Получение комплексов нуклеиновых кислот и поперечно сшитых дисульфидными связями катионных компонентов, предназначенных для трансфекции и иммуностимуляции

Получение комплексов нуклеиновых кислот и поперечно сшитых дисульфидными связями катионных компонентов, предназначенных для трансфекции и иммуностимуляции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к комплексу, включающему полимерный носитель и карго-молекулу (переносимую молекулу), в котором в качестве карго-молекулы используют по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту (молекула) и в качестве полимерного носителя (предпочтительно нетоксичного и неиммуногенного) поперечно сшитые дисульфидными связями катионные компоненты. Предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, позволяет осуществлять эффективную трансфекцию клетки нуклеиновыми кислотами in vivo и in vitro и/или индукцию (врожденного (неспецифического) и/или адаптивного) иммунного ответа, предпочтительно в зависимости от нуклеиновой кислоты, подлежащей транспортировке в качестве карго-молекулы. В настоящем изобретении предложены также фармацевтические композиции, прежде всего вакцины, которые содержат предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу и необязательно антиген, а также применение предлагаемого в изобретении комплекса, содержащего полимерный носитель и карго-молекулу, и необязательно антиген, для трансфекции клетки, ткани или организма для целей (генной) терапии, указанной в настоящем описании, и/или в качестве иммуностимулирующего средства или адъюванта, например, для вызывания иммунного ответа при лечении или профилактике указанных заболеваний. И, наконец, изобретение относится к наборам, которые содержат предлагаемый в изобретении комплекс, включающий полимерный носитель и карго-молекулу, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию и/или предлагаемую в изобретении вакцину или любые их компоненты в одной или нескольких частях набора.

В настоящее время при многих болезнях требуется введение адъювантов для вызывания врожденного иммунного ответа и необязательно для поддержания адаптивного иммунного ответа, прежде всего при вакцинациях. При некоторых (но не обязательно при всех) этих болезнях дополнительно или в качестве альтернативы требуется осуществлять введение лекарственных средств, основой которых являются пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, например, требуется осуществлять трансфекцию клеток или тканей нуклеиновыми кислотами. Эти требования, как правило, представляют собой различные аспекты лечения указанных болезней, и для их выполнения, как правило, трудно использовать только один подход. По этой причине в настоящее время при существующем уровне техники, как правило, для решения указанных проблем применяют различные подходы.

В указанном выше контексте вакцинацию, как правило, рассматривают в качестве одного из наиболее эффективных и экономичных путей предупреждения или лечения болезней. Однако при создании вакцин возникает несколько трудно разрешимых проблем: вакцины часто неэффективны для очень молодых или очень старых индивидуумов; некоторые вакцины требуется вводить несколько раз и их защитное действие снижается с течением времени, что требует бестарных обработок, а для некоторых болезней, таких как ВИЧ, существует срочная необходимость в разработке эффективных вакцин. В целом, считается, что многие из указанных вакцин следует усовершенствовать или улучшать так, чтобы они могли вызывать более сильный или более продолжительный иммунный ответ.

Таким образом, основной актуальной проблемой является создание новых эффективных и безопасных адъювантов для целей вакцинации, которые обеспечивают индукцию и поддержание адаптивного иммунного ответа путем инициации или бустинга параллельного врожденного иммунного ответа.

К адъювантам, как правило, относят соединения, которые могут повышать и/или модулировать присущую антигену иммуногенность. Для снижения отрицательных побочных действий новые вакцины имеют более оптимальный (точный) состав, что часто приводит к уменьшению иммуногенности по сравнению с известными ранее вакцинами на основе целых клеток или вирусов. Таким образом, адъюванты требуются для придания и новым вакцинам способности вызывать сильные и продолжительные иммунные ответы, при этом дополнительным преимуществом является то, что в этом случае требуется меньшее количество антигена или меньшее число инъекций. В настоящее время очевидно, что адаптивный иммунный ответ главным образом зависит от уровня и специфичности начальных сигналов опасности, воспринимаемых клетками врожденной иммунной системы после заражения или вакцинации (Guy В., Nat Rev Microbiol 5(7), 2007, cc.505-517.). В частности, для нового поколения вакцин-кандидатов, которые во все большей степени состоят из высокоочищенных рекомбинантных белков и которые, хотя они являются малоопасными, обладают слабой иммуногенностью, значительно возрастает потребность в эффективных адъювантах.

