Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства

Вирусоподобные частицы (vlp) из гликопротеина вируса бешенства

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/410767, поданной 5 ноября 2011 года, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте для любых целей.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Содержимое текстового файла, представленного в электронном виде с данным документом, включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте: копия списка последовательностей в формате, пригодном для ввода в компьютер (имя файла: NOVV_047_01WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 7 ноября 2011 года, размер файла 7 килобайт).

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим гликопротеины (G-белки) вируса бешенства (RV), и способам их получения и применения, включая иммуногенные композиции, такие как вакцины для лечения и/или профилактики инфекции вируса бешенства.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус бешенства (RV) является несегментированным РНК-вирусом с отрицательной цепью из семейства Rhabdoviridae и вызывает смертельное неврологическое заболевание у людей и животных. Ежегодно регистрируют более чем 70000 человеческих смертей, а миллионам других людей требуется последующее лечение. Несмотря на достижение значительных успехов в профилактике и борьбе с бешенством, данное заболевание остается серьезной угрозой для здоровья населения и продолжает вызывать многочисленные человеческие смерти во всем мире. Представители семейства собачьих остаются наиболее важным резервантом в Азии, Африке и Латинской Америке, где происходит большинство случаев бешенства человека. В развитых странах случаи бешенства человека значительно снизились в течение последних 50 лет, в основном в результате плановой вакцинации домашних животных. Тем не менее, передача бешенства посредством воздействия дикой природы выявляется одной из основных причин заболевания. В Соединенных Штатах в дикой природе было зарегистрировано более чем 90% случаев бешенства животных, представляя постоянную угрозу для здоровья населения. Большинство случаев заболевания человека в последнее десятилетие было связано с RV, обнаруженным у летучих мышей, в частности, у серебристых гладконосов.

Рабдовирусы имеют два основных структурных компонента: спиралеобразное рибонуклеопротеиновое (RNP) ядро и окружающую оболочку. Геном вируса бешенства кодирует пять белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матричный белок (M), гликопротеин (G) и полимеразу (крупный белок) (L). Порядок генов в геноме вируса бешенства дикого типа 3'-N-P-M-G-L-5'. Белки N, L и P связаны с ядерным RNP-комплексом. RNP-комплекс состоит из РНК-генома, заключенного в капсид с помощью N в сочетании с полимеразой L и белком P. Этот комплекс служит в качестве матрицы для транскрипции и репликации вируса. Компонент вирусной оболочки RV состоит из трансмембранного гликопротеина (G) и матричного белка (M). Гликопротеин образует приблизительно 400 тримерных шипов, которые плотно расположены на поверхности вируса. M-белок связан как с оболочкой, так и с RNP, и, вероятно, является центральным белком сборки рабдовируса.

Как отмечалось выше, бешенство остается серьезной угрозой для здоровья населения во всем мире. Борьба с бешенством и защита людей от бешенства требует нескольких стратегий борьбы, таких как, плановая иммунизация домашних животных и носителей в дикой природе, предварительная иммунизация людей из групп риска и последующее лечение людей, укушенных бешеными животными. Хотя инактивированные вакцины вируса бешенства (RV), подготовленные из клеточной культуры, безопасны и хорошо переносятся, у них есть множество недостатков. Они сложны в изготовлении, сложны в хранении, имеют низкую иммуногенность и требуют многократных инъекций. Более того, они дорогостоящие и, таким образом, недоступны для большинства людей, нуждающихся в вакцинах в развивающихся странах. Кроме того, данные инактивированные вакцины, как правило, содержат адъюванты, которые могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Таким образом, необходимы более безопасные, дешевые и более эффективные вакцины RV.

Настоящее изобретение решает данную проблему необходимости путем разработки нового способа получения вирусоподобных частиц (VLP), содержащих гликопротеин (G) вируса бешенства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP) вируса бешенства (RV) для применения в вакцинах для лечения и профилактики инфекции вирусом бешенства. VLP RV по настоящему изобретению обладают потенциалом индуцирования сильных иммунных ответов у субъектов-млекопитающих на вирус бешенства.

