Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение

Пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способ его получения, и применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к областям биотехнологии и фармацевтики, в частности относится к пегилированному конъюгату варианта рекомбинантного консенсусного интерферона и способам его получения, и применению. Настоящее изобретение является продолжением патента на изобретение под названием “Производное человеческого α-интерферона с противовирусной активностью” (№ патента ZL01102915.3).

Предшествующий уровень техники

Еще в 1957 году Issacs и др. открыли фактор, вырабатываемый при вирусной инфекции для сопротивления инфекции вирусом и препятствования размножению вируса, который назвали интерфероном (IFN). Интерфероны являются группой гликопротеинов, вырабатываемых посредством экспрессии генома пермиссивной клетки после воздействия на пермиссивную клетку инактивированного или активного вируса. Активность и антигенность молекул зависят от белка и несвязаны с гликозильной группой. На основе источника и структуры IFN классифицируют на IFN-α, IFN-β и IFN-γ, которые продуцируются лейкоцитами, фибробластами и активированными Т-клетками. IFN-α является мультифакторным продуктом с более 10 подтипами, которые обладают практически одинаковой биологической активностью. В дополнение к осуществлению противовирусной функции IFN обладает функциями противоопухолевой активности, иммунной регуляции и контроля пролиферации клеток, повышения температуры тела и т.д. Большая часть лекарственных препаратов, которые применяются в клинической практике, получена посредством генетической рекомбинации.

IFN является лекарственным препаратом первой линии лечения с клинически подтвержденной эффективностью применительно к хроническому вирусному гепатиту. Включаются те, которые имеют природные структуры, в том числе IFNα-2a и IFNα-2b. Оба из них являются интерфероном с краткосрочными эффектами, характеризующимся коротким периодом полувыведения (4~16 часов), а концентрация в сыворотке понижается через 24 часа после инъекции. Фармакокинетический процесс в организме человека влияет на долгосрочные эффекты, эффекты лечения в отношении противовирусного лечения. На основе 3~6 млн Ед./кг и введения 3 раза в неделю in vivo уровень интерферона наблюдается в виде обычной “кривой пик-впадина”. Значительное колебание уровня интерферона в сыворотке делает возможным восстановление уровня вируса и приводит к устойчивости к лекарственному средству со снижением эффектов лечения. При этом интерферон с краткосрочными эффектами характеризуется сильными неблагоприятными эффектами, плохой переносимостью организмом человека на основе долгосрочных эффектов, сильной иммуногенностью и другими недостатками. Следовательно, интерферон с краткосрочными эффектами модифицируют для продления периода полувыведения из организма человека, поддержания стабильности концентрации в крови в организме человека, улучшения эффективности лечения вирусного гепатита и ослабления побочных эффектов.

Полиэтиленгликоль (PEG) представляет собой вид полимера, который является безопасным, нетоксичным и неактивным и обычно применяется для модификации белковых лекарственных препаратов. После модификации белок становится устойчивым к ферментативному гидролизу, имеет повышенную растворимость в воде и сниженную иммуногенность и токсичность (Inada et al., J. Bioact. And Compatible Polymers, 5:343(1990). Delgalo et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier systems, 9:249 (1992) katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993)). В патентах Китая, выданных Hoffman La Roche, ZL93116479.6 и ZL97105433.9 раскрывается получение рекомбинантного PEG-интерферона, а в патенте Китая, выданном Schering Company, с номером 200580032850.2 раскрывается получение реагента для стабильного PEG-интерферона. В настоящее время существуют два вида человеческого α-интерферона, модифицированного при помощи PEG (PEGASYS от Hoffman La Roche и PEGINTRON от Schering), которые применяют для лечения хронического гепатита C и гепатита B. После пегилирования обоих скорость почечного клиренса снижалась при продленном периоде полувыведения (30~16 часов) и сниженной иммуногенности, причем необходимым является только одно введение каждую неделю. Они намного превосходят краткосрочные эффекты применительно к клиренсу вируса HCV/HBV. Показатель ближнесрочной реакции применительно к лечению гепатита C (РНК HCV) достигает 69%, а показатель продолжительного ответа достигает 39%, причем в отношении обычного интерферона он составляет только 7%. Отрицательный показатель после лечения гепатита HBeAg достигает 37%, комплексный показатель ответа (а именно: HBeAg-отрицательный, ингибирование ДНК HBV и нормализация ALT) составляет 35%, и 61% пациентов являются HBV-ДНК-отрицательными (<400 копий/мл), а 7% пациентов являются HbsAg-отрицательными. После лечения гепатита при помощи обычного интерферона 3 показателя составляют только (15%, 25% и 12%). Не наблюдали HBsAg-отрицательных пациентов (Reddy KR et al. Hepatology, 2001,33:433-438. Jessner W. et al. J Viral Hepat.2003, 10:37-42. Shiffman ML et al. Hepatology, 2004; 40(4, suppl 1):314A. Davis GL et al. Hepatology, 2003;38:645-52. Janssen HL et al. lancet, 2005; 365:123-129. Cooksley WG et al. J Viral Hepat, 2003; 10:298-305.).

