Контроль заражения членистоногими применением частиц, содержащих энтомопатоген и воск

Контроль заражения членистоногими применением частиц, содержащих энтомопатоген и воск

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Контроль заражения членистоногими

Настоящее изобретение относится к способу регулирования заражения членистоногими, к сложным частицам, композициям для обработки заражения членистоногими и их применениям, в частности, данное изобретение относится к способам регулирования заражения членистоногими в местах для хранения зерна, способам применения композиций в сухой порошковой форме к членистоногим, сухим порошковым композициям, содержащим биологические агенты в сочетании с гидрофобными частицами, к способам изготовления таких композиций и их применениям.

Места для хранения сухого корма и места для хранения зерна, такие как силосные зернохранилища и зерновые бункеры, где зерно хранится сразу после уборки урожая или до обработки, привлекают членистоногих, таких как клещей и жуков, особенно жуков. Другие места для хранения сухого корма и места для хранения зерна включают хранилища, где сухой корм и зерно хранится перед перевозкой, и сооружения для перевозки, такие как контейнеры для перевозки, хранилища на судах, тележки и тому подобное. Кроме того места для хранения сухого корма и зерна включают хранилища, в которых находятся зерновые продукты, такие как виды муки, высушенные виды бобов/фасоли, чечевицы, рис и другие продукты, полученные из зерна, и/или сухой корм. Членистоногие, такие как насекомые, например, жуки в хранилище зерна, кормятся зерном и являются основной причиной экономических потерь для фермеров и отраслей промышленности, утилизирующих зерно.

Когда зерно удаляют из мест для хранения зерна, многие членистоногие потом остаются, заселяя щели и трещины в стенах, полах и других поддерживающих структурах, таких как опоры и/или полки. Обычные процедуры для регулирования заражений членистоногими, которые основаны на использовании химикатов, применяемых в виде влажных препаратов для опустевших мест хранения зерна, являются эффективными, так как они уничтожают членистоногих, которые вступают в контакт с применяемым химикатом. Однако влажные химические препараты обычно не поступают в щели и трещины, заселенные популяциями членистоногих. Такие популяции выживают после применения химикатов, которые наносятся на поверхности окружающей среды, и поэтому являются способными к заражению новых партий зерна, которые закладываются в место для хранения, и таким образом данный цикл заражения зерна повторяется с сопутствующими экономическими потерями.

Другие способы обработки мест для хранения зерна основаны на применении относительно высоких количеств химикатов для борьбы с членистоногими в сухой порошковой форме. Однако эффективность таких обработок уменьшается с течением времени.

На известном уровне техники были использованы биологические агенты при попытках регулировать заражения разными видами членистоногих в различных ситуациях. В частности, выявлено использование некоторых штаммов энтомопатогенных грибов, таких как Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus и Lecanicillium spp., для контроля некоторых членистоногих. Хотя энтомопатогенные грибы четко показаны как кандидаты для регулирования заражений членистоногими, также очевидно, что большинство штаммов энтомопатогенных грибов не подходит в качестве кандидатов для контроля заражений членистоногими в мириаде так называемых полевых окружающих условий, в которых эффективное использование штаммов гриба было бы желательно. Часто, как было показано, очевидно, что штаммы подходящих кандидатов гриба являются неспособными выносить экстремальные окружающие условия, которые часто существуют в окружающей среде, созданной человеком, а именно в местах для хранения зерна или при других внешних условиях, в которые могут быть помещены продукты питания (например, мука) или зерно.

Проблема применения биологических агентов, таких как взятых для использования штаммов энтомопатологического гриба, который может быть открыт в одной местности и предполагается для использования в другой местности, состоит в том, что такие штаммы не могут эффективно действовать в новой окружающей среде местности из-за того, что они не способны переносить экстремумы условий, которые преобладают в окружающей среде в данной местности, в которой они должны быть применены. Кроме того, регулирующие ограничения могут быть столь трудными, чтобы сделать внесение штамма вероятного кандидата неосуществимым, и это может быть связано с сомнениями о способности доказать его вероятную эффективность в экзотической окружающей среде.

USP 4925663 описывает применение в числе прочего сухого порошкового препарата, содержащего размолотый в порошок рис и определенный штамм гриба Beauveria bassiana, который имеет особую вирулентность против огненных муравьев при применении в открытой окружающей среде.