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает VLP RV, содержащие один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. G-белки RV могут быть получены из любого подходящего штамма RV, включая, без ограничения, штаммы RV выделенные из человека, собаки, летучей мыши, енота, скунса и лисицы. В одном варианте осуществления VLP RV, содержащие один или несколько G-белков RV, могут находиться в форме мицелл. В некоторых вариантах осуществления VLP RV могут содержать один или несколько дополнительных белков RV, выбранных из нуклеопротеина (N), фосфопротеина (Р), матричного белка (М) и полимеразы (крупного белка) (L). В конкретном варианте осуществления VLP RV по настоящему изобретению могут содержать матричный белок (М) RV. В одном варианте осуществления М-белок получают из штамма RV человека. В другом варианте осуществления M-белок получают из штамма собачьего RV. В еще одном варианте М-белок получают из штамма RV, выделенного из летучей мыши. В других вариантах осуществления матричный белок может быть М1-белком из штамма вируса гриппа. В одном варианте осуществления штамм вируса гриппа является штаммом вируса птичьего гриппа. В других вариантах осуществления М-белок может быть получен из штамма вируса ньюкаслской болезни (NDV).

В одном варианте осуществления кодирующую последовательность G-белка RV дополнительно оптимизируют для повышения его экспрессии в подходящей клетке-хозяине. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой насекомого. В иллюстративном варианте осуществления клеткой насекомого является клетка Sf9.

VLP RV по настоящему изобретению могут применяться для профилактики и/или лечения инфекции RV. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ индуцирования иммунного ответа на RV. Способ включает этап, на котором субъекту, такому как человек или субъект-животное, вводят иммунологически эффективное количество композиции, содержащей VLP RV.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтически приемлемые вакцинные композиции, содержащие VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение включает иммуногенный состав, содержащий по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. В другом варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую упаковку или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами вакцинных составов по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ составления вакцины или антигенной композиции, которая индуцирует иммунитет к инфекции или по меньшей мере к одному симптому данного заболевания у млекопитающего, включающий этап, на котором к составу добавляют эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. В предпочтительном варианте осуществления инфекция является инфекцией RV.

VLP RV по настоящему изобретению пригодны для приготовления композиций, которые стимулируют иммунный ответ, обеспечивающий иммунитет или существенный иммунитет к возбудителям инфекции. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ индуцирования иммунитета к инфекции или по меньшей мере одному симптому данного заболевания у субъекта, включающий этап, на котором вводят по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ индуцирования существенного иммунитета к инфекции RV или по меньшей мере одному симптому данного заболевания у субъекта, включающий этап, на котором вводят по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV.

Композиции по настоящему изобретению могут вызвать существенный иммунитет у позвоночного (например, человека или собачьих) при введении данному позвоночному. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ индуцирования существенного иммунитета к инфекции RV или по меньшей мере одному симптому данного заболевания у субъекта, включающий этап, на котором вводят по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ вакцинации млекопитающего против RV, включающий этап, на котором указанному млекопитающему вводят индуцирующее защиту количество VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. Профилактический вакцинный состав вводят системно, например, подкожно или внутримышечно с помощью иглы и шприца или безыгольного инъектора. В иллюстративном варианте осуществления вакцинный состав вводят внутримышечно.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ индуцирования защитного ответа антител на инфекцию или по меньшей мере на один из этих симптомов у субъекта, включающий этап, на котором вводят по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ индуцирования защитного клеточного ответа на инфекцию RV или по меньшей мере на один симптом заболевания у субъекта, включающий этап, на котором вводят по меньшей мере одну эффективную дозу VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гликопротеин (G-белок) вируса бешенства. В иллюстративном варианте осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок гликопротеина (G-белка) вируса бешенства, является SEQ ID NO: 1.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую гликопротеин (G-белок) вируса бешенства. В иллюстративном варианте осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок гликопротеина (G-белка) вируса бешенства, является SEQ ID NO: 1.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую гликопротеин (G-белок) вируса бешенства. В иллюстративном варианте осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок гликопротеина (G-белка) вируса бешенства, является SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления вектор представляет собой бакуловирусный вектор.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения VLP RV, содержащей один или несколько гликопротеинов (G-белков) вируса бешенства, включающий этап (а), на котором трансформируют клетки-хозяева для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей гликопротеин (G-белок) вируса бешенства, и этап (b), на котором культивируют указанные клетки-хозяева в условиях, способствующих продукции указанных VLP RV. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая гликопротеин (G-белок) вируса бешенства, является SEQ ID NO: 1. В другом варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой насекомого. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин является клеткой насекомого, трансфицированной бакуловирусным вектором, содержащим гликопротеин (G-белок) вируса бешенства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 изображена карта плазмиды для вектора pFastBac1, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для G-белка (SEQ ID NO: 1) вируса бешенства.