К сожалению, в настоящее время доступно лишь небольшое количество лицензированных адъювантов. Наиболее известными являются квасцы, которые, как известно, представляют собой безопасный, но при этом очень слабый адъювант. Разработано много других адъювантов, например, предусматривается введение патогенов, CpG-нуклеотидов и т.д. Однако большая часть этих новых или «сконструированных» адъювантов все еще не удовлетворяют указанным выше требованиям, поскольку возникает много новых проблем, которые следует учитывать и решать. Эти проблемы представляют собой, среди прочего, новые и повторно возникающие инфекционные болезни, необходимость повторных введений, угрозу пандемии гриппа и т.д.

Кроме того, новые мишени для вакцин, как правило, более сложно обнаруживать и - вследствие их специфически приспособленных иммунных ответов - требуются более сильные адъюванты для обеспечения успеха в борьбе с ними. Кроме того, все еще существует значительное количество важных патогенов, для которых еще не созданы эффективные вакцины. Они представляют собой очень важные будущие мишени. Для того чтобы иметь возможность создавать вакцины против указанных мишеней необходимы более сильные адъюванты. Такие новые адъюванты должны обладать такими преимуществами, как способность вызывать более гетерологичные гуморальные иммунные ответы, перекрывающие широкое разнообразие патогенов, индукция сильных функциональных гуморальных иммунных ответов, гарантирующих уничтожение или нейтрализацию патогенов, и индукция более эффективных Т-клеточных ответов для непосредственного или опосредованного уничтожения патогенов, прежде всего индукция цитотоксических Т-клеток, которые являются частью иммунного Th1-ответа. Кроме того, адъюванты могут быть необходимы для достижения более прагматичных воздействий, таких как снижение дозы антигена и возможность избежать конкуренции антигенов при использовании комбинированных вакцин. Кроме того, в связи со старением популяции, у которой возрастает чувствительность к инфекционным болезням, могут требоваться новые адъюванты для преодоления естественного связанного с возрастом ослабления иммунных ответов (O'Hagan D. Т. и Е. De Gregorio, Drug Discov Today 14(11-12), 2009, cc.541-551).

В обзоре O′Hagan (2009; выше) обобщены некоторые причины настоятельной необходимости в новых эффективных адъювантах, например, требование к снижению дозы антигена в вакцинах, необходимость в расширении диапазона иммунного ответа и гетерологичной активности, возможность создавать комплексные комбинации вакцин и для преодоления антигенной конкуренции, для преодоления ограниченного иммунного ответа в некоторых группах популяции, таких как престарелые люди, маленькие дети и младенцы, пациенты с хроническими заболеваниями и ослабленным иммунитетом, для повышения ответа эффекторных Т-клеток и титров антител, для более быстрой индукции защитных ответов, а также для увеличения продолжительности ответа путем усиления ответов В- и Т-клеток памяти.

Обобщая вышесказанное, очевидно, что требуются новые эффективные и безопасные иммуностимулирующие агенты или адъюванты, которые предпочтительно могут эффективно индуцировать врожденный иммунный ответ, прежде всего индуцировать антивирусный цитокин IFN-альфа; которые также предпочтительно могут эффективно поддерживать адаптивный иммунный ответ; являются безопасными, т.е. не ассоциированы с какими-либо долговременными воздействиями; которые хорошо переносятся, которые можно получать путем простого синтеза; для хранения которых не требуются дорогостоящие условия (в частности, которые легко поддаются лиофилизации); для создания которых требуются простые и не дорогостоящие компоненты; которые являются биоразложимыми; которые совместимым со многими различными видами антигенов вакцин; которые могут обеспечивать совместное введение антигена и иммунного потенциатора, и т.д.