Meikle et al (2007) J. Econ. Entomol. 100: 1-10 описывает применение карнаубского воска в качестве носителя спор Beauveria bassiana (штамм Bd05002, который является местным для Франции) в пчелиных ульях для контроля клещей рода варроа. Окружающая среда внутри улья представлена как имеющая относительную влажность (RH) от 40% до 50%, предположительно при температурах от 33°С до 36°С. Кажется, что внешняя окружающая среда внутри пчелиного улья не является объектом для широких экстремумов RH и температуры в числе прочего, потому что пчелы активно регулируют температуру внутри.

WO 2006/121350 описывает приготовление некоторых биологически чистых культур штаммов энтомопатогенных грибов, таких как Beauveria bassiana, для регулирования фитопатогенных насекомых при применении против Thysanoptera (трипсы), Hemiptera (белокрылка) и других. Композиции, описанные в данной работе, по-видимому должны применяться на растения в поле для влажного опрыскивания.

Объект настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть или по меньшей мере уменьшить недостатки обычных способов обработки мест для хранения зерна при заражении членистоногими. Данный и другие объекты станут очевидными из следующего описания и примеров.

Согласно настоящему изобретению предлагается сухая порошковая композиция, являющаяся эффективной в регулировании популяций членистоногих в хранилище зерна, которая содержит i) гидрофобные частицы, которые прилипают к кутикуле одного или нескольких видов членистоногого в хранилище зерна; ii) споры энтомопатогенного гриба, которые прилипают к указанным частицам и которые способны к развитию на кутикулах одного или нескольких видов членистоногого в хранилище зерна.

Не вдаваясь в теоретическое обоснование полагают, что частицы, которые прилипают к кутикуле членистоногого, осуществляют это посредством электростатических сил, возникающих между частицами, которые электростатически заряжены, и кутикулой насекомого. Такие частицы обычно являются диэлектрическими частицами и, как полагают, сохраняют их электростатический заряд путем появления электрических сил, возникающих за счет притирания движущихся частей членистоногого.

Частицы, используемые в изобретении, обладают степенью гидрофобности, при которой гидрофобные силы между спорами и кутикулой членистоногого больше, чем электростатические силы между спорами и частицами, используемыми в изобретении, следовательно, споры способны отделяться от указанных частиц и затем прикрепляться предпочтительно к кутикуле членистоногого.

Таким образом, споры энтомопатогенного гриба для использования в изобретении обладают гидрофобностью, которая отличается от гидрофобности, связанной с гидрофобными частицами. Все же предпочтительно, гидрофобность спор также отличается от гидрофобности кутикулы членистоногого в хранилище зерна так, что споры предпочтительно прилипают к кутикуле по меньшей мере одного из видов членистоногого в хранилище зерна. Таким образом, степень гидрофобности спор обычно является более высокой, чем гидрофобность гидрофобных частиц, используемых в изобретении, которые в свою очередь имеют степень гидрофобности, которая выше чем гидрофобность кутикулы членистоногого. Таким образом, степень гидрофобности спор, используемых в изобретении, может быть представлена следующим образом:

гидрофобность спор > гидрофобность гидрофобных частиц для использования в изобретении > гидрофобность кутикулы членистоногого. Естественно, специалист оценит это расположение по-другому; степень гидрофильности спор ниже, чем гидрофильность частиц, которые, в свою очередь, имеют более высокую степень гидрофильности, чем степень гидрофильности кутикулы членистоногого. Для того чтобы тестировать степень гидрофильности представленных компонентов, используемых в изобретении, как отмечено выше, и, следовательно, их пригодность для применения в настоящем изобретении, специалист в данной области способен упростить проведение визуальной оценки отношения споры:частица, и частица:кутикула членистоногого или споры:частица:кутикула, используя обычно применяемые методики, такие как использование электронного сканирующего микроскопа. Обычно гидрофобные частицы, используемые в изобретении, несут споры к кутикуле членистоногого в хранилище зерна, к тому же приводя их в контакт, или заряженные частицы несут споры к тесному соседству с поверхностью кутикулы членистоногого, где споры становятся отделенными от несущей частицы из-за различий в гидрофобности межу несущей частицей и спорой, и прилипают предпочтительно к поверхности кутикулы. Как только споры изобретения доставлены к кутикуле, они способны к развитию на кутикуле указанного по меньшей мере одного из видов членистоногого в хранилище зерна, и вследствие этого к проникновению в кутикулы.