Точкой модификации рекомбинантного человеческого α-интерферона 2a (PEGASYS), модифицированного при помощи PEG, является лизин, а точкой модификации рекомбинантного человеческого α-интерферона 2b (PEG-Intron), модифицированного при помощи PEG, является гистидин. Как описано в документах (Miller DL et al. Science, 1982, 215:689-690; Radhakrishnan R. et al. Structure, 1996; 4(12): 1453-1463; Karpusas M. et al. Proc. Natl. Acad. sci. USA 1997, 94:11813-11818), зоны образования соединения IFN-α с рецепторами включают AB-петлю (Arg22, leu26, Phe27, leu30, lys31, Arg33, His34), спираль B (Ser68), спираль C (Thr79, lys83, Tyr85, Tyr89), спираль D (Arg120, lys121, Gln124, lys131, Glu132) и спираль E (Arg144, Glu146). Лизин, модифицированный в PEGASYS, и гистидин, модифицированный в PEG-Intron, находятся в пределах рецепторных зон, неблагоприятных в отношении соединения интерферона и рецепторов. Помимо того, конечный продукт, модифицированный при помощи PEG, модифицируют в одной точке исходя из отсутствия специфики. К примеру, PEGASYS представляет собой смесь, модифицированную в основном по Lys131 (7 точек модификации), а PEG-Intron представляет собой смесь, модифицированную в основном по His34 (4 точки модификации).

Посредством модификации при помощи PEG в одной точке воплощается однородность молекулярного веса и структуры для повышения биологической активности и безопасности in vivo. Применяли несколько подходов для воплощения специфики модификации интерферона в одной точке при помощи PEG. (1) В WO 2006/004959 раскрывается способ со спецификой связывания аминокислотной последовательности IFNα-1b с PEG-малеимидом и его продуктами по 86-му свободному цистеину (Cys86); (2) в WO 2008/074230 раскрывается IFNα с 85-й или 86-й аминокислотой, мутированной в Cys, а EG-малеимид (этиленгликоль-малеимид) применяют для модификации со спецификой в фиксированной точке; (3) PEG со спецификой по N-концу, связанный с активной группой, применяют для модификации N-конца интерферона (например, патенты Китая CN1229388C, CN100478359C и CN101381409A).

Модифицированный PEG на N-конце находится на большом расстоянии от зоны соединения интерферона с рецепторами, что обеспечивает анализ идеальной точки модификации в структуре. Однако в 1-м положении на N-конце природного α-интерферона находится цистеин, который образует пару дисульфидных связей с цистеином в 99-м положении (дисульфидная связь является крайне важной для биологической активности). Модификация при помощи PEG в фиксированной точке применяется по отношению к N-концу α-интерферона, при этом с низкой степенью модификации и значительной биологической активностью.

Для улучшения активности природного интерферона в America Amgen Company синтезировали искусственный интерферон с наименованием продукта INFERGEN. INFERGEN является искусственным рекомбинантным α-интерфероном, оптимизированным и объединенным с помощью компьютера, причем его последовательность составлена из 20 видов подтипов природного α-интерферона посредством оптимизации группирования, а его противовирусная активность увеличивается в 5~10 раз по сравнению с таковой природного интерферона. В 1997 году FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) одобрило INFERGEN для лечения гепатита C, а результаты исследования указывают на то, что эффекты лечения намного превосходят таковые обычного интерферона. В патентах США US4695623, US4897471 и US5372808 раскрывается, что консенсусный интерферон обладает широким спектром интерфероновой активности, причем характеризуется относительно сильными противовирусной, противоопухолевой активностями и активацией NK-клеток. Однако так же, как и природный α-интерферон, INFERGEN имеет недостатки, заключающиеся в слабой стабильности, коротком in vivo периоде полувыведения и сильной иммуногенности. При этом в 1-м положении на N-конце природного α-интерферона находится цистеин, который образует пару дисульфидных связей с цистеином в 99-м положении, что не позволяет эффективно модифицировать N-конец. Несмотря на то что в патенте США US005985265 A, выданном Amgen Company, раскрывается подход к модификации N-конца белка INFERGEN, степень модификации и биологическая активность после модификации намного ниже по сравнению с модификацией N-конца другого белка (рекомбинантного колониестимулирующего фактора гранулоцитов человека G-CSF и рекомбинантного гормона роста человека GH и т.д.).