Как уже указано выше, действие адъювантов или иммуностимулирующих агентов, как правило, основано на их способности индуцировать врожденный иммунный ответ. Врожденная иммунная система образует доминантную систему защиты хозяина у большинства организмов и включает барьеры, такие как гуморальные и химические барьеры, включая, например, воспаление, систему комплемента и клеточные барьеры. Основой врожденной иммунной системы, как правило, является небольшое количество рецепторов, которые называют паттернраспознающими рецепторами. Они распознают консервативные молекулярные структуры (паттерны), отличая тем самым чужеродные организмы типа вирусов, бактерий, грибов и паразитов, от клеток хозяина. Указанные ассоциированные с патогенами молекулярные паттерны (РАМР) включают вирусные нуклеиновые кислоты, компоненты оболочек бактерий и грибов, флагеллярные белки и т.д. Первое подробно изученное семейство паттернраспознающих рецепторов (РАМР-рецепторы) представляло собой семейство Толл-подобных рецепторов (TLR). TLR представляют собой трансмембранные белки, которые распознают лиганды внеклеточной окружающей среды или полости эндосом. После связывания с лигандом они трансдуцируют сигнал через цитоплазматические белки-адаптеры, что приводит к запуску защитного ответа хозяина и влечет за собой производство антимикробных пептидов, провоспалительных хемокинов и цитокинов, антивирусных цитокинов и т.д. (см., например, Meylan E., J. Tschopp и др., Nature 442(7098), 2006, cc.39-44). Другие важные компоненты иммунной системы представляют собой, например, эндосомальные TLR, цитоплазматические рецепторы, интерфероны типа I и цитоплазматические рецепторы. Таким образом, в контексте настоящего описания иммуностимулирующие агенты или адъюванты рассматриваются предпочтительно как индукторы врожденного иммунного ответа, которые активируют паттернраспознающие рецепторы (РАМР-рецепторы). При этом возникает каскад сигналов, который может приводить, например, к высвобождению цитокинов (например, IFN-альфа), поддерживая врожденный иммунный ответ. Таким образом, предпочтительной особенностью иммуностимулирующего агента или адъюванта является способность связываться с указанными рецепторами и активировать такие РАМР-рецепторы. В идеальном варианте агент или адъювант дополнительно поддерживает адаптивный иммунный ответ, например, сдвигая иммунный ответ таким образом, что активируется предпочтительный класс Th-клеток. В зависимости от заболевания или нарушения, подлежащего лечению, может быть предпочтительным сдвиг в сторону основанного на Th1 иммунного ответа, или в других случаях может оказаться предпочтительным сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа.

Из существующего уровня техники известны некоторые перспективные адъюванты-кандидаты, которые удовлетворяют, по меньшей мере некоторым, но не всем из вышеперечисленных требуемых характеристик.

Например, из числа вышеуказанных разработанных новых адъювантов некоторые нуклеиновые кислоты типа олигонуклеотидов CpG-ДНК или isPHK (иммуностимулирующая РНК), могут оказаться перспективными кандидатами в качестве новых иммуностимулирующих агентов или адъювантов, поскольку они обеспечивают терапевтическую или профилактическую индукцию врожденного иммунного ответа. В целом, такие адъюванты, основой которых являются нуклеиновые кислоты, как правило, должны эффективно достигать места действия, обеспечивая индукцию эффективного иммунного ответа без ненужного снижения адъювантной активности и в некоторых случаях без необходимости увеличения вводимого объема выше уровней, переносимых при системном введении.

Одним из подходов к решению этой задачи может быть трансфекция клеток, которые являются частью врожденной иммунной системы (например, дендритные клетки, плазмацитоидные дендритные клетки (pDC)), иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами, которые являются лигандами РАМР-рецепторов (например, Толл-подобных рецепторов (TLR)), и это может приводить к иммуностимуляции нуклеиновой кислотой-лигандом. Другие подходы могут представлять собой непосредственную трансфекцию адъювантами на основе нуклеиновых кислот. Однако недостатком (снижающим эффективность) всех этих подходов, как правило, является неэффективное введение нуклеиновой кислоты и, как следствие, снижение адъювантной активности, в частности при местном применении.

Так, в настоящее время основным недостатком указанных подходов, основанных на применении адъювантов, которые представляют собой нуклеиновые кислоты, является их ограниченная способность проникать через плазматическую мембрану клеток млекопитающих, что приводит к плохому доступу в клетки и несоответствующей терапевтической эффективности. К настоящему времени это препятствие представляет собой основную проблему для применения трансфекции нуклеиновыми кислотами, например, при разработке биомедицинских подходов, и следовательно с точки зрения коммерческого успеха многих биофармацевтических средств (см., например, Foerg С. и Merkle H.P., J Pharm Sci 97, 2008, cc.144-162).

