Терапевтическая доставка и мониторинг с использованием представляющего интерес гена белка, слитого с репортером, и оптического отображения

Терапевтическая доставка и мониторинг с использованием представляющего интерес гена белка, слитого с репортером, и оптического отображения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке при контактировании указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена.

Таким образом, изобретение относится к способу мониторинга увеличения экспрессии представляющего интерес гена в клетке при контактировании указанной клетки с деметилирующим лекарственным средством. Изобретение также относится к мониторингу уменьшения экспрессии представляющего интерес гена в клетке при контактировании указанной клетки с РНКи. Указанные способы могут быть реализованы in vivo или вне организма человека или животного.

Уровень техники

Одной из основных задач современной медицины является разработка терапевтической системы, которая способна оказывать селективное влияние на экспрессию гена, в отношении которого имеется подозрение или относительно которого известно, что его регуляция подверглась изменениям. В зависимости от пораженного гена(генов) это может проявляться в виде серьезных заболеваний, таких как, например, рак. Хотя в этой области было проведено немало исследований, все еще имеется потребность в улучшении результатов, полученных к настоящему времени, и объединении этих результатов, например, с системой, благодаря которой можно с легкостью осуществлять мониторинг терапевтического эффекта и/или доставки терапевтического соединения.

В целом, понятие генной экспрессии можно кратко охарактеризовать в виде процесса, содержащего несколько этапов: на уровне ДНК происходит кодирование определенной последовательности для белка или РНК, обе из которых могут проявлять определенную функцию. На первом этапе ДНК транскрибируется в соответствующую РНК. Этот этап находится под жестким управлением, включающим так называемые промоторные области, зачастую расположенные на 5'-концах в непосредственной близости от кодирующей последовательности, а также регуляторные элементы ДНК и факторы транскрипции, расположенные выше и ниже кодирующей последовательности и оказывающие стимулирующее или подавляющее влияние на транскрипцию. В случае если белок представляет собой конечный продукт экспрессии гена, транскрибируемая РНК называется мРНК. На втором этапе эта мРНК транслируется в белок, и затем, на следующем этапе, указанный белок необязательно подвергается дальнейшей пост-трансляционной модификации. В случае если белок представляет собой конечный продукт, транскрибируемая РНК может быть перестроена и подвергнута процессингу, а также может быть включена в комплексы, содержащие, например, белки. Таким образом, на уровне ДНК можно оказывать влияние на экспрессию гена, например, используя факторы направленного воздействия, оказывающие влияние на первый этап, а именно, транскрипцию. Оказывать воздействие также можно и на втором этапе: в случае если конечным продуктом является белок, можно заблокировать трансляцию мРНК, а в случае если конечным продуктом является РНК, можно заблокировать процессинг и т.д. Если способ, в конечном счете, приводит к деградации транскрибируемой РНК, то невозможно будет получить никакого конечного продукта, и таким образом второй этап будет заблокирован.

В случае, если заболевание вызвано подавлением экспрессии (даун-регуляция, downregulation) гена или даже его полным выключением (сайлесинг), терапевтический эффект должен представлять собой усиление экспрессии (апрегуляция, upregulation) указанного эндогенного гена до нормального уровня. Для некоторых типов рака, например, известно, что выключены важные гены-супрессоры опухоли, и таким образом они не способны проявлять соответствующую им функцию подавления опухоли. Было установлено, что ДНК-метилирование является главной причиной подавления экспрессии/выключения гена. Указанное метилирование часто происходит в промоторных областях соответствующих генов. В этих случаях экспрессия гена может быть восстановлена путем удаления из ДНК метильной группы. Подавление экспрессии/выключение гена также может происходить в результате активации фактора транскрипции, который в отношении этого гена действует в качестве негативного фактора транскрипции, таким образом, блокируя его экспрессию. В этих случаях терапия должна быть направлена на подавление экспрессии гена, кодирующего фактор транскрипции, снижая таким образом уровень фактора транскрипции.