Процедурой использования гидрофобности спор и электростатического притяжения частиц носителя, используемых в изобретении, получена эффективная система носителя, которая способна нести споры к целевым поверхностям кутикулы насекомого. Споры гриба затем сами по себе могут откладываться на кутикуле насекомого, где споры затем развиваются и проникают в кутикулу насекомого. В случаях, где споры недостаточно притянуты к кутикуле насекомого за счет гидрофобных сил, но остаются на частицах, которые прилипают к поверхности кутикулы членистоногого, споры грибка на частице носителя должны быть способны к развитию на или вблизи поверхности кутикулы насекомого и способны проникать в нее.

Сухие порошковые композиции изобретения могут также содержать подходящие эксципиенты, обычно используемые в данной области, такие как добавки для повышения текучести или добавки против слеживания, выбранные из бикарбоната натрия, ферроцианида натрия, ферроцианида калия, ферроцианида кальция, костяного фосфата, силиката натрия, диоксида кремния, силиката кальция, трисиликата магния, порошка талька, алюмосиликата натрия, силиката алюминия калия, алюмосиликата кальция, бентонита, силиката алюминия, стеариновой кислоты, полидиметилсилоксана и тому подобного.

Кроме того, порошковые композиции изобретения могут содержать другие компоненты, такие как добавки, выбранные из химических средств, защищающих организм от действия УФ, такие как бета-каротин или п-аминобензойная кислота, обесцвечивающие средства, такие как оптические отбеливатели и коммерчески доступные красители, такие как пищевые красители, пластификаторы, такие как глицерин или соевое масло, противомикробные средства, такие как сорбат калия, нитраты, нитриты, пропиленоксид и тому подобное, антиоксиданты, такие как витамин Е, бутилированный гидроксиланизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), и другие антиоксиданты, которые могут присутствовать, или их смеси. Специалист оценит, какой будет сделан выбор таких обычно включаемых добавок в зависимости от конечной цели и осознанной необходимости.

Сухие порошковые композиции изобретения должны быть эффективными в регулировании членистоногих в хранилище зерна. Споры энтомопатогенного грибка (также называемые в данной области как “конидии”), используемые в изобретении, должны быть способны к развитию на кутикуле по меньшей мере одного членистоногого в хранилище зерна, и как только развились, к проникновению в кутикулу реципиентных членистоногих и уничтожать их.

Подходящие споры (конидии), используемые в настоящем изобретении, включают споры, выбранные из штаммов видов энтомопатогенного грибка Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus и Lecanicillium spp.

Предпочтительные штаммы энтомопатогенного грибка для получения спор или конидий, используемых в изобретении, включают штаммы, отобранные от видов Beauveria bassiana. Наиболее предпочтительно, штамм Beauveria bassiana, подходящий для получения спор или конидий, используемых в изобретении, представляет собой штамм, сохраненный по договору, Budapest Treaty, IMI 398548, в Centre for Agriculture and Biosciences International (CABI), Bakeham Lane, Egham, Surrey, TW20 9TY, UK 11 мая 2010.

Споры Beauveria bassiana, использованные в изобретении, должны быть способны к развитию, и как только развились, к проникновению в кутикулу членистоногих в хранилище зерна, таких как жуки в хранилище зерна. Предпочтительно, штаммы Beauveria bassiana, используемые в изобретении, являются активными против по меньшей мере следующих видов жуков в хранилище зерна: Oryzaephilus surinamensis (мукоед суринамский), Sitophilus granaries (долгоносик амбарный) и Cryptolestes ferrugineus (мукоед рыжий короткоусый).

Выражение ”одно или несколько членистоногих в хранилище зерна” относится к членистоногим в хранилище зерна, которые являются насекомыми, такими как жуки в хранилище зерна или бабочки и/или их личинки, которые заселяют места для хранения зерна. Примеры видов таких жуков в хранилище зерна включают Oryzaephilus surinamensis (мукоед суринамский), Sitophilus granaries (долгоносик амбарный) и Cryptolestes ferrugineus (мукоед рыжий короткоусый).