Трансфекция клеток или тканей нуклеиновыми кислотами или генами к настоящему времени изучена в контексте применения для целей трансфекции in vitro и в контексте геннотерапевтических подходов. Однако к настоящему времени отсутствуют эффективные и безопасные адъюванты, при применении которых используют указанные методики введения генов, в частности отсутствуют лицензированные адъюванты. Это, вероятно, обусловлено комплексными требованиями к адъювантам в целом в сочетании с требованиями к стабильности, которые необходимо выполнять в случае адъювантов на основе нуклеиновых кислот.

Тем не менее трансфекция нуклеиновыми кислотами или генами клеток или тканей для вызвания (врожденного и/или адаптивного) иммунного ответа, по-видимому, представляет собой перспективный подход к получению новых адъювантов.

Однако многие такие подходы основаны на применении трансфекции нуклеиновыми кислотами или генами клеток или тканей без индукции врожденного иммунного ответа. Существуют даже некоторые терапевтические подходы, в которых строго требуется избегать врожденного иммунного ответа. Даже в тех редких случаях, когда вакцинацию осуществляют для индукции адаптивного антигенспецифического иммунного ответа с использованием введения нуклеиновых кислот, например, противоопухолевая вакцинация с использованием ДНК или мРНК, которые кодируют антигены, индукцию адаптивного иммунного ответа, как правило, осуществляют в виде активной иммунизации против кодируемого антигена, но не в виде сопутствующей адъювантной терапии, и поэтому требуется дополнительное введение отдельного адъюванта для индукции врожденного иммунного ответа.

Хотя в данной области известно много методов трансфекции, перенос или встраивание нуклеиновых кислот или генов в клетки индивидуума в настоящее время все еще представляет собой основную проблему, которая еще не имеет удовлетворительного решения. Для решения этой сложной задачи в последнее десятилетие разработано широкое разнообразие методов. Они включают трансфекцию с использованием фосфата кальция, катионных липидов, катионных полимеров и липосом. Другими методами, применяемыми для трансфекции, являются электропорация и вирусная трансдукция.

Однако, как известно специалисту в данной области, системы для переноса или инсерции нуклеиновых кислот или генов должны удовлетворять нескольким требования при их применениях in vivo, которые включают эффективное введение нуклеиновых кислот в клетки индивидуума, обеспечивая высокую функциональность, защиту нуклеиновой кислоты от повсеместно присутствующих нуклеаз, высвобождение нуклеиновой кислоты в клетку, отсутствие проблем с позиций безопасности, возможность промышленного получения в предназначенной для продажи форме и стабильность при хранении в экономичных условиях (например, поддающиеся лиофлизации). Эти требования должны быть добавлены к комплексу требований, предъявляемых к адъювантам, в частности, если они находятся в форме указанных выше нуклеиновых кислот.

Некоторые успешно применяемые в настоящее время стратегии переноса или инсерции нуклеиновых кислот или генов, доступные в настоящее время, основаны на применении вирусных векторов, таких как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы и вирусы герпеса. Вирусные векторы могут опосредовать высокоэффективный перенос генов и обеспечивают возможность длительной генной экспрессии. Однако острый иммунный ответ («цитокиновый шторм»), иммуногенность и инсерционный мутагенез, которые обнаружены в клинических испытаниях средств генной терапии, приводят к серьезным опасениям в отношении безопасности при использовании некоторых обычно применяемых вирусных векторов.

Другое решение проблемы переноса или инсерции нуклеиновых кислот или генов может быть связано с применением невирусных векторов. Хотя невирусные векторы не являются столько же эффективными как вирусные векторы, разработан целый ряд невирусных векторов в качестве безопасной альтернативы. Методы невирусного введения нуклеиновых кислот осуществляют с использованием физических (введение нуклеиновой кислоты без носителя) и химических подходов (введение нуклеиновой кислоты, основанное на использовании синтетического вектора). Физические подходы, как правило, включают игольную инъекцию, электропорацию, применение генной пушки, облучение ультразвуком и гидродинамическое введение, применение физического усилия, обеспечивающего проникновение через клеточную мембрану и облегчающего внутриклеточный перенос гена. В химических подходах, как правило, применяют синтетические или встречающиеся в естественных условиях соединения (например, катионные липиды, катионные полимеры, гибридные липид-полимерные системы) в качестве носителей для введения нуклеиновой кислоты в клетки. Хотя достигнут значительный прогресс с позиций науки и путей применения различных невирусных систем введения нуклеиновых кислот, большинство невирусных подходов все еще являются намного менее эффективными по сравнению с подходами, основанными на применении вирусных векторов, прежде всего для введения in vivo генов (см., например, Gao X., Kim K. и Liu D., AAPS J 9, 2007, Е 92-104).

