Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином

Комбинированная терапия нефукозилированным анти-cd20 антителом с бендамустином

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии нефукозилированным антиCD20антителом с бендамустином для лечения рака.

Предпосылки создания изобретения

Нефукозилированные антитела

Опосредованные клетками эффекторные функции моноклональных антител могут быть усилены за счет конструирования их олигосахаридного компонента согласно описанию в работе Umaña Р. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, сс.176-180, и в патенте US 6602684. Антитела типа IgG1, которые наиболее часто применяются в иммунотерапии рака, являются гликопротеинами с консервативным сайтом N-связанного гликозилирования по положению Asn297 в каждом домене CH₂. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, скрыты между доменами CH₂, формируя пространственные контакты с полипептидным каркасом, и их наличие важно для опосредования антителом эффекторных функций, например, антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology, 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev., 163, 1998, cc.59-76; Wright A., Morrison S.L., Trends Biotechnol., 15, 1997, cc.26-32). В публикации Umaña P. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, cc.176-180, и в WO 99/154342 показано, что сверхэкспрессия в клетках яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary - CHO) фермента ß(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (acetylglucosaminyltransferase III - GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей формирование раздвоенных олигосахаридов, существенно повышает in vitro ADCC-действие антител. Изменение в композиции углевода N297 или его элиминация также влияет на Fc-связывание с FcγR и C1q (Umaña Р. и др., Nature Biotechnol, 17, 1999, cc.176-180; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng., 74, 2001, cc.288-294; Mimura Y. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.45539-45547; Radaev S. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.16478-16483; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 276, 2001, cc.6591-6604; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem., 277, 2002, cc.26733-26740; Simmons L.C. и др., J. Immunol. Methods, 263, 2002, cc.133-147).

Обсуждение исследований действия нефукозилированных и фукозилированных антител, в том числе анти-СЭ20 антител, опубликовано, например, в следующих работах: Iida S. и др., Clin. Cancer Res., 12, 2006, cc.2879-2887; Natsume А. и др., J. Immunol. Methods, 306, 2005, cc.93-103; Satoh M. и др., Expert Opin. Biol. Ther., 6, 2006, cc.1161-1173; Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94, 2004, cc.680-688; Davies J. и др., Biotechnol. Bioeng., 74, 2001, cc.288-294.

CD20 и анти-СР20 антитела

Интенсивно исследуют молекулу CD20 (также называемую антигеном дифференциации, специфичным для В-лимфоцитов человека, или Вр35), которая является гидрофобным трансмембранным белком, локализованным на предшественниках В-лимфоцитов и на зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem., 264, 1989, cc.11282-11287; Einfeld D.A. и др., EMBO J., 7, 1988, cc.711-717; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1988, cc.208-212; Stamenkovic I. И др., J. Exp. Med., 167, 1988, cc.1975-80; Tedder T.F. и др., J. Immunol. 142, 1989, cc.2560-2568). CD20 экспрессируется на более чем 90% В-клеток неходжкинской лимфомы (НХЛ) (Anderson К.С. и др., Blood 63, 1984, сс.1424-1433), но он не выявлен на кроветворных стволовых клетках, предшественниках В-клеток, нормальных плазматических клетках или на других здоровых тканях (Tedder T.F. и др., J. Immunol. 135(2), 1985, сс.973-979).

Существует два разных типа анти-CD20 антител, существенно отличающихся по способу связывания CD20 и по биологическим действиям (Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2004, сс.2738-2743; Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, сс.1045-1051). Антитела I типа, например, ритуксимаб, активно действуют в комплемент-опосредованной цитотоксичности, а антитела II типа, например, тоситумомаб (B1), 11В8, АТ80 или гуманизированные антитела B-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней через каспаза-независимый апоптоз с сопутствующей экспозицией фосфатидилсерина.

Общие отличительные свойства анти-CD20 антител типа I и типа II суммированы в табл.1.