Выражение ”места для хранения зерна” по целям настоящего изобретения включает места для хранения сухого корма и/или зерна, такие как силосные зернохранилища и зерновые бункеры, где сухой корм или зерно хранят сразу после уборки урожая или до обработки, и включает хранилища, где сухой корм и зерно хранится перед перевозкой, и сооружения для перевозки, такие как контейнеры для перевозки, хранилища на судах, тележках, самолетах, места для хранения в супермаркетах, центры хранения сухого корма и тому подобное. Выражение ”место для хранения зерна” включает в пределах его охвата такие места для хранения, в которых находятся зерновые продукты после уборки, такие как зерно пшеницы, ячменя, кукурузы, сорго, и сухие продукты, полученные из собранной зерновой культуры или собранного зерна, такие как виды муки, высушенные виды фасоли, чечевицы, бобовых, рис и другие продукты, такие как виды теста/пасты, полученные из зерна и/или других высушенных продуктов.

Для целей настоящего изобретения ”регулирование популяций членистоногих в хранилище зерна” означает, что популяция членистоногого, к которой применены композиции изобретения, представляют собой популяции, которые претерпевают потери из-за гибели, неблагоприятного здоровья, которое в конце концов может приводить к гибели, и/или неспособности к воспроизводству или снижению способности к воспроизводству. Предпочтительно, регулирование популяций членистоногих в хранилище означает, что по меньшей мере 80%, предпочтительно 90%, популяции членистоногих погибает в течение 28 суток применения композиций изобретения. Предпочтительно, популяции членистоногих, на которые вредно воздействуют композициями изобретения, умирают или по меньшей мере претерпевают сублетальные эффекты, которые вносят вклад в долговременное воспроизводство популяции в результате применения сухих порошковых композиций изобретения к месту для хранения зерна. Специалист в данной области оценит, что популяция членистоногих в хранилище зерна, к которым применены композиции изобретения, может состоять из одного или нескольких видов членистоногих. Примеры видов членистоногих, которые могут составлять популяцию членистоногих в хранилище зерна, на которую можно воздействовать композициями изобретения, включают жуков в хранилище зерна, таких как Oryzaephilus surinamensis (мукоед суринамский), Sitophilus granaries (долгоносик амбарный) и Cryptolestes ferrugineus (мукоед рыжий короткоусый).

Гидрофобные сложные частицы изобретения обычно содержат воска, имеющие температуру плавления ≥50°С, предпочтительнее ≥60°С, и, наиболее предпочтительно, составлены из твердых восков, имеющих температуру плавления ≥70°С. Подходящие воска, используемые в изобретении, включают карнаубский воск, пчелиный воск, китайский воск, шеллачный воск, спермацетовый воск, канделильский воск, касторовый воск, воск бразильской пальмы и воск рисовых отрубей.

В предпочтительном варианте изобретения предлагается сухая порошковая композиция, являющаяся эффективной в регулировании популяций в хранилище зерна, которая содержит i) гидрофобные частицы, которые прилипают к кутикуле одного или нескольких видов членистоногого в хранилище зерна; и ii) споры энтомопатогенного гриба, которые прилипают к указанным частицам и которые способны к развитию на кутикулах одного или нескольких видов членистоногого в хранилище зерна. Предпочтительно, сухие композиции изобретения содержат частицы, имеющие среднеобъемный диаметр ≥10 мкм, и предпочтительнее сухие композиции изобретения имеют среднеобъемный диаметр ≥12 км. Такие композиции, имеющие среднеобъемный диаметр ≥10 мкм, как полагают, не представляют собой столь большой торакальной опасности, как частицы меньшего размера, и, как думают, не представляют столь большой угрозы для людей.

В качестве следующего аспекта изобретения, предлагается сложная частица для применения в композиции изобретения, которая содержит i) гидрофобные частицы, которые прилипают к кутикуле по меньшей мере одного из видов членистоногого в хранилище зерна; и ii) споры энтомопатогенного грибка, которые прилипают к указанным частицам и которые способны к развитию на кутикулах по меньшей мере одного из видов членистоногого в хранилище зерна. Предпочтительно, среднеобъемный диаметр сложной частицы равен ≥10 мкм, и предпочтительнее ≥12 мкм. Для приготовления сложных частиц изобретения споры энтомопатогенного грибка можно смешивать с гидрофобными частицами, такими как частицы карнаубского воска при массовом отношении от 5-95 мас.% гидрофобных частиц к спорам, предпочтительно при массовом отношении по меньшей мере 50-80 мас.% гидрофобных частиц к спорам, или предпочтительнее по меньшей мере из 75 мас.% гидрофобных частиц к спорам. Частицы можно микронизировать предпочтительно до VMD в ≥34 мкм для сохранения препаратов внутри безопасных пределов VMD. Специалист-получатель оценит, что могли быть использованы другие отношения гидрофобные частицы:споры для приготовления сложных частиц изобретения в зависимости от размера гидрофобной частицы и ее физических свойств, таких как электростатические свойства.

