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" относится к РНК или ДНК, являющейся линейной или разветвленной, одноцепочечной или двухцепочечной, или ее гибриду. Термин также включает гибриды РНК/ДНК. Ниже перечислены неограничивающие примеры полинуклеотид ов: ген или генный фрагмент, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК любой последовательности, изолированная РНК любой последовательности, нуклеиновокислотные пробы и праймеры. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибоза и тиолат, и ветви нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, путем конъюгирования с меченым компонентом. Другими типами модификаций, включенными в это определение, являются кэпы, замещение одного или более природных нуклеотидов аналогом и введение его посредством присоединения полинуклеотида к белкам, металлические ионы, меченые компоненты, другие полинуклеотиды или твердая подложка. Полинуклеотиды могут быть получены путем химического синтеза или получены от микроорганизма.

Термин "ген" используется широко для упоминания любого сегмента полинуклеотида, имеющего отношение к биологической функции. Таким образом, гены включают интроны и экзоны, как и в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности как в кДНК и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, ген также относится к нуклеиновокислотному фрагменту, экспрессирующему мРНК или функциональную РНК, или кодирующему специфический белок, и включающему регуляторные последовательности.

Кроме того, изобретение включает комплементарную цепочку к полинуклеотиду, кодирующему BTV-антиген, эпитоп или иммуноген. Комплементарная цепочка может быть полимерной и любой длины, а также может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.

Термины "белок", "пептид", "полипептид" и "полипептидный фрагмент" используются в описании взаимозаменяемо для упоминания полимеров любой длины, состоящих из аминокислотных остатков. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот, причем он может прерываться химическими группами (фрагментами), отличными от аминокислот. Эти термины также включают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или посредством вмешательства; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или путем любой другой манипуляции или модификации, такой как соединение с меченым или биоактивным компонентом.

"Изолированный" биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который практически отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, где компонент встречается в естественных условиях, например, других хромосомных и экстра-хромосомных ДНК и РНК, белков и органелл. "Изолированные" нуклеиновые кислоты и белки включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных методов. Термин также включает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантных методов, а также химического синтеза.

Использование в описании термина "очищенный" не подразумевает абсолютной чистоты; скорее термин используется как относительный. Таким образом, например, очищенный полипептидный препарат - это препарат, более богатый полипетидом по сравнению с его содержанием в естественной среде. То есть полипептид является отделенным от клеточных компонентов. Под термином "практически очищенный" подразумевается, что полипептид представляет собой несколько вариантов осуществления, когда удалено по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 98%, или более клеточных компонентов или материалов. Подобным образом, полипептид может быть частично очищенным. Под термином "частично очищенный" имеется в виду, что удалено менее, чем 60% клеточных компонентов или материалов. То же самое применимо к полинуклеотидам. Раскрытые в описании полипептиды могут быть очищены с помощью любых известных в данной области техники способов.

Как было указано выше, антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты представляют собой антигенные полипептиды BTV, которые получены в растении или водоросли. Фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых ими, также рассматриваются настоящим изобретением. Под "фрагментом" имеется в виду часть полинуклеотида или часть антигенной аминокислотной последовательности, кодированной им. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, сохраняющие биологическую активность природного белка и, следовательно, обладают иммуногенной активностью, как отмечается в других местах в описании. Фрагменты полипептидной последовательности сохраняют способность вызывать защитный иммунный ответ у животного.

"Варианты" означают в значительной степени похожие последовательности. Относительно полинуклеотидов, вариант содержит выпадение (делецию) и/или вставку одного или более нуклеотидов в одном или более участках внутри природного полинуклеотида и/или замену одного или более нуклеотидов на одном или более участках в природном полинуклеотиде. При использовании в описании "природный" полинуклеотид или полипептид включает существующую в природе нукдеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно. Варианты отдельного, полинуклеотида изобретения (т.е. исходного полинуклеотида) также можно оценить путем сравнения процента идентичности последовательности между полипептидом, который кодируется вариантом полинуклеотида, и полипептидом, кодируемым исходным полинуклеотидом. "Вариант" белка означает белок, полученный из природного белка при удалении или добавлении одной или более аминокислот в одном или более участках в природном белке и/или заменой одной или более аминокислот на одном или более участках природного белка. Варианты белков, рассматриваемые настоящим изобретением, являются биологически активными, то есть способными вызвать иммунный ответ.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет BTV-полипептиды, полученные от животных семейств овечьих, бычьих или козлиных. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25, и его вариант или фрагмент.

Боле того, гомологи BTV-полипептидов, полученных от животных семейств овечьих, бычьих или козлиных, рассматриваются в рамках настоящего изобретения. При использовании в описании термин "гомологи" включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин "аналоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, имеющим одинаковую или сходную функцию, но которые обнаружены отдельно в неродственных организмах. Термин "ортологи" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от разных видов, но которые развились от общего предкового гена при видообразовании. Как правило, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин "паралоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, полученным в результате удвоения в геноме. Обычно паралоги имеют разные функции, однако эти функции могут быть родственными. Аналоги, ортологи и паралоги BTV-полипептида дикого типа могут отличаться от BTV-полипептида дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотных последовательностях или и тем и другим. В частности, гомологи изобретения в большинстве случаев будут демонстрировать, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности со всеми или частью полипептидными или полинуклеотидными последовательностями BTV дикого типа, и будут демонстрировать сходную функцию. Варианты включают аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют внутри природной популяции (например, виды или разновидности вирусов). Такие природные аллельные изменения могут приводить к 1-5% изменению в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть установлены с помощью секвенирования (установления последовательности) интересующей нуклеиновокислотной последовательности у нескольких различных видов, которое может быть легко выполнено с помощью гибридизационных зондов для установления одинаковых генетических локусов в этих видах. Все и любые подобные нуклеиновокислотные изменения и полученные в результате аминокислотные полиморфизмы или изменения, являющиеся результатом природного аллельного изменения и неизменяющие функциональную активность представляющего интерес гена, включаются в рамки изобретения.

При использовании в описании термин "производное" или "вариант" относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который имеет одно или более консервативных аминокислотных изменений или другие незначительные изменения, например, (1) соответствующий полипептид имеет в основном эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитело, индуцированное к полипептиду, является иммунореактивным в отношении полипептида дикого типа. Эти варианты или производные включают полипептиды, имеющие незначительные модификации первичных аминокислотных последовательностей BTV-полипептида, что может давать в результате пептиды, обладающие по существу равноценной активностью по сравнению с соответствующим немодифицированным полипептидом. Такие модификации могут быть преднамеренными, как например, полученные с помощью сайт-направленного м