Для осуществления модификации N-конца интерферона и исходя из принципа максимума последовательности из одного и того же источника, изобретатель сконструировал совершенно новую последовательность интерферона, именуемого (суперпротивовирусным интерфероном, кратко называемым IFN-SA) и переименованного в вариант рекомбинантного консенсусного интерферона в соответствии с принципом присвоения названий интерферону. Содержит 171 аминокислоту, причем на N-конец вводятся последовательности из пяти аминогрупп Gly Ser Gly Gly Gly и осуществляется модификация в фиксированной точке на N-конце. Структура отличается от таковой INFERGEN, а in vitro противовирусная активность увеличилась на 50%. Новая структура и ее рекомбинантное получение, а также применение против вирусных заболеваний были запатентованы в качестве изобретения в Китае, номер патента ZL01102915.3.

Настоящее изобретение предоставляет способ получения и применение полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (IFN-SA) (кратко называемого PEG-IFN-SA). В настоящем изобретении выбирают PEG-ALD, 20 кДа, с группой пропионового альдегида, связанной с аминокислотой со спецификой по N-концу, в качестве модификатора для модификации при условиях pH 4,5~6 и получают пегилированный конъюгат варианта рекомбинантного интерферона (PEG-IFN-SA). При помощи этого способа получения химический модификатор одной точки по отношению к N-концу повышает стабильность белка, продлевает период полувыведения и снижает иммуногенность и побочные эффекты и т.д. Ожидается, что это будет лекарственный препарат для долгосрочных эффектов интерферона в отношении предупреждения и лечения вирусного инфекционного заболевания, гиперпластических заболеваний, повышения иммунитета и т. д.

Описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет способ получения полиэтиленгликолевого конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (IFN-SA) с химической модификацией в фиксированной точке по отношению к N-концу. Конъюгат характеризуется хорошей стабильностью, длительным периодом полувыведения, сниженными иммуногенностью и неблагоприятными эффектами и применяется для получения лекарственного препарата для предупреждения и лечения вирусного инфекционного заболевания, гиперпластических заболеваний, повышения иммунитета и т.д.

Настоящее изобретение относится к виду полиэтиленгликолевого конъюгата химически модифицированного IFN-SA.

IFN-SA является вариантом рекомбинантного консенсусного интерферона, отличающимся аминокислотной последовательностью указанного IFN-SA, представленной в SEQ ID No: 1:

.

Полиэтиленгликолевый конъюгат IFN-SA характеризуется тем, что полиэтиленгликолевое производное-модификатор соединено с α-аминогруппой на N-конце производного варианта рекомбинантного интерферона при помощи амидной связи.

Указанное полиэтиленгликолевое производное-модификатор характеризуется активацией при помощи альдегидной группы на одном конце полиэтиленгликолевого производного-модификатора, а другой конец полиэтиленгликолевого производного представляет собой монометокси.

Монометоксиполиэтиленгликоль с активацией при помощи альдегидной группы характеризуется тем, что включает без ограничения пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля (mPEG-ALD), масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, уксусный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля и пентаналь монометоксиполиэтиленгликоля. Предпочтительным является пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля (mPEG-ALD). В зависимости от степени связывания молекула полиэтиленгликоля может быть любой молекулой с молекулярным весом, находящимся в диапазоне 10 кДa~40 кДa, а предпочтительный молекулярный вес молекулы полиэтиленгликоля равен 20 кДа. Молекула полиэтиленгликоля может быть с прямой цепью или с разветвленными вариантами и может быть с одной цепью, с двумя цепями или с несколькими цепями. Предпочтительной является одноцепочечная молекула полиэтиленгликоля с прямой цепью.

Настоящее изобретение предоставляет способ получения полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA. Специалист в соответствующей области может выбрать тип структуры, молекулярный вес и необходимый расход полиэтиленгликоля. В соответствии со способом получения, предоставленным в данной заявке, в зависимости от структуры и свойств белковой молекулы после модификации осуществляется модификация кислотности-основности, реакционной системы и молярного соотношения полиэтиленгликоля.

Объясняется способ получения конъюгата, принимая IFN-SA, модифицированный в фиксированной точке на N-конце при помощи mPEG, 20 кДа, в качестве предпочтительного.

Что касается получения IFN-SA, смотри патент ZL01102915.3.

Как известно в данной области техники, при условиях в присутствии цианоборгидрида натрия PEG с альдегидной группой реагирует с первичным амином в реакциях восстановительного аминирования. Альдегидная группа отличается от другой электрофильной активной группы лишь тем, что реагирует с цианамидом. Хотя активность альдегидной группы ниже, чем реакционная активность NHS, необходимыми являются лишь мягкие условия реакции, легко обеспечивающие соединение PEG с поверхностями белка или других материалов. Следовательно, при низких значениях pH mPEG-альдегид селективно реагирует с N-концом белка. Условия реакции являются следующими: значение pH 4,0~7,0, содержание соли в буферной системе 10~100 ммоль/л и температура 4~25°С, причем время реакции составляет 1~72 часа, а молярное соотношение в реакции PEG:белок составляет 1:2~1:10. При обычных условиях продукт модификации N-конца, полученный при низкой температуре, низком pH и времени реакции, обеспечивается с большой однородностью и высокой степенью превращения в реакции.