Таблица 1
Свойства анти-CD20 антител I и II типа
Анти-CD20 антитела I типа	Анти-СБ20 антитела II типа
Эпитоп CD20 I типа	Эпитоп CD20 II типа
Локализуют CD20 на липидных рафтах	Не локализуют CD20 на липидных рафтах
Повышенная CDC (в случае изотипа IgG1)	Пониженная CDC (в случае изотипа IgG1)
Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)	Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)
В полной мере обладают связывающей способностью	Пониженная связывающая способность
Гомотипическое агрегирование	Усиленное гомотипическое агрегирование
Индукция апоптоза при перекрестном связывании	Сильная индукция гибели клеток с перекрестным связыванием

Бендамустин

Бендамустином (торговые названия рибомустин и трианда, а также SDX-105) является азотистым ипритом, применяемым для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) (Kath R. и др., Cancer Res. Clin. Oncol., 127, 2001, сс.48-54) и В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Он принадлежит к группе лекарственных средств, называемых алкилирующими агентами. Бендамустин в настоящее время также исследуют в качестве средства лечения саркомы (Bagchi S., Lancet Oncol., 8, 2007, с.674).

Бендамустин применяют в качестве терапевтического агента вместе с другими агентами, включая ритуксимаб (Cheson B.D. и др., J Clin Oncol., 27(9), 2009, cc.1492-501; Knauf W., Expert Rev Anticancer Ther., (2)9, 2009, cc.165-174; Plosker G.L. и др., Drugs. 68(18), 2008, cc.2645-2660).

Краткое описание изобретения

Неожиданно было установлено, что комбинация бендамустина с нефукозилированным анти-CD20 антителом проявляет синергетическое (например, даже более чем аддитивные) антипролиферативные действия по сравнению с комбинацией с не являющимся нефукозилированным анти-CD20 антителом ритуксимабом.

Настоящее изобретение включает применение нефукозилированного анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином.

Другим объектом по настоящему изобретению является способ лечения больного раком пациента путем введения нефукозилированного анти-CD20 антитела с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 в комбинации с бендамустином пациенту, нуждающемуся в таком лечении.

Другим объектом по настоящему изобретению является нефукозилированное анти-CD20 антитело с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для лечения рака в комбинации с бендамустином.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0% от общего количества олигосахаридов по положению Asn297.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированным анти-СЭ20 антителом является антитело IgG1.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное нефукозилированное анти-СВ20. антитело является гуманизированным антителом B-Ly1 и указанным раком является рак, экспрессирующий CD20, который в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения является В-клеточной неходжкинской лимфомой (НХЛ).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело B-Ly1 вводят в дозе от 800 до 1200 мг на 1, 8, 15 сутки 6-недельного цикла дозирования и затем в дозе от 800 до 1200 мг на 1 сутки до пяти 4-недельных циклов дозирования, и бендамустин вводят в дозе от 80 мг/м² до 110 мг/м² на 1 и 2 сутки до шести 4-недельных циклов дозирования.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена композиция, включающая анти-CD20 нефукозилированное антитело с количеством фукозы 60% или менее и бендамустин, для лечения рака.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение включает применение нефукозилированного анти-CD20 антитела изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с количеством фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения нефукозилированное анти-CD20 антитело связывает CD20 с величиной KD от 10^-9 до 10^-13 молей/л.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

Понятие «антитело» охватывает разные формы антител, включая, но ими не ограничиваясь, целые антитела, антитела человека, гуманизированные антитела и генетически сконструированные антитела, например, моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты таких антител, длина которых такова, что сохраняются отличительные свойства по настоящему изобретению. Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего изобретения относятся к препарату молекул антитела единственного аминокислотного состава. Соответственно, понятие «моноклональное антитело человека» относится к антителам, проявляющим отдельную связывающую специфичность, и содержит вариабельные, и константные области, которые происходят от последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения моноклональные антитела человека вырабатываются гибридомой, которая включает В-клетки, полученные от трансгенного животного, но не от человека, например, трансгенной мыши с геномом, включающим трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, гибридизированные с бессмертными клетками.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, включающему вариабельную область, например, область связывания, от одного источника или вида и по меньшей мере часть константной области, производной от другого источника или вида, особенно полученную методами рекомбинации ДНК. Особенно предпочтительны химерные антитела, включающие вариабельную область мыши и константную область человека. Такие химерные антитела мыши/человека являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулина, включающих сегменты ДНК, которые кодируют вариабельные области иммуноглобулина мыши, и сегменты ДНК, которые кодируют константные области иммуноглобулина человека. К другим формам «химерных антител», охватываемых настоящим изобретением, относятся те, у которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела также называются «антителами переключенного класса». К методам получения химерных антител относятся общепринятые методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, известные в данной области. См., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244.