На Фигуре 2 изображены результаты вестерн-блоттинга для G-белков RV с применением сыворотки кролика к RV как в восстановительных условиях (Фигура 2А), так и в условиях, на являющихся восстановительными (Фигура 2B).

На Фигуре 3 представлены изображения частиц очищенного рекомбинантного G-белка RV в форме мицелл, полученные с применением электронной микроскопии с фоновым окрашиванием при увеличении в 150000X.

На Фигуре 4 изображены результаты анализов индуцирования антител у кроликов, которым вводили G-частицы RV, с увеличением разведений.

На Фигуре 5 показана белковая последовательность для вектора pFastBac1, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты для G-белка вируса бешенства (SEQ ID NO: 1) (вверху) и последовательность G-белка RV (SEQ ID NO: 2) (внизу).

Фигура 6 представляет собой график, на котором показаны титры антител к вирусу бешенства в разные дни, построенный относительно геометрического среднего для каждого режима иммунизации (n=5 для каждой группы иммунизации).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

Как применяется в данном документе, выражение “адъювант” относится к соединению, которое при применении в комбинации с конкретным иммуногеном (например, VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV) в составе будет увеличивать или иным образом изменять или модифицировать результирующий иммунный ответ. Модификация иммунного ответа включает усиление или расширение специфичности одного из или как иммунного ответа с участием антител, так и клеточного иммунного ответа. Модификация иммунного ответа может также означать снижение или подавление определенных антиген-специфических иммунных ответов.

Как применяют в данном документе, выражение “антигенный состав” или “антигенная композиция” относится к препарату, который при введении позвоночному, особенно птице или млекопитающему, будет индуцировать иммунный ответ.

Как применяют в данном документе, выражение “вирус птичьего гриппа” относится к вирусам гриппа, обнаруженным, главным образом, у птиц, но которые также могут инфицировать людей или других животных. В некоторых случаях вирусы птичьего гриппа могут передаваться или распространяться от одного человека к другому. Вирус птичьего гриппа, который инфицирует людей, потенциально может вызвать пандемию гриппа, то есть, заболеваемость и/или смертность у людей. Пандемия возникает тогда, когда появляется новый штамм вируса гриппа (вирус, к которому у человека нет естественного иммунитета), распространяясь за пределы отдельных местностей, возможно, по всему миру, и заражая множество людей одновременно.

Как применяют в данном документе, “эффективная доза” в целом относится к такому количеству VLP RV, содержащей один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, которое достаточно для индуцирования иммунитета для предотвращения и/или уменьшения интенсивности инфекции или уменьшения по меньшей мере одного симптома инфекции или заболевания, и/или для повышения эффективности другой дозы VLP RV, содержащей один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. Эффективная доза может относиться к количеству VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, достаточному, чтобы задержать или минимизировать проявление инфекции или заболевания. Эффективная доза может также относиться к количеству VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, которое обеспечивает терапевтическое преимущество при лечении или контроле инфекции или заболевания. Кроме того, эффективная доза представляет собой количество в отношении VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, отдельно или в комбинации с другими видами терапии, которое обеспечивает терапевтическое преимущество при лечении или контроле инфекции или заболевания. Эффективная доза также может представлять собой количество, достаточное для повышения у субъекта (например, у человека) собственного иммунного ответа на последующее воздействие возбудителя инфекции или заболевания. Уровни иммунитета можно контролировать, например, путем измерения количества нейтрализующих секреторных и/или сывороточных антител, например, путем нейтрализации бляшки, фиксации комплемента, иммуноферментного или микронейтрализационного анализа, или путем измерения клеточных ответов, таких как, без ограничения, цитотоксических Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток, хелперных Т-клеток, дендритных клеток и/или других клеточных ответов. Т-клеточные ответы можно контролировать, например, посредством измерения, например, количества присутствующих клеток CD4⁺и CD8⁺с применением специфических маркеров методом флуоресцентной проточной цитометрии или Т-клеточных анализов, таких как, без ограничения, анализ Т-клеточной пролиферации, анализ Т-клеточной цитотоксичности, TETRAMER-анализ и/или ELISPOT-анализ. В случае вакцины “эффективная доза” является такой, которая предотвращает заболевание и/или уменьшает тяжесть симптомов.