Если заболевание вызвано усилением экспрессии гена, терапевтический эффект должен представлять собой соответственно подавление экспрессии указанного эндогенного гена до нормального уровня. Известно, что практически во всех типах раковых образований наблюдается усиленная экспрессия генов, которые обычно называются онкогенами или протоонкогенами. При этом, протоонкогены, вероятно, не имеют непосредственного влияния, например, на пролиферацию клетки, но опосредованно вызывают, например, усиленную экспрессию других генов. Для подавления экспрессии генов можно использовать способы с применением РНКи (РНКи-способ). В отличие от деметилирующих лекарственных средств, которые оказывают непосредственное воздействие на "уровне ДНК", действие РНКи-способов обычно происходит на втором этапе экспрессии генов, а именно, на этапе трансляции белка или на этапе процессинга соответствующей РНК. В конечном счете, эти способы приводят к деградации транскрибируемой РНК. Таким образом, весь процесс экспрессии гена блокируется РНКи. Это также может называться "выключением" гена с помощью РНКи. С механической точки зрения, искусственно введенная "РНК" (например транскрибированная из вектора, введенного в виде РНК-дуплекса и т.д.) подвергается процессингу, и одна нить встраивается в комплекс, который специфическим образом распознает в последовательности транскрибируемую РНК. Таким образом, последовательность введенной РНК определяет целевой "предназначенный для выключения ген". После гибридизации, узнавания и формирования комплекса целевая РНК разрушается под действием дальнейших механизмов.

Существующие способы мониторинга эффекта терапевтических систем, влияющих на экспрессию генов, основаны в основном на сравнении состояния заболевания, например опухоли, до и после применения терапевтической системы. Таким образом, для определения размера опухоли до и после лечения можно использовать, например, рентгеновские или ультразвуковые способы. Однако с помощью таких систем невозможно ни осуществление мониторинга прямого влияния указанного лечения на экспрессию генов, ни проведение анализа того, является ли вообще соответствующее соединение локализованным в пораженной ткани. Для определения результатов лечения с помощью других способов требуются образцы ткани. Таким образом, необходима биопсия или даже хирургическое вмешательство, которые часто связаны с дополнительными проблемами, такими как инфекции. Более того, возможен только анализ по факту.

Как следствие, существует потребность в создании или улучшении способов лечения, влияющих на экспрессию генов, и способов, которые позволяют осуществлять неинвазивный мониторинг применения и влияния этих способов лечения на экспрессию генов.

Объекты и сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способов для неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке при контактировании указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена.

Эти и другие цели настоящего изобретения, которые станут очевидными из нижеследующего описания, решаются объектом изобретения, охарактеризованным в независимых пунктах формулы изобретения. Зависимые пункты формулы изобретения относятся к некоторым предпочтительным вариантам осуществления изобретения.

Согласно одному из аспектов изобретения предоставляется способ неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке, включающий по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в указанную клетку;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

с) контактирования указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

е) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b) с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения изменения экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного указанным соединением, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

В предпочтительном варианте осуществления, относящемся к описанному выше способу, настоящее изобретение описывает способ неинвазивного мониторинга in vivo экспрессии представляющего интерес гена в клетке, включающего по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) метилированную промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в указанную клетку;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

с) контактирования указанной клетки с деметилирующим лекарственным средством;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

е) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b), с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения усиления экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного деметилирующим лекарственным средством, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение описывает способ неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена, включающий по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) метилированную промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в клетку, которая находится вне организма человека или животного;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

с) контактирования указанной клетка с деметилирующим лекарственным средством;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

е) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b), с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения усиления экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного деметилирующим лекарственным средством, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

Кодирующая последовательность, содержащая последовательность, кодирующую полипептид представляющего интерес гена, слитая с последовательностью, кодирующей флуоресцентный полипептид-репортер, содержит один старт-кодон на 5'-конце и один стоп-кодон на 3'-конце. Термин "один старт-кодон" в настоящем описании, не исключает наличия других внутренних кодонов ATG. Однако эти последние кодоны не должны инициировать трансляцию.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения представляющий интерес ген в этом аспекте изобретения представляет собой ген-супрессор опухоли или ген, в отношении которого имеется подозрение, что его выключение является причиной возникновения заболевания.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение описывает способ неинвазивного мониторинга уменьшения экспрессии представляющего интерес гена в клетке in vivo, содержащий по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую нефункциональный полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в указанную клетку;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

с) контактирования указанной клетки с РНКи, структура которой соответствует указанному представляющему интерес гену;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

е) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b), с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения уменьшения экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного РНКи, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

Кодирующая последовательность, содержащая последовательность, кодирующую нефункциональный полипептид представляющего интерес гена, слитую с последовательностью, кодирующей флуоресцентный полипептид-репортер, содержит один старт-кодон на 5'-конце и один стоп-кодон на 3'-конце. Термин "один старт-кодон" в настоящем описании, не исключает наличия других внутренних кодонов ATG. Однако эти последние кодоны не должны инициировать трансляцию.