Указанные агенты для трансфекции, которые перечислены выше, как правило, успешно применяли только в реакциях in vitro. Однако для применения нуклеиновых кислот in vivo, они должны удовлетворять дополнительным требованиям. Например, комплексы между нуклеиновыми кислотами и агентами для трансфекции должны обладать стабильностью в физиологических соляных растворах с позиций агломерации. Кроме того, такие комплексы, как правило, не должны взаимодействовать с компонентами системы комплемента хозяина и в результате сами не должны обладать иммуногенностью в качестве носителя, который сам не должен индуцировать адаптивный иммунный ответ у индивидуума. Кроме того, комплекс должен защищать нуклеиновую кислоту от преждевременного внутриклеточного расщепления повсеместно присутствующими нуклеазами.

В данной области известно и доступно много реагентов для трансфекции, прежде всего катионных липидов, которые обладают очень высокой трансфецирующей активностью в культуре клеток. Однако большинство этих реагентов для трансфекции не осуществляют свою функцию в достаточной степени в сыворотке, и только немногие из них обладают активностью in vivo. Резкое изменение размера, поверхностного заряда и состава липидов происходят в том случае, когда липоплексы подвергаются воздействию намного большего количества отрицательно заряженных и часто амфипатических белков и полисахаридов, которые присутствуют в крови, слизи, заполненной жидкостью эпителиальной выстилке или тканевом матриксе. После введения in vivo липоплексы имеют тенденцию к взаимодействию с отрицательно заряженными компонентами крови и формируют крупные агрегаты, которые могут абсорбироваться на поверхности циркулирующих эритроцитов, улавливаться толстым слоем слизи или образовывать эмболы в микрососудистой сети, что препятствует достижению ими требуемых клеток-мишеней в отдаленной области. Некоторые даже подвергаются распаду после их интродукции в кровоток (см., например, Gao X., Kim K. и Liu D., AAPS J 9, 2007, Е 92-104).

Одним из наиболее перспективных подходов является применение катионных полимеров. Оказалось, что катионные полимеры являются эффективными в отношении трансфекции нуклеиновыми кислотами, поскольку они могут образовывать тесно связанные комплексы и конденсируют отрицательно заряженную нуклеиновую кислоту. Так, целый ряд катионных полимеров используется в качестве носителей для введения генов in vitro и in vivo. Они включают полиэтиленимин (ПЭИ), полиамидоамин и дендримеры полипропиламина, полиааллиламин, катионный декстран, хитозан, катионные белки и катионные пептиды. Хотя большинство катионных полимеров обладают способностью конденсировать ДНК в небольшие частицы и облегчают проникновение в клетку посредством эндоцитоза благодаря взаимодействию типа заряд-заряд с анионными сайтами на клеточных поверхностях, они очень резко различаются по их трансфецирующей активность и токсичности.

Из существующего уровня техники известен только один подход, в котором продемонстрировано иммуностимулирующее действие РНК в комплексе с короткими катионными пептидами (Fotin-Mleczek и др., WO 2009/030481). Указанные композиции, вероятно, эффективно индуцируют производство цитокинов в иммунокомпетентных клетках. К сожалению Fotin-Mleczek с соавторами не оценивали индукцию этими комплексами предпочтительного антивирусного цитокина IFN-α. Кроме того, эти комплексы не обладали стабильностью в процессе лиофилизации.