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, у которых каркасный участок или «комплементарность-детерминируемые области (complementarity determining regions - CDR)» модифицированы для включения области CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью исходного иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения CDR мыши пересаживают в каркасный участок антитела человека для получения «гуманизированного антитела». См., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270.

В контексте настоящего изобретения понятие «антитело человека» относится к антителам, содержащим вариабельные и константные области, производные от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека известны в данной области (van Dijk М.А., van de Winkel J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc.368-374). Основываясь на таком подходе, могут быть получены антитела человека против большого количества разнообразных мишеней. Примеры антител человека описаны, например, Kellermann S.A. и др., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, сс.593-597.

Понятие «рекомбинантное антитело человека» в контексте настоящего изобретения охватывает все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены методами рекомбинации, например, антитела, выделенные из клетки-хозяина, например, клетки NS0 или CHO, или от животного (например, мыши), трансгенного по генам иммуноглобулина, или антитела, экспрессированные с использованием вектора рекомбинантной экспрессии, трансфецированного в клетку-хозяина. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, производные от последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии в перегруппированной форме. Рекомбинантные антитела человека по настоящему изобретению были подвергнуты соматическому гипермутированию in vivo. Соответственно аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые хотя и происходят от последовательностей, близких к последовательностям VH и VL зародышевой линии человека, естественным образом могут отсутствовать в спектре антител зародышевой линии человека in vivo.

В контексте настоящего изобретения понятие «связывание» или «специфическое связывание» относится к специфическому связыванию антитела с эпитопом опухолевого антитела в исследовании in vitro, предпочтительно в исследовании методом плазмонного резонанса (фирма BIAcore, GE-Healthcare Упсала, Швеция) с очищенным антигеном дикого типа. Сродство связывания выражается в терминах «k_a» (константа скорости ассоциации антитела из комплекса антитело/антиген), «k_D» (константа диссоциации) и «K_D» (k_D/k_a). Связывание или специфичное связывание означает связывающее сродство (K_D) 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 М до 10^-13 молей/л. Соответственно нефукозилированное антитело по настоящему изобретению специфически связывается с опухолевым антигеном со связывающим сродством (K_D) 10^-8 молей/л или менее, предпочтительно от 10^-9 до 10^-13 молей/л.

Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего изобретения относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно двухцепочечной ДНК.

Понятие «константные домены» означает, что они не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но участвуют в проявлении эффекторных функций (ADCC, связывание комплемента и CDC).

Понятие «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)), применяемое в настоящем изобретении, означает каждую из пар легкой и тяжелой цепей, вовлеченную непосредственно в связывание антитела с антигеном. Домены вариабельных легкой и тяжелой цепей человека имеют одну общую структуру, и каждый домен включает четыре каркасных участка (framework region - FR), последовательности которых в высокой степени консервативны, соседствуют с тремя «гипервариабельными областями» (или комплементарность-детерминирующими областями - complementarity determining regions, CDR). Каркасные участки принимают конформацию бета-слоя и области CDR могут формировать петли, объединяющие структуру бета-слоя. Области CDR в каждой цепи поддерживаются в их трехмерной структуре каркасными участками и формируют вместе с областями CDR из сайта связывания антигена другой цепи.

В контексте настоящего изобретения понятие «гипервариабельная область» или «антигенсвязывающая часть антитела» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «комплементарность-детерминирующих областей (complementarity determining regions - CDR)». Понятие «каркасный участок (framework region - FR)» относится к тем вариабельным доменным областям, которые отличны от остатков гипервариабельных областей, согласно описанному в настоящем изобретении. Таким образом, легкие и тяжелые цепи антитела включают в направлении от N- к C-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.

В особенности CDR3-тяжелой цепи является областью, которая в наибольшей степени влияет на связывание антигена. Области CDR и FR определяют по стандарту, описанному в кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest)), 1991, 5-е изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд, и/или по тем остаткам, которые происходят из «гипервариабельной петли».

Бендамустин является 4-[5-[бис(2-хлорэтил)амино]-1-метилбензимидазол-2-ил]бутановой кислотой. Торговые названия этого соединения «рибомустин» и «треанда»; бендамустин также известен под названием SDX-105. Бендамустин представляет азотистый иприт, применяемый для лечения хронического лимфолейкоза (ХЛЛ) (Kath R. и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 127, 2001, сс.48-54) и В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Он принадлежит к группе лекарств, называемых алкилирующими агентами, и также исследуется для лечения саркомы (Bagchi S., Lancet Oncol., 8, 2007, с.674).