Методика получения указанного конъюгата описывается в настоящем изобретении, причем добавляется раствор IFN-SA в фосфатном буфере и mPEG-ButyrALD, 20 кДа, к 20 мМ цианоборгидрида натрия для осуществления реакции, применяются обычные способы для разделения и очистки, фильтрации, стерилизации и получения конъюгата IFN-SA по настоящему изобретению. Предпочтительный фосфатный буферный раствор характеризуется pH 4,0-6,0, концентрацией 50-100 ммоль/л, предпочтительной температурой 4-10°С, причем время реакции составляет 24~48 часов, молярное соотношение в реакции PEG:IFN-SA составляет 1:2~1:5, а степень модификации достигает более 50%. Выбор условий модификации и подходы к модификации подробно описываются в примере.

Способ очистки конъюгата по настоящему изобретению: образец после осуществления реакции IFN-SA и полиэтиленгликоля диализируют при помощи 5xDDW и загружают в SP Sepharose F.F. После уравновешивания с помощью 10 мM уксусной кислоты - ацетата натрия (pH 5,5) и уравновешивания раствора осуществляют элюирование с помощью ионов соли 1M NaCl и тестирование чистоты прошедших и элюированных образцов при помощи электрофореза и RP-HPLC (обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии). Соединения с полиэтиленгликолем удаляют из высокомолекулярного полимера при помощи молекулярного сита Superdex75 (или Sephacryl S-200), при условиях 10 мМ PB, pH 7,4. Качественные подходы на основе структуры и массы включают масс-спектрометрию, пептидное картирование при помощи масс-спектрометрии, RP-HPLC, Gel-HPLC (ВЭЖХ с гель-фильтрацией) и SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).

Молекулу полиэтиленгликоля (ALD-mPEG20K) с активацией при помощи пропионового альдегида и молекулярным весом 20 кДа применяют в качестве модификатора. На протяжении по меньшей мере 10 серий экспериментов в лабораторном масштабе можно получить более 1 г полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA с чистотой более 95% (код: PEG20-IFN-SA), степенью модификации приблизительно 50%, причем для соединений, немодифицированных по N-концу, она составляет менее 3%, а степень противовирусной активности составляет ≥1,2x10 ⁷ МЕ/мг. При помощи фармакокинетики показано, что период полувыведения у яванского макака равен 34,5 часа, причем он намного более длительный, чем период полувыведения IFN-SA, равный 3 часа. При помощи токсичности у яванского макака в течение 6 месяцев показано, что иммуногенность намного ниже, чем IFN-SA. В условиях водного раствора и при температуре 4°С конъюгат может быть стабильным в течение 24 месяцев. Следовательно, полиэтиленгликолевый конъюгат IFN-SA, описанный в настоящем изобретении, характеризуется долгосрочными эффектами, стабильностью и низкой иммуногенностью.

В соответствии с описанным способом получения выбирается масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, 10 кДа, и связывается с аминогруппой на N-конце IFN-SA с получением PEG10-IFN-SA. Выбирается PEG-NHS, 40 кДа, и связывается с аминогруппой на N-конце IFN-SA с получением PEG40-IFN-SA. In vitro противовирусная активность PEG10-IFN-SA должна составлять ≥7,0x10⁷ Ед./мг, при этом период полувыведения равен 15,3 часа. In vitro противовирусная активность PEG40-IFN-SA составляет ≥4,0x10⁶ Ед./мг, при этом период полувыведения равен 42,29 часа. При увеличении молекулярного веса PEG для связывания период полувыведения продлевается, а in vitro противовирусная активность намного понижается. В настоящем изобретении установлено, что влияния PEG с прямой цепью на in vitro активность IFN-SA намного меньше, чем модификации при помощи PEG с разветвленной цепью. Следовательно, модификация IFN-SA при помощи связывания с одноцепочечной PEG с прямой цепью, 20 кДа, является предпочтительной.

PEG-IFN-SA, производимый в соответствии с описанными выше способами, получают в виде раствора для инъекций или лиофилизированного порошка для инъекций, мази, эмульсии или аэрозоля для наружного применения, и таблетки для растворения в щечном кармане, капсулы и таблетки для перорального применения при помощи соответствующей методики получения.