Сложные частицы изобретения могут также содержать подходящие эксципиенты, обычно используемые в данной области, такие как добавки для повышения текучести или добавки против слеживания, выбранные из бикарбоната натрия, ферроцианида натрия, ферроцианида калия, ферроцианида кальция, костяного фосфата, силиката натрия, диоксида кремния, силиката кальция, трисиликата магния, порошка талька, алюмосиликата натрия, силиката алюминия калия, алюмосиликата кальция, бентонита, силиката алюминия, стеариновой кислоты, полидиметилсилоксана и тому подобного.

Кроме того, сложные частицы изобретения могут содержать другие компоненты, такие как добавки, выбранные из химических средств, защищающих организм от действия УФ, такие как бета-каротин или п-аминобензойная кислота, обесцвечивающие средства, такие как оптические отбеливатели и коммерчески доступные красители, такие как пищевые красители, пластификаторы, такие как глицерин или соевое масло, противомикробные средства, такие как сорбат калия, нитраты, нитриты, пропиленоксид и тому подобное, антиоксиданты, такие как витамин Е, бутилированный гидроксиланизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), и другие антиоксиданты, которые могут присутствовать, или их смеси. Специалист оценит, какой будет сделан выбор таких обычно включаемых добавок в зависимости от конечной цели и осознанной необходимости.

Композиции изобретения, в которых по меньшей мере 50% по объему композиции соответствует величинам ≥10 мкм, как полагают, представляют собой меньше торакальной респираторной опасности и являются менее аллергенными для людей. Более того, использованием композиций изобретения становится возможным эффективный способ доставки более высоких количеств грибковых спор, представляющих интерес, к целевым популяциям членистоногих в хранилищах зерна и к их кутикулам, чем достигнуто до сих пор.

В следующем аспекте изобретения предлагается способ изготовления композиций изобретения, включающий стадии:

i) микронизирование частиц сухого гидрофобного носителя; и

ii) смешивание сухих спор Beauveria bassiana c частицами указанного носителя.

В следующем аспекте изобретения предлагается способ регулирования заражения членистоногими хранилищ для зерна в месте для хранения зерна, где сложные частицы согласно изобретению представлены на поверхностях места для хранения зерна, посредством

i) накопления сложных частиц в аппарате для опыливания;

ii) высвобождения указанных частиц из указанного аппарата для опыливания и в указанное место для хранения зерна.

В другом аспекте изобретения предлагается способ регулирования заражения членистоногими хранилищ зерна в месте для хранения зерна, где сухая порошковая композиция согласно изобретению представлена на поверхностях места для хранения зерна.

В еще следующем аспекте изобретения предлагается применение сложной частицы согласно изобретению в контроле заражения членистоногими хранилищ зерна в местах для хранения зерна.

В еще следующем аспекте изобретения предлагается применение сухой порошковой композиции изобретения в контроле заражения членистоногими хранилищ зерна в местах для хранения зерна.

Биологически чистая культура нового изолята Beauveria bassiana была сохранена в CABI, Bakeham Lane, Egham, Surrey, TW20 9TY, UK 11 мая 2010 согласно договору Budapest Treaty для сохранения микроорганизмов и соответствовала депозитному номеру IMI 398548.

Далее следуют примеры и фигуры, иллюстрирующие изобретение. Следует понимать, что прописи примеров и фигуры не должны восприниматься как ограничение изобретения любым способом.

Фигуры

Фиг.1: Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа для спор изолята IMI 398548 Beauveria bassiana, смешанных с (а) каолином, (b) каолином, покрытым стеариновой кислотой, (с) каолином, покрытым карнаубским воском, (d) диатомовой землей, (e) диатомовой землей, покрытой стеариновой кислотой, и (f) диатомовой землей, покрытой карнаубским воском. Споры идентифицируются как 2-3 мкм вогнутые диски.

Фиг.2: Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа для спор изолята IMI 398548 Beauveria bassiana, смешанных с (а и b) частицами карнаубского воска. Споры идентифицируются как 2-3 мкм вогнутые диски.