В предпочтительном варианте осуществления этого аспекта изобретения последовательность представляющего интерес гена, кодирующая нефункциональный полипептид представляющего интерес гена, содержит либо часть последовательности, представляющего интерес гена, либо полную последовательность представляющего интерес гена, содержащую по меньшей мере одну вставку, по меньшей мере одну делецию, по меньшей мере одну замену нуклеотида или их комбинации. Таким образом получают нефункциональный полипептид представляющего интерес гена. Однако область представляющего интерес гена не содержит стоп-кодоны.

Кроме того, в более предпочтительном варианте осуществления этого аспекта настоящее изобретение раскрывает молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в общих чертах выше в двух предыдущих параграфах, причем представляющий интерес ген представляет собой онкоген, протоонкоген или ген, в отношении которого имеется подозрение, что усиление его экспрессии является причиной заболевания.

В другом аспекте настоящего изобретения раскрыт способ, в котором выполняют неинвазивный мониторинг уменьшения экспрессии представляющего интерес гена в клетке, находящейся вне организма человека или животного, включающий по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в клетку, которая находится вне организма животного или человека;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

c) контактирования указанной клетки с РНКи, структура которой соответствует указанному представляющему интерес гену;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

e) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b), с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения уменьшения экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного РНКи, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

В вариантах осуществления способов in vivo и in vitro, как описано выше в общих чертах, указанная молекула нуклеиновой кислоты и/или указанная РНКи может вводиться в указанную клетку методом трансфекции с помощью сонопорации, локальной инъекции или липосомных капсул, несущих антитела к антигенам клетки-хозяина для правильного нацеливания, идентификации и локализации, или их комбинации.

Другой аспект изобретения относится к применению раскрытых выше способов.

Указанные способы могут применяться in vivo или вне организма животного или человека. В одном из вариантов осуществления указанный способ используется для мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке в течение времени контактирования указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена, и таким образом указанный способ используется для мониторинга эффекта указанного соединения.

В другом варианте осуществления раскрытый выше способ может использоваться для доставки соединения, влияющего на экспрессию представляющего интерес гена в клетке, мониторинга доставки указанного соединения, и в то же время для мониторинга его влияния на экспрессию указанного представляющего интерес гена, индуцированного указанным соединением. И в этом случае он может применяться in vivo, а также в виде способа, выполняемого в клетке, находящейся вне организма человека или животного.

В другом предпочтительном варианте осуществления описанный выше способ для случая применения in vivo или вне организма человека или животного используется для подбора дозы соединения, влияющего на экспрессию представляющего интерес гена с целью получения дальнейшего изменения экспрессии указанного представляющего интерес гена.

В другом аспекте изобретения способ, относящийся к применению деметилирующего лекарственного средства, используется для исследования в одном из вариантов осуществления различных деметилирующих лекарственных средств для идентификации самого эффективного деметилирующего лекарственного средства, взятого отдельно или в комбинации.

Этот аспект относится к другому предпочтительному варианту осуществления способов, в которых используется РНКи. Таким образом, указанный способ используется для исследования различных РНКи, структура которых соответствует одному представляющему интерес гену, с целью выявления самой эффективной РНКи, взятой отдельно или в комбинации.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 схематично изображены приведенные в качестве примера этапы возможного применения настоящего изобретения, а именно, терапии с использованием РНКи и ее мониторинга в ткани рака молочной железы.

Этапы подробно описаны в разделе “Примеры” настоящей заявки.

Подробное описание изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили возможность неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке. Эта система может использоваться при контактировании клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена.

Для подробного описания приведенных в качестве примера вариантов осуществления настоящего изобретения даны определения, важные для понимания настоящее изобретение.

В настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, форма единственного числа также включает соответствующее ей множественное число, если контекстом не определено иное.