Другой характеристикой полиэтиленгликолевого конъюгата IFN-SA является то, что конъюгат получают в виде комбинации с лекарственным препаратом для клинического лечения, эффективной дозой любого конъюгата и разбавителем, вспомогательным средством или носителем для применения лекарственного препарата.

Настоящее изобретение относится к молекуле PEG-IFN-SA, которая применительно к клиническому лекарственному препарату является эффективной в композиции фармацевтического препарата, а фармацевтический препарат включает без ограничения: разбавитель, стабилизатор, консервант, растворяющее средство, эмульгатор, вспомогательное средство, носитель и т.д. 1) Разбавление раствора: фосфатный, ацетатный, цитратный и другие буферные растворы; 2) значение pH и ионная сила; 3) детергент, агент, вызывающий диссоциацию комплексов: сорбит, Tween-20, Tween-80; 4) наполнители: сорбит, глюкоза, сахароза, маннит и глицерин. 10 мM PB (pH 7,2), сорбит и Tween-80 являются предпочтительными для фармацевтического препарата PEG-IFN-SA. Эффективная доза эффективной композиции относится к эффективной дозе для лечения или предупреждения с учетом фактора наблюдаемого молекулярного веса и веса пациента, и других факторов. Эффективная доза согласно настоящему изобретению составляет 0,5 мкг~9 мкг/кг за один раз.

Способом введения фармацевтического лекарственного препарата PEG-IFN-SA является парентеральное введение, в том числе без ограничения подкожная инъекция, внутримышечная инъекция, внутривенная инъекция, люмбальная инъекция, ингаляция, подъязычное или трансдермальное введение. Цикл введения представляет собой один раз в 3~14 дней.

В настоящем изобретении раскрываются способы применения IFN-SA и полиэтиленгликолевого конъюгата для предупреждения и лечения вирусных инфекционных заболеваний, гиперпластических заболеваний, усиления иммунитета и предупреждения и лечения других заболеваний.

В одном варианте осуществления характеристика указанной вирусной инфекции включает без ограничения инфекцию вирусом гепатита, инфекцию папилломавирусом человека, инфекцию вирусом простого герпеса, инфекцию вирусом иммунодефицита человека, инфекцию вирусом EB, инфекцию SARS и инфекцию вирусом гриппа. Характеристика указанной инфекции вирусом гепатита включает без ограничения инфекцию вирусом гепатита C, вирусом гепатита B, вирусом гепатита A, вирусом гепатита D и вирусом гепатита E. Предпочтительными являются инфекции вирусом гепатита C и вирусом гепатита B.

В другом варианте осуществления указанные гиперпластические заболевания характеризуются тем, что включают без ограничения доброкачественную опухоль и злокачественную опухоль. Злокачественная опухоль включает без ограничения хронический миелоидный лейкоз, опухоль меланинобразующей ткани, рак почки и рак печени.

Также предлагается введение комбинированного лекарственного препарата, включая без ограничения рибавирин и ламивудин. При применении полученных противовирусных лекарственных препаратов широкого спектра против вируса гепатита C ингибируется синтез ДНК и РНК вируса, например, при комбинированном введении с рибавирином; при этом против вируса гепатита B обеспечивается применение с нуклеозидным противовирусным лекарственным препаратом, например комбинированное введение с ламивудином; для лечения злокачественной опухоли применяется вместе с другими лекарственными препаратами для лечения при помощи других химических веществ.

Предоставлено подробное описание изобретения, которое является хорошо понятным с учетом примеров, приведенных ниже. Примеры, описанные в данном документе, используются для объяснения, а не для ограничения настоящего изобретения.

Описание прилагаемых графических материалов

Прилагаемая фигура 1: фигура SDS-PAGE электрофореза применительно к реакции модификации при молярном соотношении IFN-SA и PEG, 1: соотношение 1:2 и 2: соотношение 1:3.

Прилагаемая фигура 2: фигура SDS-PAGE электрофореза перед и после модификации IFN-SA; из них: 1: IFN-SA перед модификацией, 2: продукты после модификации, 3: PEG20-IFN-SA после очистки; M: стандарт молекулярного веса белка.

Соотношение: 3: соотношение 1:4, 4: соотношение 1:5, 5: соотношение 1:6, M представляет собой стандарт молекулярного веса белка.

Прилагаемая фигура 3: фигура SDS-PAGE электрофореза IFN-SA, модифицированного при помощи PEG с различным молекулярным весом; M представляет собой маркер, 1 представляет собой PEG10K-IFN-SA, 2 представляет собой PEG20K-IFN-SA, а 3 представляет собой PEG40K-IFN-SA. На фигуре пегилированный белок IFN-SA, расположенный 3-им, имеет размер больше теоретического значения вследствие низкой скорости миграции.