Фиг.3: Изображения с помощью сканирующего электронного микроскопа для кутикулы Oryzaephilus surinamensis после действия овсяных хлопьев, обработанных смесью частиц карнаубского воска и спор изолята IMI 398548 Beauveria bassiana (а и b). Частицы карнаубского воска и споры можно четко увидеть приклеивающимися к кутикуле насекомого, особенно вокруг чувствительных подмышек. Частицы карнаубского воска идентифицируются как 2-10 мкм неровные частицы и споры как 2-3 мкм вогнутые диски.

Фиг.4: Средний % зерновых жуков, трех видов, гибель в каждой категории обработки на 28 сутки после экспозиции обработок.

Фиг.5: Средние среднеобъемные диаметры (VMD) порошка карнаубского воска/композиций спор с различными отношениями воска к спорам и с воском, микронизированным при различных скоростях. Черный столбик изображает чистые споры (0Е - нет карнаубского воска). Замкнутые столбики изображают стандартные ошибки.

Раздел примеров

1. Основные принципы изобретения

Данный раздел содержит подробное описание того, почему частицы карнаубского воска выбраны в качестве подходящего носителя для спор B. bassiana, предназначенных для применения против членистоногих в хранилищах зерна, таких как жуки в хранилищах зерна, как получены биопестицидные препараты, откуда поставляются материалы/продукты, и эффективности тестирования препаратов в поле.

2. Краткое изложение сущности изобретения

Использование карнаубского воска в смеси со спорами B. bassiana, изолятом IMI 398548, для контроля насекомых в хранилище в заготовленном зерне и для обработки окружающих сред представляет собой особенно применимую комбинацию по нижеследующим причинам:

- Одни только споры являются маленькими и достаточными, чтобы представлять опасность для дыхания, но включение частиц карнаубского воска с определенными среднеобъемными диаметрами частицы в споры увеличивает средний диаметр размера частицы выше порога опасности.

- Споры прилипают к внешней поверхности частиц карнаубского воска и становятся близко размещенными. Наблюдали, что близкое размещение является значительно меньшим, когда споры смешаны с другими порошкообразными частицами аналогичного размера частиц.

- Частицы карнаубского воска прилипают к кутикулам насекомого посредством электростатического притяжения, таким образом, карнаубский воск транспортирует споры к сайту инфекции членистоногого.

- Когда сложная частица спора:карнаубский воск прилипает к насекомому, то наблюдалось, что споры отделяются от частицы карнаубского воска и прикрепляются предпочтительно к кутикуле членистоногого, таким образом споры “доставляются” к кутикуле членистоногого с помощью частицы карнаубского воска как компонента сложной частицы.

- При оценке в окружающей среде хранилища зерна, композиция частица карнаубского воска:изолят Bb (IMI 398548) приводила к более высоким уровням смертности трех целевых членистоногих вредителей в хранилище зерна (жуки в хранилище зерна), чем композиция на основе масла с одинаковой концентрацией спор.

3. Введение

Данные исследования создали часть научной программы по разработке применения грибковых спор, чтобы снижать применение химического пестицида в хранилище и в средах, окружающих места переработки продуктов питания. Главная задача данной программы состояла в том, чтобы разработать на основе патогена препарат для трещин и щелей, предназначенный для обработки как пустого продовольственного, так и заполненного бункера. Вместо обычно применяемых грибковых спор прямо в трещины и щели, данная научная программа исследовала перспективы применения носителей, включающих инертный порошок, частицы карнаубского воска (Exosect Ltd, Winchester, UK), для доставки грибковых спор. Порошок микронизированного карнаубского воска проявляет электростатические свойства и, как было показано, прилипает к заряженным кутикулам насекомого за счет электростатического притяжения.