В контексте настоящего изобретения термины "примерно" и "приблизительно" означают диапазон точности, который, как это ясно специалисту в данной области, все еще гарантирует получение технического эффекта рассматриваемого признака. Этот термин обычно указывает на отклонение от указанного числового значения на величину ±10% и предпочтительно ±5%.

Следует иметь в виду, что термин "содержащий" не является ограничивающим. В целях настоящего изобретения считается, что термин "состоящий из" является предпочтительным вариантом по отношению к термину “содержащий”. Если в дальнейшем группа определена как содержащая по меньшей мере определенное число вариантов осуществления, это также означает, что охвачена группа, которая предпочтительно состоит только из этих вариантов осуществления.

Как было указано выше, настоящее изобретение относится к способу неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке при контактировании указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу неинвазивного мониторинга экспрессии представляющего интерес гена в клетке, содержащему по меньшей мере этапы:

a) введения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей:

aa) промоторную последовательность;

bb) функционально связанную с ней последовательность, кодирующую полипептид указанного представляющего интерес гена;

cc) функционально слитую с ней последовательность, кодирующую флуоресцентный полипептид-репортер;

в указанную клетку;

b) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения;

с) контактирования указанной клетки с соединением, влияющим на экспрессию указанного представляющего интерес гена;

d) детекции флуоресцентного полипептида-репортера в указанной клетке неинвазивным способом формирования оптического изображения на этапе c);

е) сравнения уровня флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе b), с уровнем флуоресцентного полипептида-репортера, детектированного на этапе d);

f) определения изменения экспрессии указанного представляющего интерес гена, индуцированного указанным соединением, на основании сравнения, выполненного на этапе e).

В контексте настоящего изобретения, термин "неинвазивный" мониторинг означает, что на этапах детекции b) и d) способа по настоящему изобретению отсутствует необходимость в прямом физическом контактировании с клеткой и/или наблюдаемой тканью пациента для мониторинга экспрессии представляющего интерес гена. Таким образом, во время проведения этапов детекции нет необходимости ни в хирургическом вмешательстве, ни в биопсии, ни в каком другом способе, включающем контактирование с клеткой (таком как пэтч-клемп (метод фиксации потенциала) в исследовании in vitro).

"Мониторинг" в общем значении относится к процессу определения параметра и отслеживания этого параметра в течение некоторого времени.

Термин "экспрессия представляющего интерес гена" в настоящем описании содержит по меньшей мере два этапа. Таким образом, транскрипция представляющего интерес гена с образованием соответствующей РНК представляет собой один из этапов генной экспрессии. В случае кодирования белка этим геном указанная РНК называется мРНК. В дальнейшем РНК может быть подвергнута процессингу (например, сплайсингу) и, на втором этапе, мРНК транслируется в белок. Белки, таким образом, могут быть конечными продуктами генной экспрессии. Количество белка, как конечного продукта, может коррелировать с уровнем генной экспрессии. Однако молекулы РНК также могут быть конечными продуктами генной экспрессии. Указанные РНК также могут подвергаться процессингу и модификации на втором этапе.

Термин "соединение, влияющее на экспрессию гена" в настоящем описании, содержит любое соединение, имеющее положительное или отрицательное воздействие на экспрессию эндогенного гена.

Такое соединение может действовать на уровне ДНК. Это означает, что указанное соединение может влиять, например, на состояние метилирования ДНК или приводить к структурным перестройкам ДНК, например, из закрытой в открытую конформацию, не влияя на последовательность ДНК. Поскольку ДНК-метилирование (особенно в промоторной области), как известно, приводит к выключению соответствующего гена, соединения, действующие как деметилирующие лекарственные средства, как известно, усиливают экспрессию генов в результате удаления из ДНК метильных групп. Гистондеацетилазы (HDAC) удаляют ацетильные группы из ДНК, что приводит к подавлению гена. Таким образом, соединения, ингибирующие HDAC, также могут оказывать положительное влияние на генную экспрессию. Эти лекарственные средства, обычно называемые HDAC-ингибиторы, также упоминаются ниже. Однако в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения охвачены соединения, оказывающие положительное влияние на генную экспрессию.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения могут использоваться соединения, которые оказывают воздействие на втором этапе генной экспрессии, а именно, на транскрибируемую РНК. В случае деградации указанной РНК на генную экспрессию оказывается негативное влияние. В этом варианте осуществления изобретения, например, для подавления этапа трансляции могут использоваться РНКи. Такие РНКи включают миРНК (малые интерферирующие РНК, siRNA), РНК-шпильку (shRNA), микроРНК (miRNA) и т.д., как более подробно описано ниже.