Прилагаемая фигура 4: фигура RP-HPLC хроматограммы PEG20-IFN-SA; причем на фигуре PEG20-IFN-SA представлен в форме отдельного пика поглощения, при этом чистота составляет 98,7%.

Прилагаемая фигура 5: фигура редукционного анализа масс-спектрометрии после ферментативного расщепления трипсином PEG20-IFN-SA и IFN-SA; причем фигура A представляет собой фигуру, на которой представлен пептид IFN-SA, а фигура B представляет собой фигуру, на которой представлен пептид PEG20-IFN-SA. Между ними существует только различие по пикам пептидов. Сведения, которые касаются анализа различий, смотри в примере 3.

Прилагаемая фигура 6: кривая in vivo противовирусной биологической активности в зависимости от времени после дозирований (10 мкг/кг, 30 мкг/кг и 90 мкг/кг) посредством подкожной инъекции PEG20-IFN-SA; при этом ● представляет собой 10 мкг/кг, ○ представляет собой 30 мкг/кг и ▲ представляет собой 90 мкг/кг. По оси абсцисс отложено время (часы), а по оси ординат отложены единицы противовирусной активности в каждом мл крови (МЕ/мл).

Описание предпочтительных вариантов осуществления

Пример 1. Условия модификации варианта рекомбинантного консенсусного интерферона PEG20-IFN-SA

Раствор IFN-SA (концентрация 10 мг/мл, буфер 100 мM PB, pH 7,0) получен Chongqing Fujin Biology Medicine Co., Ltd., mPEG-ButyrALD-20 кДа (чистота >95%, относительный молекулярный вес 20x10³), приобрели от Beijing Jiankai Science & Technology Co., Ltd. раствор цианоборгидрида натрия (NaBH₃(CN), причем то, что находится в скобках, не является тем же, что и описание за скобками), приобрели от Sigma Company, соответствующие реактивы и растворы для SDS-PAGE, а также для анализа чистоты являются продуктами Shanghai Sangon. Магнитные мешалки с постоянной температурой (Jiangsu Zhongda Instrument Plant), прибор для электрофореза, SP Sepharose F.F., молекулярное сито Superdex75, хроматографическая система AKTA Explore и SDS-PAGE являются продуктами Pharmacia.

1. Влияния значения pH реакции на модификацию продуктов

Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB (pH 4,0, pH 5,0 и pH 5,5). Отбирают по 1 образцу каждого и добавляют к 1 моль/л исходному раствору NaBH₃(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. Взвешивают mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с молярным соотношением 1:4 (IFN-SA: mPEG-ButyrALD-20 кДа), добавляют в реакционный раствор IFN-SA при температуре 4°С, перемешивают при 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов. Осуществляют SDS-PAGE электрофорез образца и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.

Результаты эксперимента указывают на то, что в условиях pH 4,0, 5,0 и 5,5 показатели PEG1-IFN-SA составляют 18%, 31% и 40%. Степень модификации при pH 4,0 является минимальной, а степень модификации при pH 5,5 является максимальной.

2. Влияние на модификацию продуктов соотношения IFN-SA к PEG при модификации

Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5. Добавляют 1 моль/л исходный раствор NaBH₃(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. Отмеряют mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с молярным соотношением IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа A (1:2), B (1:3), C (1:4), D (1:5) и E (1:6). Перемешивают при температуре 4°С и 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов, осуществляют SDS-PAGE электрофорез образца и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.

Результаты эксперимента указывают на то, что если молярные соотношения IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа составляют A (1:2), B (1:3), C (1:4), D (1:5) и E (1:6), то показатели PEG1-IFN-SA составляют 18%, 27%, 39%, 40% и 41% (фигура 1). Если молярное соотношение PEG к модифицированному продукту достигает 1:4, то степень модификации не увеличивается, а реакция приводит к увеличению количества полимера, модифицированного при помощи PEG.

3. Влияния температуры и времени на модификацию продуктов

Раствор IFN-SA получают с концентрацией 2 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5. Добавляют 1 моль/л NaBH₃(CN) до конечной концентрации 20 ммоль/л. При массовом соотношении IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа 1:4 осуществляют реакцию в течение 48 часов при температуре 4°С и в течение 24 часов при температуре 25°С. Осуществляют SDS-PAGE электрофорез соответствующих образцов и определяют модификацию PEG20-IFN-SA. Результаты эксперимента указывают на то, что при температуре 4°С путем продления времени реакции достигают степени модификации, наблюдаемой при температуре 25°С. Однако модификация при температуре 4°С является более преимущественной в отношении активности и структуры IFN-SA.