Понятие «нефукозилированное антитело» относится к антителу изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1) с измененным типом гликозилирования в области Fc в положении Asn297, обладающему пониженным уровнем остатков фукозы. Гликозилирование IgG1 или IgG3 человека локализовано в положении Asn297 в виде корового биантенного сложного олигосахаридного гликозилирования, заканчивающегося двумя остатками Gal. Эти структуры обозначают в качестве остатков гликанов G0, G1 (α1,6 или α1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal (Raju T.S., BioProcess Int., 1 2003, сс.44-53). Тип гликозилирования СНО частей антитела Fc описан, например, в работе Routier F.H., Glycoconjugate J., 14, 1997, сс.201-207. Антитела, которые рекомбинантно экспрессируются в клетках-хозяевах СНО без гликомодификации, обычно фукозилированы по положению Asn297 в количестве по меньшей мере 85%. Следует учитывать, что в контексте настоящего изобретения понятие нефукозилированного антитела предусматривает антитело, у которого нет фукозы в присущем ему характере гликозилирования. В большинстве случаев известно, что типичное положение гликозилированного остатка в антителе занимает аспарагин по положению 297 по системе нумерации EU («Asn297»).

Понятие «система нумерации EU» или «индекс EU» обычно применяют по отношению к остатку в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU представлен в кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Министерство здравоохранения и социального обеспечения США, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд).

Таким образом, нефукозилированное антитело по настоящему изобретению означает антитело изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), в котором количество фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297 (это означает, что по меньшей мере 40% или более олигосахаридов в области Fc по положению Asn297 фукозилировано). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% олигосахаридов в области Fc по положению Asn297. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 50% или менее, и в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 30% или менее от количества ологисахаридов в области Fc по положению Asn297. В другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0% от количества ологисахаридов в области Fc по положению Asn297. В соответствии с настоящим изобретением понятие «количество фукозы» означает количество указанного олигосахарида (фукозы) в олигосахаридной цепочке (цепочке сахара) по положению Asn297 относительно суммы всех олигосахаридов (сахаров), присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных и содержащих большое количество маннозы структур), измеренное методом MALDI-TOF спектрометрии и рассчитанное в качестве средней величины (подробный метод определения количества фукозы описан, например, в WO 2008/077546). Кроме того, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахариды области Fc раздвоены. Нефукозилированное антитело по настоящему изобретению может экспрессироваться в гликомодифицированной клетке-хозяине, сконструированной для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который обладает действием GnTIII, в количестве, достаточном для частичного фукозилирования олигосахаридов в области Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий действием GnTIII, является гибридным полипептидом. В другом варианте действие α1,6-фукозилтрансферазы клетки-хозяина может быть снижено или элиминировано согласно US 6946292 для получения гликомодифицированных клеток-хозяев. Степень фукозилирования антитела может быть предопределена, например, или условиями ферментации (например, временем ферментации), или комбинированием по меньше мере двух антител с разной степенью фукозилирования. Такие нефукозилированные антитела и соответствующие способы гликоинжениринга описаны в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, сс.176-180; WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US2005/0152894, WO 2003/035835, WO 2000/061739. Такие гликоинженерные антитела обладают повышенной величиной ADCC. Другие методы гликоинжениринга, с помощью которых получают нефукозилированные антитела по настоящему изобретению, описаны, например, в работах Niwa R. и др., J. Immunol. Methods, 306, 2005, сс.151-160; Shinkawa Т. и др., J Biol Chem, 278, 2003, сс.3466-3473; WO 03/055993 или US 2005/0249722.

Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является применение нефукозилированного анти-CD20 антитела изотипа IgG1 или IgG3 (предпочтительно изотипа IgG1), специфически связывающегося с CD20 и содержащего количество фукозы 60% или менее от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297, для получения лекарственного средства для лечения рака в комбинации с бендамустином. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60% от общего количества олигосахаридов (сахаров) по положению Asn297.