"Контактирование с клеткой" в настоящем описании, включает любой способ доставки соединения, известный специалисту в данной области, при котором это соединение может оказывать влияние на клетку. Это может быть сделано in vivo, например, с помощью внутривенной инъекции, топического нанесения, ингаляции и т.д. Для систем культивирования клеток соединение, такое как деметилирующее лекарственное средство, может быть просто добавлено в среду, используемую для культивирования клеток. Однако для контактирования соединения с клеткой также могут использоваться способы трансфекции, как в общих чертах описано ниже, и на следующем этапе указанное соединение может быть введено в указанную клетку.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте настоящего изобретения относится к ДНК, РНК или их производным. Предпочтительно оно относится к двухцепочечной молекуле ДНК. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть кольцевыми или линейными в зависимости от механизма, который используется для введения в клетку указанной молекулы нуклеиновой кислоты.

Термин "введение в клетку" в контексте настоящего изобретения определяет, какую молекулу нуклеиновой кислоты, например ДНК или РНК, вводят в соответствующую клетку любым способом, известным специалисту в данной области. Кроме того, "введение" подразумевает, что указанная молекула нуклеиновой кислоты присутствует в клетке таким образом, что кодирование последовательностей, имеющихся в указанной молекуле нуклеиновой кислоты, может происходить в зависимости от того, как происходит регулирование этих областей. Наконец, могут использоваться такие методы, как методы трансфекции, как более подробно описано ниже.

В контексте настоящего изобретения термин "кодирующая область" или "кодирующая последовательность" охватывает последовательность ДНК, которая начинается на 5'-конце старт-кодоном, т.е. ATG. Этот триплет кодирует первую аминокислоту, метионин, соответствующего белка при инициации трансляции мРНКа. Следовательно, кодирующая область заканчивается на 3'-конце стоп-кодоном, например TAG, для завершения трансляции белка. Следует отметить, что для настоящего изобретения нигде в пределах кодирующей последовательности не присутствуют никакие стоп-кодоны, за исключением упомянутого выше стоп-кодона на 3'-конце. Таким образом, вся кодирующая последовательность транскрибируется в одну соответствующую мРНК. Трансляция этой мРНКа дает в результате один белок, который может состоять по меньшей мере из двух различных доменов/полипептидов/частей. Однако, как более подробно описано ниже, указанные полипептиды не обязательно должны быть функциональными; однако для всех кодирующих последовательностей в пределах указанной кодирующей последовательности могут находиться по меньшей мере две последовательности, кодирующие по меньшей мере два полипептида.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанная кодирующая последовательность молекулы нуклеиновой кислоты содержит один старт-кодон на 5'-конце и один стоп-кодон на 3'-конце. Термин “один старт-кодон” в настоящем описании, означает, что последовательность может содержать дополнительные внутренние кодоны ATG, которые, однако, не могут использоваться для инициации трансляции.

Термины "последовательность представляющего интерес гена", "область представляющего интерес гена" и "последовательность, кодирующая полипептид указанного представляющего интерес гена" относятся к ДНК-последовательности представляющего интерес гена, предназначенного для мониторинга с помощью способа по настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения указанным термином предпочтительно охвачены гены, которые транслируются в белки и относительно которых имеется подозрение, что нарушение их экспрессии является причиной определенных заболеваний. Более подробно об этом написано ниже. Таким образом, такие последовательности предпочтительно содержат только кодирующую область гена, т.е. только экзоны, и не содержат никаких интронов. Однако в некоторых вариантах осуществления также могут использоваться интронные области представляющего интерес гена.

Ниже приводится более подробное пояснение термина "полипептид-репортер", а также термина "репортер". Этот параграф относится ко всем вариантам осуществления настоящего изобретения, т.е. ко всем способам, более подробно описанным ниже, а также ко всем молекулам нуклеиновой кислоты, которые охвачены настоящим изобретением. Следует отметить, что последовательность, кодирующая полипептид-репортер, всегда находится внутри рамки считывания с одной ATG на 5'-конце кодирующей последовательности так, что экспрессия соответствующего полипептида всегда выполняется правильно, т.е. продуцируется функциональный полипептид/белок. Кроме того, во всех вариантах осуществления настоящего изобретения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды-репортера, кодируют флуоресцентные полипептиды-репортеры. Указанный флуоресцентный полипептид-репортер может быть выбран из синего, зеленого, голубого, красного или инфракрасного флуоресцентного белка. В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность репортера кодирует зеленый флуоресцентный белок.