4. Влияния IFN-SA на модификацию продуктов

Раствор IFN-SA получают с концентрацией 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл, 4,0 мг/мл при помощи буферного раствора 100 ммоль/л PB, pH 5,5; в общей сложности 4 образца. Добавляют в mPEG-ButyrALD-20 кДа в соответствии с массовым соотношением IFN-SA к mPEG-ButyrALD-20 кДа 1:4, перемешивают при температуре 4°С и скорости вращения 100 об/мин и осуществляют реакцию в течение 24 часов, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа соответствующих образцов и определяют степень модификации PEG20-IFN-SA.

Результаты эксперимента указывают на то, что если концентрации IFN-SA составляют 1,0 мг/мл, 2,0 мг/мл, 3,0 мг/мл и 4,0 мг/мл, то показатели PEG20-IFN-SA составляют 28%, 40%, 45% и 48%. При повышении концентрации белка модификация PEG20-IFN-SA увеличивается, и подходящей концентрацией является 3,0~4,0 мг/мл.

Пример 2. Разделение и очистка варианта рекомбинантного консенсусного интерферона PEG20-IFN-SA

Образец PEG-IFN-SA после модификации подвергают диализу при помощи 5xDDW, а после диализа образец загружают в хроматографическую колонку SP Sepharose F.F. Уравновешивают хроматографическую колонку SP Sepharose F.F при помощи буфера A (уравновешивают 10 мМ уксусной кислотой - ацетатом натрия, pH 5,5) и загружают образец. Элюируют с осуществлением элюирования 1 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,15 M NaCl, pH 5,5), элюирования 2 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,2 M NaCl, pH 5,5), элюирования 3 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,25 M NaCl, pH 5,5), элюирования 4 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,35 M NaCl, pH 5,5) и элюирования 5 (10 мМ уксусная кислота - ацетат натрия, 0,45 M NaCl, pH 5,5), получают пик прохождения и пик элюирования, осуществляют SDS-PAGE электрофорез для анализа образца. Отбирают образец PEG-IFN-SA после хроматографии на SP Sepharose F.F и очистки и загружают на молекулярное сито Superdex 75. Молекулярное сито для гель-фильтрации Superdex 75 уравновешивают при помощи 10 ммоль/л PB, pH 7,4. После уравновешивания загружают образцы, разделяют при помощи 10 ммоль/л PB, pH 7,4, при постоянном градиенте и получают основной пик, включающий PEG20-IFN-SA. Отбирают образец для осуществления анализа при помощи SDS-PAGE электрофореза (см. фигуру 2).

Результаты эксперимента указывают на то, что при помощи колонок SP Sepharose и Superdex G75 осуществляется разделение IFN-SA, модифицированного при помощи 1 PEG и модифицированного при помощи 2 PEG, и отдельного IFN-SA.

Пример 3. Полиэтиленгликоли, 10 кДа и 40 кДа, для модификации варианта рекомбинантного консенсусного интерферона

Соответственно, выбирают масляный альдегид монометоксиполиэтиленгликоля, 10 кДа, и пропионовый альдегид монометоксиполиэтиленгликоля с разветвленной цепью, 40 кДа (продукты Beijing Jiankai Biology Company), для модификации со спецификой в одной точке по N-концу IFN-SA при помощи способов, описанных в примере 1 и примере 2, и получения PEG10-IFN-SA и PEG40-IFN-SA (см. фигуру 3).

Пример 4. Физические и химические свойства пегилированного конъюгата варианта рекомбинантного консенсусного интерферона (PEG20-IFN-SA)

1. Чистота

Колонка для анализа при помощи анализирующей RP-HPLC представляет собой C18 (Waters Symmestry), при этом жидкость A подвижной фазы (0,1% TFA, 5% ацетонитрил) и жидкость B подвижной фазы (0,1% TFA, 95% ацетонитрил). Загруженный объем равен 20 мкл, скорость потока равна 1 мл/мин, градиент элюирования за 70 мин (количество жидкости A уменьшается от 100% до 30%, а количество жидкости B увеличивается от 0% до 70%), и длина волны при тестировании равна 214 нм. Результаты эксперимента указывают на то, что чистота PEG20-IFN-SA достигает более 95% (фигура 4).

2. Определение точек модификации PEG20-IFN-SA

Аминокислотная последовательность на N-конце PEG20-IFN-SA, определенная Proteome Analysis Center of Shanghai Institute for Biological Sciences of China Academy of Sciences (Центр протеомного анализа Шанхайского института биологических наук Китайской академии наук) при помощи оборудования для аминокислотного анализа, представляет собой SGG GCD LPQ THS LGN. Gly, находившийся в 1-м положении на N-конце до модификации, не обнаружили, что доказывает то, что точка была модифицирована при помощи PEG.