4. Карнаубский воск как носитель для зернового микопестицида

Данное исследование показывает, что для изолятов, пригодных для контроля сельскохозяйственных вредителей в условиях, присущих местам для хранения (зерна), важно улучшать поглощение вредителями грибковых спор, их развитие на членистоногих вредителях и их проникновение внутрь вредителей. Bb споры также представляют значительную опасность для дыхания, если они применяются только отдельно, так как среднеобъемный диаметр спор равен только 2-3 мкм. Было показано, что образец дуста, содержащий 50% по объему частиц с аэродинамическим диаметром ≤10 мкм, представляет собой значительную торакальную опасность как пыль, и содержащий 50% частиц с диаметром ≤4 мкм представляет собой значительную опасность для дыхания (British Standards Institution EN481, 1993). Опасность, представляемая спорами Bb, является более высокой, чем опасность от инертного дуста из-за белковой природы продукта, производящего их вдыхаемые аллергены (Westwood). Поэтому важно исследовать системы доставки и потенциальные носители спор, которые могли бы усиливать их поглощение и удерживание на членистоногих вредителях и их безопасное применение. Карнаубский воск при смешивании со спорами мог бы, посредством электростатического притяжения, усиливать поглощение и удерживание грибковых спор вредителями хранилища, попутно также увеличивая средний размер частиц смеси выше порога для вдыхаемой опасности. Для 50% по объему частиц карнаубского воска всегда характерен размер >10 мкм, как измерено лазерной дифракцией при повторном анализе партии в фирме Exosect Limited.

4.1. Работа, проведенная фирмой Exosect

Заявители проводили оценку пригодности частиц карнаубского воска в качестве носителя для спор Bb при сравнении с другими порошками. Заявители оценивали прилипаемость спор порошковых частиц карнаубского воска под сканирующим электронным микроскопом (SEM). Диатомовую землю (DE) и каолиновую глину выбирали для сравнения с частицами карнаубского воска, так как они содержат вещество из тонкодисперсных частиц, применяемое в настоящее время при обычных способах контроля насекомых. Способность спор прилипать к каждому из порошков оценивали под SEM. Способность порошка и спор смешиваться с последующим прилипанием к кутикулам жуков оценивали исследованием обработанных жуков, O. surinamensis, под SEM.

DE и каолиновую глину либо смешивали непосредственно с сухим аттенуированным изолятом Bb (IMI 398548), либо их готовили в виде препарата с покрытиями из стеариновой кислоты или карнаубского воска (расплавленного карнаубского воска) расплавлением компонентов в сосуде, охлаждением и затем микронизированием в мельнице с использованием способов, известных в данной области. Все семь типов порошков смешивали с грибными спорами в отношении 5:1 (мас./мас.) и исследовали под SEM. Затем десять жуков (O. surinamensis) в течение 48 ч в чашках Петри подвергали действию 10 г овсяных хлопьев, содержащих 0,15 г смеси частицы карнаубского воска и спор в отношении 2:1 (мас./мас.). Жуков затем удаляли для очистки овсяных хлопьев в течение 24 ч и потом исследовали под SEM.

Порошок каолиновой глины и частицы DE, использованные в данных исследованиях, были составлены из частиц различных размеров (диаметр от 1-5 мкм) и были неправильной формы. У небольшого числа спор наблюдалось приклеивание к внешней стороне частиц каолина или DE; многие споры оставались несвязанными в пределах обеих смесей (фиг.1а и 1d). Когда каолин и DE готовили в виде препарата с покрытием из стеариновой кислоты, размер частиц повышался и смеси становились комковатыми, но прилипаемость спор казалась увеличенной (фиг.1b и 1е). Покрытие частиц карнаубского воска приводило к образованию порошком каолина больших комков с размерами некоторых частиц >100 мкм; однако споры, как оказалось, прилипали на всем протяжении внешней стороны данных частиц. Когда DE покрывали карнаубским воском, размер частиц увеличивался, но он не был таким большим как в случае каолина, покрытого карнаубским воском; споры хорошо прилипали к покрытым частицам (фиг.1с и 1f). Прилипаемость спор была лучше, когда каолин и DE покрывали карнаубским воском, чем в случае со стеариновой кислотой. Для всех данных препаратов с покрытием требовалась бы дополнительная обработка для уменьшения размера частиц и комкования.

Когда только одни частицы карнаубского воска смешивали со спорами, для всех спор наблюдалось их прилипание вокруг внешних поверхностей частиц воска (фиг.2а и 2b) и не потребовалась бы дополнительная обработка для уменьшения размера частиц. Оценивали в % площадь поверхности порошка-носителя, покрытого спорами, которая составляла приблизительно <5% для каолина и DE, 10-20% для каолина, покрытого карнаубским воском, и DE, и 50% для одного карнаубского воска. Только один карнаубский воск приводил к наилучшему покрытию спорами и это был самый легкий препарат для изготовления, потому что он был непосредственно смешан без первого нанесения покрытия.