Антиген CD20 (также называемый В-лимфоцитарным антигеном CD20, В-лимфоцитарным поверхностным антигеном Bl, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5; последовательность обозначена номером Р11836 в базе данных SwissProt) является гидрофобным трансмембранным белком с молекулярной массой примерно 35 кДа, расположенным на предшественниках В-лимфоцитов и на зрелых В-лимфоцитах. (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem., 264(19), 1989, сс.11282-11287; Tedder T.F. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1988, cc.208-212; Stamenkovic I. И др., J. Exp. Med., 167, 1988, cc.1975-80; Einfeld D.A. и др., EMBO J., 7, 1988, cc.711-717; Tedder T.F. и др., J. Immunol., 142, 1989, cc.2560-2568). Соответствующий ген человека представляет трансмембранный 4-доменный подсемейства А представитель 1, также обозначаемый MS4A1. Этот ген кодирует представителя семейства трансмембранных 4А генов. Представители этого формирующегося семейства отличаются общими структурными свойствами и сходными границами сплайсирования интрона/экзона и проявляют уникальные варианты экспрессии среди клеток кроветворения и нелимфоидных тканей. Этот ген кодирует молекулу на поверхности В-лимфоцитов, которая участвует в развитии и дифференциации В-клеток в клетки плазмы. Представитель этого семейства локализован по положению 1 lql2, среди кластера представителей семейства. Иной сплайсинг этого гена приводит к двум вариантам транскрипта, которые кодируют один и тот же белок.

Понятия «антиген CD20» и «CD20» в контексте настоящего изобретения применяют взаимозаменяемо и к ним относят какие-либо варианты, изоформы и гомологи CD20 человека других видов, которые естественным образом экспрессируются клетками или экспрессируются на поверхности клеток, трансфецированных геном CD20. Связывание антитела по настоящему изобретению с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, клеток опухоли), путем инактивирования CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может происходить по одному или нескольким из следующих механизмов: индукции гибели клеток/апоптоза, ADCC и CDC.

К синонимам CD20, применяемым в данной области, относятся В-лимфоцитный антиген CD20, В-лимфоцитный поверхностный антиген B1, Leu-16, Вр35, ВМ5 и LF5.

Понятие «анти-CD20 антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном CD20. В зависимости от связывающих свойств и биологического действия анти-CD20 антител по отношению к антигену CD20 могут быть выделены два типа анти-CD20 антител (анти-CD20 антитела I и II типа) согласно Cragg M.S. и др., Blood, 103, 2004, сс.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, сс.1045-1051, см. табл.2.

Таблица 2
Свойства анти-CD20 антител I и II типа
Ahth-CD20 антитела I типа	Ahth-CD20 антитела II типа
Эпитоп CD20 I типа	Эпитоп CD20 II типа
Локализуются CD20 на липидных рафтах	Не локализуются CD20 на липидных рафтах
Повышенная цитотоксичность CDC (в случае изотипа IgG1)	Пониженная цитотоксичность CDC (в случае изотипа IgG1)
Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)	Действие ADCC (в случае изотипа IgG1)
В полной мере присуща способность к связыванию	Пониженная способность к связыванию
Гомотипическое агрегирование	Усиленное гомотипическое агрегирование
Индукция апоптоза при перекрестном связывании	Индукция высокой гибели клеток без перекрестного связывания

К примерам анти-CD20 антител II типа относятся, например, гуманизированное B-Ly1 антитело IgG1 (химерное гуманизированное антитело IgG1, описанное в WO 2005/044859), 11 В8 IgG1 (описанное в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Обычно анти-CD20 антитела II типа изотипа IgG1 проявляют отличительные свойства CDC. Ahth-CD20 антитела II типа обладают пониженной цитотоксичностью CDC (в случае изотипа IgG1) по сравнению с антителами I типа изотипа IgG1.

К примерам анти-CD20 антител I типа относятся, например, ритуксимаб, HI47 IgG3 (ЕСАСС, гибридома), антитело 2С6 IgG1 (описанное в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описанное в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описанное в WO 2004/056312).

Нефукозилированные анти-CD20 антитела по настоящему изобретению в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения являются анти-CD20 антителами II типа, в более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анти-CD20 антитело II типа является нефукозилированным гуманизированным антителом B-Ly1.

Нефукозилированные анти-CD20 антитела по настоящему изобретению обладают повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичностью (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC) в отличие от анти-CD20 антител, не обладающих пониженным содержанием фукозы.