3. Анализ однородности точек модификации PEG20-IFN-SA

Модификацию продукта mPEG-ALD осуществляют исключительно по аминогруппе на N-конце. Однако в присутствии цианоборгидрида натрия вследствие различных условий модификации при помощи mPEG-ALD осуществляется модификация остатка лизина по ε-NH₂. Чтобы доказать, что в PEG20-IFN-SA при помощи PEG модифицирован только N-конец, выбирают исключающий частичный ферментативный гидролиз при помощи трипсина (Sigma Company, протеомный класс) пептидной связи лизина и аргинина на C-конце, на который оказывает влияние пространственное стерическое препятствие, при этом точка после модификации лизина в этом положении при помощи PEG не распознается трипсином и не расщепляется при помощи фермента. Сравнивают фигуры масс-спектрометрии пептидов из IFN-SA до и после модификации и получают однородность модификации при помощи PEG на N-конце образца.

Лиофилизируют и обессоливают IFN-SA и PEG20-IFN-SA, и растворяют до концентрации 2 мг/мл при помощи 1% NH₄HCO₃. Отбирают 0,9 мл каждого продукта, добавляют 50 мкл бычьего трипсина (массовое соотношение 1:50), после осуществления реакции в течение 24 часов при температуре 37°С добавляют 0,1 мл 0,1 моль/л DTT в качестве обработки для восстановления (37°С, 1 час) и получают фигуру масс-спектров пептидов после RP-HPLC и анализа при помощи масс-спектрометрии.

При сравнении фигуры 5A и фигуры 5B можно видеть, что пик пептида на 13,5 мин. на фигуре пептидов из образца немодифицированного IFN-SA отсутствует в PEG20-IFN-SA, при этом новый пик пептида на 37,9 мин обнаруживается на фигуре пептидов из PEG20-IFN-SA, а остальные пептидные пики и площади пиков являются практически одинаковыми. Молекулярный вес пептида на 13,5 мин, который отсутствует в PEG20-IFN-SA, а именно 1-го пептида IFN-SA (последовательность представляет собой GSGGGCDLPQTHSLGNR), равен 1655, а на 37,9 мин обнаруживается пегилированный пептид. Сравнивают фигуры масс-спектрометрии пептидов, причем не обнаруживаются другие фрагменты, модифицированные при помощи PEG. Доказано, что запатентованная модификация IFN-SA при помощи PEG расположена на N-конце.

Пример 5. Измерение in vitro биологической активности IFN-SA, модифицированного при помощи полиэтиленгликоля с различным молекулярным весом

Тестируют in vitro противовирусную активность с применением подхода ингибирования патологических изменений в клетках Wish/VSV. После растворения образца национального стандарта (Национального института по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств) измеряют биологическую активность человеческого α-интерферона, измеряют культуральную среду и разбавляют до 1000 МЕ/мл. На 96-луночном культуральном планшете осуществляют разбавление при 4-кратных градиентах, 8 разбавлений и 2 лунки для каждого разбавления. Разбавляют PEG10-IFN-SA, PEG20-IFN-SA и PEG40-IFN-SA до 0,1 мкг/мл при помощи культуральной среды, разбавляют IFN-SA до 1,0 нг/мл при помощи культуральной среды и записывают кратности предварительного разбавления. На 96-луночном культуральном планшете осуществляют разбавление при 4-кратном градиенте, всего 8 разбавлений и 2 лунки для каждого разбавления. Рассчитывают in vitro противовирусную активность образца исходя из активности стандартных образцов.

Применительно к in vitro противовирусной активности PEG10-IFN-SA сохраняет приблизительно 8,01% активности IFN-SA, PEGG20-IFN-SA сохраняет 1,24%, а PEG40-IFN-SA сохраняет 0,43%. При применении международного стандарта активности рекомбинантного интерферона, полученного из NIBSC в качестве источника, in vitro противовирусная активность четырех образцов увеличивалась приблизительно на 50%.

	In vitro противовирусная активность, (МЕ/мг)	Сохраненная активность, (%)
IFN-SA	9,64×108
PEG10-IFN-SA	7,72×107	8,01
PEG20-IFN-SA	1,29×107	1,34
PEG40-IFN-SA	4,14×106	0,43

Пример 6. Сравнительное исследование фармакокинетики IFN-SA и PEG20-IFN-SA

12 Яванским макакам, половина из которых самцы, а половина - самки, разделенным на 2 группы, однократно вводят путем инъекции 10 мкг/кг IFN-SA или 50 мкг/кг PEG20-IFN-SA. Разработанный и изготовленный компанией набор для радиоиммуноанализа (RIA) IFN-SA применяют для тестирования концентрации в крови после подкожной инъекции IFN-SA или PEG20-IFN-SA, а экспериментальные данные объединяют при помощи фармакокинетической программы 3P97 для расчета фармакокинетических параметров. С применением гепарина забирают кровь из локтевой вены передней конечности, причем каждый раз объем равен 1,5 мл. Применительно к IFN-SA время забора крови составляет 0 часов 30 мин, 1 час, 2 ч