В вышеуказанном контексте для катионных полимеров характерно повышение трансфецирующей эффективности с увеличением молекулярной массы. Однако увеличение молекулярной массы приводит также к повышению токсичности катионного полимера. В вышеуказанном контексте (высокомолекулярный) ПЭИ, по-видимому, является наиболее активным и наиболее изученным полимером для трансфекции нуклеиновыми кислотами, в частности, для целей введения генов. К сожалению, ему свойственны некоторые недостатки, связанные с его бионеразложимой природой и токсичностью. Кроме того, хотя полиплексы, сформированные с использованием высокомолекулярных полимеров, отличаются улучшенной стабильностью в физиологических условиях, имеются данные, свидетельствующие о том, что такие полимеры могут препятствовать распаковке вектора. Для преодоления указанного отрицательного воздействия Read с соавторами (см. Read M.L. и др., J Gene Med. 5, 2003, cc.232-245; и Read M.L. и др., Nucleic Acids Res, 33, 2005, с.86) разработали новый тип синтетического вектора на основе линейного способного к восстановлению поликатиона (RPC), полученного путем окислительной поликонденсации пептида Cys-Lys₁₀-Cys. Этот пептид Cys-Lys₁₀-Cys может расщепляться внутриклеточным окружением, что облегчает высвобождение нуклеиновых кислот. В этом контексте Read с соавторами (2003, выше) продемонстрировали, что подиндексы, сформированные с использованием указанных RPC, дестабилизировались в восстанавливающих условиях, что позволяло эффективно высвобождать ДНК и мРНК. Однако оценка трансфецирующей эффективности in vitro (Read и др., 2003, выше) продемонстрировала также, что величины отношения N/P (отношение количества атомов азота к количеству атомов фосфора), находящиеся на уровне 2, являются неудовлетворительными и для повышения трансфецирующей эффективности необходимы более высокие величины отношения N/P. Кроме того. Read с соавторами (2003, выше) обнаружили, что для повышения трансфецирующей эффективности до соответствующего уровня дополнительно необходимы хлорохин или катионный липид DOTAP. Поэтому Read с соавторами (2005, выше) включили гистидиновые остатки в RPC, которые как известно, обладают способностью забуферивать эндосомы, и продемонстрировали, что такие богатые гистидином RPC могут расщепляться во внутриклеточном восстанавливающем окружении. Такой подход позволил осуществлять эффективное введение в цитоплазму широкого спектра нуклеиновых кислот, включая молекулы плазмидной ДНК, мРНК и siPHK, без необходимости применения обладающего литическим действием на эндосомы агента хлорохина.

К сожалению ни в исследовании Read с соавторами (2003, выше), ни в исследовании Read с соавторами (2005, выше) не был изучен вопрос о возможности непосредственного применения RPC in vivo. В исследовании, выполненном указанными авторами в 2005 г., трансфекции осуществляли в отсутствии сыворотки, для того, чтобы избежать маскирующего действия остатков гистидина на повышенный перенос генов, которое может возникать в результате связывания сывороточных белков с полиплексами, что ограничивает поглощение клетками. Однако, в проведенных ранее экспериментах было установлено, что на трансфецирующие свойства богатых гистидином содержащих RPC полиплексов может влиять присутствие сывороточных белков, так было обнаружено снижение на 50% GFP-позитивных клеток в присутствии 10% FCS. Для применения in vivo Read с соавторами (2005, выше) предложили модификации с помощью гидрофильного полимера поли[N-(2-гидроксипропил)метакрилаимида]. К сожалению, это не привело к предотвращению агрегации полиплексов и связывания поликатионных комплексов с сывороточными белками. Кроме того, образовывались сильные катионные заряженные комплексы (положительный дзета-потенциал) при образовании комплексов с нуклеиновой кислотой из-за значительного избытка катионного полимера, что характеризовалось высокой величиной отношения N/P. Таким образом, указанные комплексы только ограничивали применение in vivo вследствие их выраженной тенденции к индуцируемой солями агломерации и взаимодействий с компонентами сыворотки (опсонизация). Кроме того, эти (положительно заряженные) комплексы могут приводить к активации комплемента при их применении в области генной терапии. Установлено также, что для этих комплексов на основе положительно заряженных RPC характерна плохая трансляция нуклеиновой кислоты, представляющей собой карго-молекулу, при местном введении в кожу.