Как применяют в данном документе, выражение “эффективное количество” относится к количеству VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, необходимому или достаточному для реализации желаемого биологического эффекта. Эффективное количество композиции будет количеством, которое достигает выбранного результата, и такое количество может быть определено в результате обычного проведения исследований специалистом в данной области техники. Например, эффективное количество для предупреждения, лечения и/или уменьшения интенсивности инфекции, может быть количеством, необходимым для того, чтобы вызвать активацию иммунной системы, приводящую к развитию антиген-специфического иммунного ответа при воздействии VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. Выражение также является синонимом “достаточного количества". В другом варианте осуществления эффективное количество представляет собой количество по весу G-мицеллы RV, которое индуцирует серопротекцию на соответствующей животной модели, у животного или пациента-человека на желаемое количество дней, например, 7, 10, 14 или более дней.

Как применяют в данном документе, выражение “экспрессия” относится к процессу, посредством которого полинуклеиновые кислоты транскрибируются в мРНК и транслируются в пептиды, полипептиды или белки. Если полинуклеиновую кислоту получают из геномной ДНК, экспрессия может включать сплайсинг мРНК, если выбраны соответствующая эукариотическая клетка-хозяин или организм. В контексте настоящего изобретения выражение также охватывает выход мРНК гена G RV и G-белков RV, достигнутый после его экспрессии.

Как применяют в данном документе, выражение “G-белок” или “G-гликопротеин” или “полипептид G-белка” относится к полипептиду или белку, содержащему всю или часть аминокислотной последовательности полипептида G-белка RV.

Как применяют в данном документе, выражения “иммуногены” или “антигены” относятся к веществам, таким как белки, пептиды, пептиды, нуклеиновые кислоты, которые способны вызывать иммунный ответ. Оба выражения также охватывают эпитопы и применяются взаимозаменяемо.

Как применяют в данном документе, выражение “иммунный стимулятор” относится к соединению, которое повышает иммунный ответ через собственные химические мессенджеры организма (цитокины). Данные молекулы включают различные цитокины, лимфокины и хемокины с иммуностимулирующей, иммунопотенцирующей и противовоспалительной активностями, такие как интерфероны (IFN-γ), интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13), факторы роста (например, гранулоцитов-макрофагов (GM)-колониестимулирующий фактор (CSF)); и другие иммуностимулирующие молекулы, такие как макрофагальный воспалительный фактор, лиганд Flt3, В7.1, В7.2 и т.д. Молекулы иммунного стимулятора можно вводить в том же составе, что и VLP по настоящему изобретению, или можно вводить отдельно. Для получения иммуностимулирующего эффекта можно вводить либо белок, либо вектор экспрессии, кодирующий данный белок.

Как применяют в данном документе, выражение “иммуногенный состав” относится к препарату, который при введении позвоночному, например млекопитающему, будет индуцировать иммунный ответ.

Как применяют в данном документе, выражение “возбудитель инфекции” относится к микроорганизмам, которые вызывают инфекцию у позвоночных. Как правило, организмы являются вирусами, бактериями, паразитами, простейшими и/или грибами.

Как применяют в данном документе, выражение “поливалентный” относится к композициям, которые имеют один или несколько антигенных белков/пептидов или иммуногенов к множеству типов или штаммов возбудителей инфекции или заболеваний, например, более одного типа, штамма, последовательности G-белка RV и т.д.

Как применяют в данном документе, выражение “фармацевтически приемлемая вакцина” относится к составу, содержащему VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, находящемуся в форме, которая может быть введена позвоночному, и вызывающему защитный иммунный ответ, достаточный для индуцирования иммунитета для предотвращения и/или уменьшения интенсивности инфекции или заболевания, и/или для уменьшения по меньшей мере одного симптома инфекции или заболевания, и/или для повышения эффективности другой дозы VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. Как правило, вакцина содержит обычный физиологический раствор или среду буферного водного раствора, в которой композицию по настоящему изобретению суспендируют или растворяют. В такой форме композицию по настоящему изобретению можно удобно применять для предотвращения, уменьшения интенсивности или лечения инфекции другим образом. При введении в организм хозяина данная вакцина способна вызвать иммунный ответ, включая, без ограничения, продуцирование антител и/или цитокинов, и/или активацию цитотоксических Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток, хелперных Т-клеток, дендритных клеток и/или других клеточных ответов.