Термин "функционально слитый" в настоящем изобретении, определяет, что по меньшей мере две области ДНК (например последовательность, кодирующая полипептид представляющего интерес гена, а также последовательность, кодирующая полипептид-репортер) связаны друг с другом. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов изобретения они могут формировать одну кодирующую последовательность для одного продукта экспрессии, т.е. одного белка, который состоит по меньшей мере из двух различных доменов/полипептидов. Таким образом, как упоминалось выше, существует только одна открытая рамка считывания, кодирующая соответствующий белок, причем для получения функционального экспрессируемого полипептида-репортера последовательность, кодирующая полипептид-репортер, всегда находится внутри указанной открытой рамкой считывания. Для кодирования белка, который получают из полипептида, представляющего интерес гена за которым следует флуоресцентный полипептид-репортер, предпочтительным является случай, когда последовательность представляющего интерес гена на 5'-конце слита с последовательностью репортера.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения кодирующие области таких молекул нуклеиновых кислот могут дополнительно содержать спейсерную область, кодирующую полипептидный спейсер, находящийся между слитыми последовательностями представляющего интерес гена и репортера. В этом случае для получения функционального экспрессируемого спейсерного полипептида спейсерная область также всегда находится внутри указанной открытой рамки считывания.

Термин "функционально связанный" означает, что экспрессия кодирующей области, как определено выше, механически управляется другими областями, такими как промоторы или энхансеры. Эти области обычно представляют собой другую область ДНК, также присутствующую в молекуле нуклеиновой кислоты. Такие функционально связанные области могут находиться в любом месте молекулы нуклеиновой кислоты; однако предпочтительно они присутствуют в регуляторных областях, таких как промоторы на 5'-конце кодирующей последовательности.

В контексте управления экспрессией кодирующей последовательности термин "промоторная последовательность" или просто "промотор" относится к определенной ДНК-последовательности, которая влияет на экспрессию генов. Таким образом, обычная промоторная последовательность состоит из определенной последовательности оснований определенной длины, узнаваемой определенными клеточными факторами. Часто, эти факторы связаны с такими консервативными последовательностями и действуют как положительные или отрицательные регуляторы генной экспрессии и, следовательно, обычно называются "факторами транскрипции". Специалисту в данной области техники известны многие промоторные последовательности, а в искусственных молекулах нуклеиновой кислоты возможна даже комбинация различных промоторных последовательностей.

В зависимости от способа по настоящему изобретению могут использоваться различные промоторы. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению может содержать промоторную последовательность, где указанная промоторная последовательность представляет собой человеческий промотор, идентифицируемый по меньшей мере одним человеческим фактором транскрипции, индуцирующим экспрессию указанной кодирующей последовательности. Кроме того, указанный человеческий промотор может быть сильным, конституитивно активным промотором. В других вариантах осуществления указанный человеческий промотор может быть сильным индуцируемым, например тканеспецифическим, промотором. В некоторых вариантах осуществления он также может быть вирусным промотором. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения промоторная последовательность молекулы нуклеиновой кислоты, регулирующая экспрессию кодирующей последовательности, содержащей среди прочего последовательность представляющего интерес гена, может быть эндогенной промоторной последовательностью (т.е. последовательностью, регулирующей экспрессию представляющего интерес эндогенного гена), таким образом отражая эндогенную ситуацию.

Термин "детектирование неинвазивным способом формирования оптического изображения" относится к любому способу, который можно использовать для неинвазивного детектирования в клетке флуоресцентных полипептидов-репортеров. Поскольку способ зависит от полипептида-репортера, это позволяет глубже изучить функциональные и биохимические свойства указанного полипептида, а также клетки, в которой происходит экспрессия данного полипептида. Способы "формирования оптического изображения", как правило, основаны на таких агентах, которые обычно называются контрастными агентами; в настоящем изобретении указанными контрастными агентами являются флуоресцентные полипептиды-репортеры.

Предпочтительно, детекцию