Используя подход, аналогичный описанному у Read с соавторами, McKenzie с соавторами (McKenzie D.L., Kwok K.Y. и др., J Biol Chem 275(14), 2000, cc.9970-9977 и McKenzie D.L., Smiley E. и др., Bioconjug Chem 11(6), 2000, cc.901-909) создавали поперечно сшивающие пептиды в качестве агентов для введения генов путем встраивания несколько остатков цистеина в короткие синтетические пептиды. В описанных экспериментах авторы оценивали оптимальное образование комплексов с ДНК и в результате им удалось продемонстрировать, что для получения полностью сформированных конденсатов связанной с пептидом ДНК необходима величина отношения N/P, составляющая по меньшей мере 2. Таким образом, по-видимому, оптимальная конденсация ДНК происходит только в положительно заряженных комплексах. В отличие от этого подхода указанные авторы предложили создавать отрицательно заряженные комплексы для введения генов in vivo, поскольку в предыдущих исследованиях было установлено, что внутривенное введение электроположительных конденсатов ДНК приводит к быстрой опсонизации и неспецифическому биораспределению в легкое и печень (Collard W.T., Evers D.L., McKenzie D.L. и Rice K.G., Carbohydr. Res. 323, 2000, cc.176-184). Для этой цели McKenzie с соавторами (2000; выше) предложили дериватизацию носителей полиэтиленгликолем и обеспечивающими направленный перенос лигандами. Следует отметить, что подход McKenzie и др. (2000, выше) представляет собой дополнительный объект патента (US 6770740 В1), в котором описана, в частности, трансфекция с использованием кодирующих нуклеиновых кислот, антисмысловых нуклеиновых кислот и рибозимов.

Таким образом, применение in vivo нуклеиновых кислот все еще остается, по-видимому, одной из наиболее сложных проблем, поскольку белки плазмы с анионными зарядами могут неспецифически связываться с положительно заряженными комплексами и быстро их удалять, например, через ретикулоэндотелиальную систему. Опсонизация и активация системы комплемента катионными комплексами представляют собой дополнительный физиологический феномен, который может принимать участие в снижении эффективности in vivo введенных катионных комплексов. Это относится прежде всего к введению лекарственных средств на основе нуклеиновых кислот, например, при трансфекции нуклеиновыми кислотами клеток или тканей, в частности, если требуется экспрессия кодируемого белка или пептида или транскрипция РНК трансфектированной нуклеиновой кислоты.

Обобщая вышесказанное, очевидно, что при существующем уровне техники отсутствуют пригодные средства и методы, которые, с одной стороны, позволяют создавать эффективные и безопасные адъюванты для целей вакцинации, и которые, с другой стороны, кроме того, можно применять для введения in vivo нуклеиновых кислот, в частности, для «компактинга» (уплотнение, конденсация) и стабилизации нуклеиновой кислоты для осуществления трансфекции нуклеиновыми кислотами in vivo без проявления отрицательных побочных действий, указанных выше. Более конкретно, в этом контексте в данной области не известны средства или методы, которые, с одной стороны, являются достаточно стабильными для переноса представляющей собой карго-молекулу нуклеиновой кислоты к мишени до ее метаболического расщепления, и которые, с другой стороны, могут выделяться из ткани до их накопления и достижения токсических уровней. Кроме того, не известны средства или методы, которые в дополнение к вышеуказанным требованиям, индуцируют требуемый набор цитокинов, прежде всего антивирусный цитокин IFN-α.

Таким образом, в основу настоящего изобретения положена задача разработать средства или способы, направленные на решение указанных проблем.

Положенная в основу настоящего изобретения задача решается с помощью объектов настоящего изобретения, предпочтительно с помощью объектов, представленных в прилагаемой формуле изобретения.

Таким образом, согласно первому варианту осуществления изобретения задача, положенная в основу настоящего изобретения, решается с помощью комплекса, содержащего полимерный носитель и карго-молекулу, который включает

а) (в качестве носителя) полимерный носитель, состоящий из поперечно сшитых дисульфидными связями катионных компонентов, и

б) (в качестве карго) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту (молекула),

который предназначен предпочтительно для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно для применения в качестве иммуностимулирующего агента или адъюванта, например, для лечения указанного в настоящем описании заболевания.