Как применяют в данном документе, выражение “защитный иммунный ответ” или “защитный ответ” относится к иммунному ответу, опосредованному антителами, на возбудитель инфекции или заболевание, проявляющееся у позвоночного (например, человека), который предотвращает или уменьшает интенсивность инфекции, или уменьшает по меньшей мере один симптом данного заболевания. VLP RV по настоящему изобретению, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, может стимулировать продуцирование антител, которые, например, нейтрализуют возбудителей инфекции, блокируют проникновение возбудителей инфекции в клетки, блокируют репликацию возбудителей инфекции и/или защищают клетки-хозяева от инфекции и разрушения. Данное выражение может также относиться к иммунному ответу, опосредованному Т-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови, на возбудитель инфекции или заболевание, проявляющееся у позвоночных (например, человека), который предотвращает или уменьшает интенсивность инфекции или заболевания, либо уменьшает по меньшей мере один из его симптомов.

Как применяют в данном документе, выражение “позвоночные” или “субъект” или “пациент” относится к любому члену подтипа хордовых, включая, без ограничения, людей и других приматов, включая любых приматов за исключением человека, таких как шимпанзе и другие виды обезьян. Сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, включая грызунов, таких как мыши, крысы (включая хлопковых хомяков) и морские свинки; птицы, включая домашних, диких и пернатую дичь, таких как куры, индейки и других куриных, уток, гусей и т.п., также являются неограничивающими примерами. Выражения “млекопитающие” и “животные” включены в данное определение. Охватываются как взрослые, так и новорожденные индивидуумы. В частности, люди, домашние млекопитающие и сельскохозяйственные животные являются подходящими реципиентами вакцины или терапевтического средства RV.

Как применяют в данном документе, выражение “вирусоподобная частица” (VLP), относится к структуре, которая по меньшей мере в одном признаке имеет сходство с вирусом, но которая не продемонстрировала инфекционность. Вирусоподобные частицы в соответствии с настоящим изобретением не несут генетической информации, кодирующей белки вирусоподобных частиц. В целом, вирусоподобные частицы не имеют вирусного генома и, следовательно, не являются инфекционными. Кроме того, вирусоподобные частицы часто могут быть получены в больших количествах путем гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены.

Как применяют в данном документе, выражение “химерная VLP” относится к VLP, которые содержат белки или их части по меньшей мере из двух различных возбудителей инфекции (гетерологичные белки). Как правило, один из белков получают от вируса, который может управлять формированием VLP в клетках-хозяевах. Примерами в иллюстративных целях являются М-белок птичьего гриппа и/или G-белок RV. В случае необходимости, выражения VLP RV и химерные VLP могут применяться взаимозаменяемо.

Как применяют в данном документе, выражение “вакцина” относится к препарату мертвых или ослабленных патогенов, или производных антигенных детерминант, который применяют, чтобы вызвать образование антител или иммунитет к патогену. Вакцину вводят для обеспечения иммунитета к заболеванию, например, гриппу, которое вызвано вирусом гриппа. Кроме того, выражение “вакцина” относится также к суспензии или раствору иммуногена (например, VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV), который вводят позвоночным для получения защитного иммунитета, т.е. иммунитета, который предотвращает или уменьшает тяжесть заболевания, связанного с инфекцией. Настоящее изобретение предусматривает вакцинные композиции, которые являются иммуногенными и могут обеспечить защиту от заболевания, связанного с инфекцией.