Понятие «нефукозилированное анти-CD20 антитело с повышенной антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody dependent cellular cytotoxicity - ADCC)» в контексте настоящего изобретения означает нефукозилированное анти-CD20 антитело, обладающее повышенной цитотоксичностью ADCC, которую определяют каким-либо приемлемым методом, известным специалистам в данной области. Одним из известных методов анализа ADCC in vitro является следующий:

1) в анализе используют клетки-мишени, о которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемую антигенсвязывающей областью антитела;

2) в анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), выделенные из крови случайным образом выбранных здоровых доноров, в качестве эффекторных клеток;

3) анализ проводят по следующему протоколу:

i) МКПК выделяют, используя стандартные процедуры центрифугирования в градиенте плотности, и суспендируют до плотности 5×10⁶ клеток/мл в культуральной среде RPMI;

ii) клетки-мишени выращивают стандартными методами работы с тканевыми культурами, собирают на экспоненциальной фазе роста при жизнеспособности более 90%, промывают в среде для культур клеток RPMI, метят 100 микрокюри ⁵¹Cr, промывают дважды средой для культур клеток и ресуспендируют в среде для культур клеток при плотности 10⁵ клеток/мл;

iii) 100 микролитров указанной выше итоговой суспензии клеток-мишеней переносят в каждую лунку 96-луночного планшета для микротитрований;

iv) антитело серийно разводят от 4000 нг/мл до 0,04 нг/мл в среде для культур клеток и по 50 микролитров получаемых растворов антитела вносят к клеткам-мишеням в 96-луночный планшет для микротитрований, проводя исследование антитела в трех различных концентрациях, перекрывающих указанный выше диапазон концентраций;

v) для контролей максимального высвобождения (MB) в три дополнительные лунки планшета, содержащие меченые клетки-мишени, вносят 50 мкл 2% (VN) водного раствора неионного детергента (фирма Nonidet, Sigma, Сент-Луис) вместо раствора антитела (пункт iv выше);

vi) для контролей спонтанного высвобождения (СВ) в три дополнительные лунки планшета, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл среды RPMI для культур клеток вместо раствора антитела (пункт iv выше);

vii) 96-луночный планшет для микротитрования затем центрифугируют в режиме 50×g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°C;

viii) 50 микролитров суспензии МКПК (пункт i выше) вносят в каждую лунку для получения соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням 25:1 и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу 5% CO₂ при 37°C на 4 ч;

ix) супернатант без клеток из каждой лунки собирают и подсчитывают экспериментально высвобожденную радиоактивность (ЭВР), используя счетчик гамма-излучения;

x) процент специфического лизиса рассчитывают для каждой концентрации антитела по формуле (ЭВР-МВ)/(МВ-СВ)×100, где ЭВР среднюю радиоактивность подсчитывают (см. выше пункт ix) для такой концентрации антитела, MB означает среднюю радиоактивность (см. выше пункт ix), рассчитанную для контролей MB (см. выше п.V), и СВ означает среднюю радиоактивность (см. выше пункт ix), рассчитанную для контролей СВ (см. выше пункт vi);

4) «повышенная цитотоксичность ADCC» выражается или в виде повышения максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в исследованном выше диапазоне концентрации антитела, и/или снижения концентрации антитела, необходимой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, наблюдаемого в исследованном выше диапазоне концентрации антитела. Повышение величины ADCC относительно величины ADCC, измеренной с помощью указанного выше анализа, опосредованной тем же антителом, выработанным тем же типом клеток-хозяев, используя те же стандартные методы получения, очистки, переработки и хранения, которые известны специалистам в данной области, но которые не вырабатываются клетками-хозяевами, сконструированными для сверхэкспрессии GnTIII.

Указанная «повышенная цитотоксичность ADCC» может быть получена гликоинжинирингом указанных антител, что означает повышение указанных природных опосредованных клетками эффекторных функций моноклональных антител путем инжиниринга их олигосахаридного компонента согласно описанию в работах Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180, и US 6602684.

Понятие «комплементзависимой цитотоксичности (complement-dependent cytotoxicity - CDC)» относится к лизису клеток-мишеней опухоли человека антителом по настоящему изобретению в присутствии комплемента. CDC измеряют предпочтительно обработкой препарата клеток, экспрессирующих CD20, анти-CD20 антителом по настоящему изобретению в присутствии комплемента. CDC выявляют, если антитело индуцирует в концентрации 100 нМ лизис (гибель клеток) 20% или более опухолевых клеток через 4 ч. Анализ осуществляют предпочтительно с ⁵¹Cr или Eu мечеными опухолевыми клетками и измеряют высвободившиеся ⁵¹Cr или Eu. Контроли включают инкубирование опухолевых клеток-мишеней с комплементом, но без антитела.