В другом варианте задача, положенная в основу настоящего изобретения, решается с помощью комплекса, содержащего полимерный носитель и карго-молекулу, который включает

а) полимерный носитель, состоящий из поперечно сшитых дисульфидными связями катионных компонентов (в качестве носителя), и

б) по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту (молекула) (в качестве карго),

который предназначен предпочтительно для применения в качестве лекарственного средства, более предпочтительно для применения в качестве иммуностимулирующего агента или адъюванта, например, для лечения указанного в настоящем описании заболевания.

Подразумевается, что понятие «иммуностимулирующий агент (иммуностимулятор)», как правило, не относится к агентам, например, антигенам (вне зависимости от их химической структуры), которые вызывают адаптивный/цитотоксический иммунный ответ, например, «гуморальный» или «клеточный» иммунный ответ, другими словами, вызывает иммунные ответы (и тем самым придает иммунитет), которые характеризуются специфическим ответом на структурные свойства антигена, распознаваемого как чужеродный иммунокомпетентными клетками. Скорее, под «иммуностимулирующим агентом», как правило, подразумеваются агенты/соединения/комплексы, которые сами не запускают какой-либо адаптивный/цитотоксический иммунный ответ, но которые могут только повышать указанный адаптивный/цитотоксический иммунный ответ неспецифическим образом, например, путем активации «РАМР»-рецепторов, и тем самым запускать высвобождение цитокинов, которые поддерживают фактически существующий адаптивный/цитотоксический иммунный ответ. Таким образом, никакая иммуностимуляция агентами (например, антигенами), которые сами вызывают адаптивный и/или цитотоксический иммунный ответ (которые сами прямо или косвенно придают иммунитет), как правило, исключается из объема, охватываемого понятием «иммуностимулирующий агент».

Подразумевается также, что под понятие «адъювант» не подпадают агенты, которые сами придают иммунитет. Таким образом, они не придают иммунитет сами по себе, но помогают иммунной системе различными путями усиливать антигенспецифический иммунный ответ, например, способствуя презентации антигена иммунной системе. Таким образом, адъювант предпочтительно может, например, модулировать антигенспецифический иммунный ответ, например, сдвигая доминирующий антигенспецифический иммунный ответ по Th1-типу в сторону преобладания антигенспецифического ответа по Th2-типу, или наоборот. Таким образом, понятие «иммуностимулирующий агент» и «адъювант» в контексте настоящего изобретения, как правило, относятся к агентам, соединениям или комплексам, которые сами не могут придавать иммунитет, но исключительно поддерживают иммунный ответ неспецифическим образом (в противоположность антигенспецифическому иммунному ответу) с помощью действий, которые модулируют антигенспецифический (адаптивный клеточный и/или гуморальный иммунный ответ) неспецифическими путями, например, с помощью экспрессии/секреции цитокинов, улучшая презентацию антигенов, сдвигая природу «плечей» иммунного ответа и т.д. Таким образом, любые агенты, которые сами вызывают иммунитет, как правило, не подпадают под понятия «адъювант» или «иммуностимулирующий агент».

Предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, позволяет получать эффективные и безопасные адъюванты для целей вакцинации и носители для трансфекции с целью применения либо в области вакцинации, либо адъювантной терапии, либо генной терапии. Целесообразно применять предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, для введения in vivo нуклеиновых кислот, в частности для уплотнения и стабилизации нуклеиновой кислоты для применения в трансфекции нуклеиновыми кислотами без обсужденных выше отрицательных побочных действий высокомолекулярных полимеров, таких как отсутствие или плохая биоразложимость, или даже высокая токсичность, агломерированные, низкая трансфецирующая активность in vivo и т.д. Предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, обеспечивает также эффективный перенос нуклеиновых кислот in vivo, прежде всего внутрикожным или внутримышечным путями, в том числе, стабильность в сыворотке, стабильность в солевых условиях, эффективное поглощение, он не активирует комплемент, способствует высвобождению нуклеиновых кислот и т.д. Указанный предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, когда его применяют в качестве адъюванта, поддерживает также индукцию и адаптивный иммунный ответ, путем параллельной инициации или бустинга врожденного иммунного ответа. Кроме того, предлагаемый в изобретении комплекс, содержащий полимерный носитель и карго-молекулу, обладает очень высокой стабильностью при хранении, прежде всего в процессе лиофилизации.

Предлагаемый в изо