Когда жуков в хранилище зерна обрабатывали смесью спор и карнаубского воска, споры и частицы карнаубского воска легко идентифицировали по прилипанию к кутикулам жука O. surinamentis, особенно в кутикулярных впадинах и структурах, таких как чувствительные подмышки (фиг.3а и 3b). Заявители также наблюдали, что споры больше не прилипают к внешней стороне частиц карнаубского воска, но теперь прилипают непосредственно к кутикуле насекомого.

В заключение, сродство спор Bb и частиц карнаубского воска служит доказательством того, что карнаубский воск мог бы действовать как подходящий носитель для спор, и мог быть лучшим по отношению к другим порошкам с аналогичными диапазонами размера частиц. SEM-изображения жуков O. surinamentis, обработанных смесью карнаубского воска и спор, показали, что споры отделялись от частиц карнаубского воска и прикреплялись к кутикуле насекомого. Таким образом, несмотря на отличный уровень прилипания спор к частицам карнаубского воска, споры явно имели более высокое сродство для кутикулы насекомого, чем частицы карнаубского воска. Boucias et al. (1988) показали, что гидрофобность кутикулы насекомого и конидиальной стенки служила для опосредования прилипания, а не электростатической силы. Способность порошка носителя располагаться совместно со спорами и затем отделяться от спор во время контакта с насекомым представляет собой желательные признаки системы доставки спор.

Приготовление препарата на основе карнаубского воска

Для целей определения оптимального состава препарата фирма Exosect исследовала влияние среднеобъемного диаметра (VMD) частицы карнаубского воска и отношения карнаубского воска к аттенуированным спорам на конечный VMD смеси. Цель исследования состояла в определении композиций препарата, которые находились бы внутри безопасных пределов VMD. Выбирали три скорости, которые приводили к партиям карнаубского воска с VMD, равным 15,12, 34,14 и 62,33 мкм. Аттенуированные споры (нагретые в печи) штамма Beauveria bassiana, IMI 398548, поступали от CABI (Bakeham Lane, Englefield Green, Egham, Surrey, TW20). Каждую партию карнаубского воска смешивали со спорами при соотношениях (мас./мас.), равных 3:1, 1:1 и 1:3, в отдельных сосудах для образцов. Для каждого препарата делали образцы в трех повторностях. Применяя лазерную дифракцию при давлении 400 Па (=4 мбар) (Sympatec: RODOS, присоединенный к HELOS H2098), измеряли VMD частиц и X50 определения (диаметр частиц, в которых 50% частиц являются одинаковыми или более мелкими) каждого образца, а также повторных образцов из партий беспримесного карнаубского воска и беспримесных спор.

Средний VMD для каждого типа препарата вычисляли из трех повторностей (фиг.5). Образцы беспримесных спор с частицами диаметра 2,49±0,0173 мкм, как указано посредством Х50 (вплоть до 50% спор имели размер частиц ≤2,49±0,0173 мкм), действительно имели средний VMD в 10,41 мкм ± 0,97 мкм из-за присутствия нескольких комков, однако это очень близко к торакальному пределу опасности дыхания, указывая на то, что споры сами по себе могли представлять значительную опасность для дыхания. Из данного анализа было ясно, что включение порошка карнаубского воска увеличивало VMD по сравнению с беспримесными спорами.

Необработанные данные по VMD трансформировали в логарифмы для их нормализации, затем к этим данным применяли дисперсионный анализ (ANOVA) c показателями по скорости размола и процентному содержанию карнаубского воска. Метод ANOVA сопровождался тестом Тьюки для попарных сравнений, когда имелись значительные влияния для определения различий между группами обработки. Анализ показал, что имелись значительные различия в VMD между одной или несколькими группами обработки. Имело место значительное влияние скорости микронизации и процентного содержания карнаубского воска на VMD препарата (ANOVA: F_2,35=144,245, P <0,001 и F_3,35=144,245, P<0,001, соответственно). Отсутствовала статистически значимая разность в VMD между препаратами, которые содержали 25 или 50% карнаубского воска, но VMD в препаратах с 75% карнаубского воска был значительно больше. Препараты, которые были приготовлены с карнаубским воском, микронизированным при 2500, 4000 или 8000 об/мин, все значительно отличались друг от друга, причем самая медленная скорость размола, равная 2500 об/мин, приводила к препаратам с самым большим VMD.

Эти данные указывают, что скорость размола и % карнаубского воска можно использовать для контроля VMD в конечном препарате. Имелись меньшие различия между препаратами, мик