Вирусоподобные частицы (VLP) вируса бешенства (RV)

В одном аспекте настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP) RV, содержащим один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, которые могут быть включены в состав вакцин или антигенных составов для защиты позвоночных (например, человека и домашних животных) от инфекции RV или по меньшей мере одного из симптомов данного заболевания. В некоторых вариантах осуществления VLP, содержащая один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, также содержит дополнительные белки RV, такие как N, P, M и L. В других вариантах осуществления VLP, содержащая один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, дополнительно содержит белки из гетерологичных вирусных штаммов, таких как белки HA, NA и М1 вируса гриппа. В одном варианте осуществления M1-белок вируса гриппа получают из штамма вируса птичьего гриппа (см. заявку на патент США № 13/280043, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте).

Вакцины против RV

Поскольку инфекция RV может быть предотвращена путем обеспечения нейтрализующих антител позвоночным, вакцина, содержащая VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, при введении позвоночным может индуцировать нейтрализующие антитела in vivo. VLP RV, которые содержат один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV, предпочтительно применяют для профилактики и/или лечения инфекции RV. Таким образом, другой аспект данного раскрытия относится к способу индуцирования иммунного ответа в отношении RV. Способ включает этап, на котором вводят субъекту (такому как человек или субъект-животное) иммунологически эффективное количество композиции, содержащей VLP RV, которая содержит один или несколько гликопротеинов (G-белков) RV. Введение иммунологически эффективного количества композиции вызывает иммунный ответ, специфический в отношении эпитопов, представленных на G-белке RV. Такой иммунный ответ может включать B-клеточные ответы (например, продуцирование нейтрализующих антител) и/или Т-клеточные ответы (например, продуцирование цитокинов). Предпочтительно, иммунный ответ, вызванный G-белком RV, включает в себя элементы, которые являются специфическими в отношении по меньшей мере одного конформационного эпитопа, представленного на G-белке RV. В одном варианте осуществления иммунный ответ является специфическим в отношении эпитопа, представленного на G-белке RV, находящемуся в форме мицеллы. G-белки RV и композиции можно вводить субъекту без усиления вирусного заболевания после контакта с RV. Предпочтительно, G-белки RV, раскрытые в данном документе, и соответствующим образом разработанные иммуногенные композиции вызывают Th1-смещенный иммунный ответ, который снижает или предотвращает инфицирование RV и/или снижает или предотвращает патологический ответ после инфицирования RV.

В одном варианте осуществления G-белки RV по настоящему изобретению находятся в форме мицелл (например, розеток). Смотри пример 2. В одном варианте осуществления мицеллы очищают после экспрессии в клетке-хозяине. В случаях введения субъекту, мицеллы по настоящему изобретению предпочтительно индуцируют нейтрализующие антитела. В некоторых вариантах осуществления мицеллы можно вводить с адъювантом. В других вариантах осуществления мицеллы можно вводить без адъюванта.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает вирусоподобные частицы (VLP) RV, содержащие G-белок RV, которые могут быть включены в состав вакцин или антигенных составов для защиты позвоночных (например, людей) от инфекции RV или по меньшей мере одного симптома данного заболевания. Настоящее изобретение также относится к VLP RV и векторам, содержащим гены RV дикого типа и мутированные гены RV или их комбинацию, полученную из различных штаммов вируса RV, который при трансфекции в клетки-хозяева будет продуцировать вирусоподобные частицы (VLP), содержащие белки RV.

В некоторых вариантах осуществления вирусоподобные частицы RV могут дополнительно содержать по меньшей мере один белок вирусного матрикса (например, М-белок RV). В одном варианте осуществления М-белок получают из штамма RV человека. В другом варианте осуществления М-белок получают из альтернативного штамма RV, такого как штамм RV, выделенный из собаки, летучей мыши, енота или скунса. В других вариантах осуществления матричный белок может быть M1-белком из штамма вируса гриппа. В одном варианте осуществления штамм вируса гриппа является штаммом птичьего гриппа. В иллюстративном варианте осуществления штамм птичьего гриппа является штаммом H5N1 A/Indonesia/5/05. В других вариантах осуществления матричный белок может быть из вируса ньюкаслской болезни (NDV).

В дополнительных вариантах осуществления VLP по настоящему изобретению могут содержать один или несколько гетерологичных иммуногенов, таких как гемагглютинин (HA) и/или нейраминидаза (NA) вируса гриппа.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также включает комбинации различных G, N, P, M и L-белков RV из того же и/или различных штаммов в одной или нескольких VLP. Кроме того, VLP могут включать одну или несколько дополнительных молекул для усиления иммунного ответа.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения VLP RV могут переносить средства, такие как нуклеиновые кислоты, siRNA, микроРНК, химиотерапевтические средства, визуализирующие средства и/или другие средства, которые необходимо доставить пациенту.