Антитело, называемое ритуксимабом (контрольное антитело; пример анти-CD20 антитела I типа), является генетически сконструированным химерным моноклональным антителом человека гамма 1, содержащим константный домен мыши и направленным против антигена человека CD20. Такое химерное антитело содержит константные домены гамма 1 человека и обозначается «C2B8» в US 5736137. Ритуксимаб одобрен для лечения пациентов с рецидивирующей или неподдающейся лечению злокачественной или фолликулярной CD20-положительной В-клеточной неходжкинской лимфомы (НХЛ). Исследования механизма действия in vitro показывают, что ритуксимаб проявляет зависимую от комплемента человека цитотоксичность (complement-dependent cytotoxicity - CDC) (Reff М.Е. и др., Blood, 83(2), 1994, cc.435-445). Кроме того, он проявляет существенное действие в исследованиях по измерению антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Ритуксимаб не относится к нефукозилированным антителам.

Антитело	Количество фукозы
Ритуксимаб (не относится к нефукозилированным антителам)	>85%
Дикого типа нефукозилированное гликоинженерное гуманизированное антителоВ-Ly1 (B-HH6-B-KV1) (не относится к нефукозилированным антителам)	>85%
Антитело	Количество фукозы
Нефукозилированное гликоинженерное гуманизированное антитело B-Ly1 (B-HH6-B-KV1 GE)	45-50%

Понятие «гуманизированное антитело B-Ly1» относится к гуманизированному антителу B-Ly1, описанному в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое получено из моноклонального анти-CD20 антитела В-Ly1 мыши (вариабельная область тяжелой цепи мыши (VH): SEQ ID NO: 1; вариабельная область легкой цепи мыши (VL): SEQ ID NO: 2 - см. Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, c.131-139) за счет химеризации с константной областью человека из IgG1 и последующей гуманизацией (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Такие «гуманизированные антитела B-Ly1» подробно описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы последовательностей от SEQ ID N0:3 до SEQ ID N0:20 (от В-НН2 до В-НН9 и от B-HL8 до B-HL17 в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Особенно предпочтительны Seq. ID No. 3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (В-НН2, В-ННЗ, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В одном специфическом варианте осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» содержит вариабельную область легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID No. 20 (B-KV1 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). В другом специфическом варианте осуществления настоящего изобретения «гуманизированное антитело B-Ly1» содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) последовательности SEQ ID NO:7 (В-HH6 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875) и вариабельную область легкой цепи (VL) последовательности SEQ ID No. 20 (B-KV1 из WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело B-Ly1 является антителом IgG1. Согласно настоящему изобретению такие нефукозилированные гуманизированные B-Ly1 антитела являются гликоинженерными (glycoengineered - GE) в области Fc в соответствии с процедурами, описанными в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180, и WO 99/154342. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используемое анти-CD20 антитело является нефукозилированным гликоинженерным гуманизированным антителом B-Ly1, обозначаемым B-HH6-B-KV1 GE. Такие гликоинженерные гуманизированные B-Ly1 антитела обладают измененным типом гликозилирования области Fc, предпочтительно имея пониженный уровень остатков фукозы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 60% или менее от общего количества олигосахаридов в положении Asn297 (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет от 40% до 60%, в другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 50% или менее, в еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 30% или менее, и в еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения количество фукозы составляет 0%). Кроме того, в одном из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения олигосахариды в области Fc раздвоены. Такие гликоинженерные гуманизированные B-Ly1 антитела обладают повышенной ADCC.

Олигосахаридный компонент может существенно повлиять на свойства, значимые для эффективности терапевтического гликопротеина, в том числе на физическую стабильность, устойчивость к воздействию протеазы, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические показатели и специфическое биологическое действие. Такие свойства могут зависеть не только от наличия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Некоторые обобщения между структурой олигосахаридов и функцией гликопротеина могут быть получены. Например, определенные олигосахаридные структуры опосредуют быстрый клиренс гликопротеинов из кровяного русла через взаимодействия со специфическими связывающими белки углеводами, хотя другие могут быть связаны антителами и индуцируют иммунные реакции. (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol., 14, 1996, cc.975-981).

Клетки млекопитающих являются превосходными хозяевами для выработки терапевтических гликопротеинов