VLP по настоящему изобретению являются пригодными для получения вакцин и иммуногенных композиций. Одной из важных особенностей VLP является возможность экспрессировать интересующие поверхностные белки так, что иммунная система позвоночных индуцирует иммунный ответ в отношении белка интереса. Однако не все белки могут быть экспрессированы на поверхности VLP. Возможно множество причин, по которым некоторые белки не экспрессируются или слабо экспрессируются на поверхности VLP. Одной из причин является то, что белок не ориентирован на мембрану клетки-хозяина, или, что белок не имеет трансмембранного домена. В качестве примера, последовательности вблизи карбокси-конца гемагглютинина вируса гриппа могут быть важными для включения HA в липидный бислой зрелого вируса гриппа, окружающий нуклеокапсиды, и для сборки тримера HA при взаимодействии с матричным белком M1 гриппа (Ali и соавт., (2000) J. Virol. 74, 8709-19).

Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения включает химерные VLP, содержащие G-белок из RV и по меньшей мере один иммуноген, который обычно эффективно не экспрессируется на поверхности клетки или не является нормальным белком RV. В одном варианте осуществления G-белок RV может быть гибридизирован с иммуногеном интереса. В другом варианте осуществления G-белок RV связывается с иммуногеном посредством трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста гетерологичного поверхностного белка оболочки вируса, например, белка оболочки MMTV.

Другие химерные VLP по настоящему изобретению включают VLP, содержащие G-белок RV и по меньшей мере один белок из гетерологичного возбудителя инфекции. Примеры гетерологичных возбудителей инфекции включают, без ограничения, вирусы, бактерии, простейшие, грибы и/или паразиты. В одном варианте осуществления иммуноген из другого возбудителя инфекции представляет собой гетерологичный вирусный белок. В другом варианте осуществления белок из гетерологичного возбудителя инфекции является связанным с оболочкой белком. В другом варианте осуществления белок из другого гетерологичного возбудителя инфекции экспрессируется на поверхности VLP. В другом варианте осуществления белок из возбудителя инфекции содержит эпитоп, который будет вырабатывать защитный иммунный ответ у позвоночных. В одном варианте осуществления белок из другого возбудителя инфекции коэкспрессируется с G-белком RV. В другом варианте осуществления белок из другого возбудителя инфекции гибридизируют с G-белком RV. В другом варианте осуществления только часть белка из другого возбудителя инфекции гибридизируют с G-белком RV. В другом варианте осуществления только часть белка из другого возбудителя инфекции гибридизируют с частью G-белка RV. В другом варианте осуществления часть белка из другого возбудителя инфекции, гибридизированную с G-белком RV, экспрессируют на поверхности VLP.

Настоящее изобретение также охватывает варианты белков, экспрессированные на или в VLP по настоящему изобретению. Варианты могут содержать изменения в аминокислотных последовательностях составных белков. Выражение “вариант” по отношению к белку относится к аминокислотной последовательности, которая изменена по одной или нескольким аминокислотам по сравнению с эталонной последовательностью. Вариант может иметь “консервативные” замены, где замещенная аминокислота имеет аналогичные структурные и химические свойства, например, замещение лейцина на изолейцин. Альтернативно, вариант может иметь “неконсервативные” замены, например, замена глицина триптофаном. Аналогичные незначительные вариации могут также включать аминокислотную делецию или инсерцию, или и ту, и другую. Руководство в определении того, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, вставлены или удалены без устранения биологической или иммунологической активности, можно обнаружить с помощью компьютерных программ, хорошо известных в данной области техники, например, программного обеспечения DNASTAR.

Природные варианты могут возникать вследствие мутаций в белках. Эти мутации могут приводить к антигенной изменчивости в пределах отдельных групп возбудителей инфекции, например, гриппа. Таким образом, у человека, инфицированного, например, штаммом вируса гриппа, вырабатываются антитела в отношении этого вируса, и когда появляются новые штаммы вируса, антитела к старым штаммам больше не распознают новые вирусы, и может произойти повторное инфицирование. Настоящее изобретение