Лечение антителами против pcsk9

Лечение антителами против pcsk9

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке испрашивается приоритет для предварительной заявки США №61/507865, поданной 14 июля 2011 года, предварительной заявки США №61/614312, поданной 22 марта 2012 года, и предварительной заявки США №61/643063, поданной 4 мая 2012 года, все из которых тем самым являются включенными сюда посредством ссылки во всей их полноте.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение касается терапевтических схем для лечения расстройств, характеризуемых заметными повышениями уровня частиц липопротеинов низкой плотности («LDL») в плазме. Заявленные терапевтические схемы включают введение антитела против пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), одного или в комбинации со статином. Согласно заявленным терапевтическим схемам предложено усиленное снижение уровней LDL-холестерина в крови, и они могут быть использованы в предупреждении и/или лечении расстройств метаболизма холестерина и липопротеинов, включающих семейную гиперхолестеринемию, атерогенную дислипидемию, атеросклероз, острый коронарный синдром и, в более общем случае, сердечно-сосудистое заболевание.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Миллионы людей в США подвергаются риску сердечных заболеваний и возникающих в их результате кардиологических явлений. Сердечно-сосудистое заболевание и лежащий в его основе атеросклероз является ведущей причиной смерти во всех демографических группах, несмотря на доступность терапий, направленных на его многочисленные факторы риска. Атеросклероз представляет собой заболевание артерий, и он является ответственным за коронарную болезнь сердца, связанную со многими смертями в индустриально развитых странах. К настоящему времени идентифицировали несколько факторов риска для коронарной болезни сердца: дислипидемии, гипертензию, диабет, курение, плохую диету, малоподвижный образ жизни и стресс. Самые клинически релевантные и обычные дислипидемии характеризуются увеличением уровней бета-липопротеинов (липопротеины очень низкой плотности (VLDL) и LDL) с гиперхолестеринемией в отсутствие или в присутствии гипертриглицеридемии (Fredrickson et al., 1967, N Engl J Med. 276:34-42, 94-103, 148-156, 215-225 и 273-281). Существует назревшая значительная неудовлетворенная потребность в лечении сердечно-сосудистого заболевания при том, что 60-70% сердечно-сосудистых явлений, сердечных приступов и инсультов происходит, несмотря на лечение статинами (современный стандарт лечения при атеросклерозе). Кроме того, новые руководства говорят о том, что для защиты пациентов, подверженных высокому риску преждевременного сердечно-сосудистого заболевания, должны достигаться даже меньшие уровни LDL (Национальная образовательная программа по холестерину (NCEP) 2004).

PCSK9 считали главным регулятором холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) в плазме, и обнаружено, что он является многообещающей мишенью для предупреждения и лечения коронарной болезни сердца (CHD) (Hooper et al., 2011, Expert Opin Ther Targets 15(2): 157-68). В исследованиях генетики человека идентифицировали мутации приобретения функции, которые были ассоциированы с повышенными сывороточными уровнями LDL-C и преждевременными и распространенными случаями CHD, тогда как мутации потери функции были ассоциированы с низким уровнем LDL-C и с пониженным риском развития CHD (Abifadel, 2003, Nat Genet. 43(2): 154-6; Cohen, 2005, Nat Genet. 37(2):161-5; Cohen, 2006, N Engl J Med. 354(12): 1264-72; Kotowski, 2006, Am J Hum Genet. 78(3):410-22). У человека полная потеря PCSK9 приводит к низкому сывороточному уровню LDL-C, составляющему меньше 20 мг/дл, у здоровых в иных отношениях субъектов (Hooper, 2007, 193(2):445-8; Zhao, 2006, Am J Hum Genet. 79(3):514-523).

PCSK9 принадлежит к семейству субтилизина сериновых протеаз, и он образован N-концевым продоменом, субтилизин-подобным каталитическим доменом и С-концевым доменом, обогащенным цистеином/гистидином (CHRD). Будучи экспрессируемым в печени на высоком уровне, PCSK9 секретируется после автокаталитического расщепления продомена, который остается нековалентно ассоциирован с каталитическим доменом. Каталитический домен PCSK9 связывается с повтором А, подобным эпидермальному фактору роста (EGF-A), домена рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR), при рН сыворотки 7,4 и с большей аффинностью - при рН эндосом, составляющим приблизительно 5,5-6,0 (Bottomley, 2009, J Biol Chem. 284(2): 1313-23). С-концевой домен участвует в интернализации комплекса LDLR-PCSK9, не связываясь с каталитическим доменом (Nassoury, 2007, Traffic 8(7):950; Ni, 2010, J Biol Chem. 285(17): 12882-91; Zhang, 2008, Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(35): 13045-50). Обе функциональные группировки PCSK9 требуются для направленной доставки комплекса LDLR-PCSK9 для лизосомальной деградации и снижения уровня LDL-C, что согласуется с мутациями в обоих доменах, связанных с потерей функции и приобретением функции (Lambert, 2009, Atherosclerosis 203(1): 1-7).

В настоящее время разрабатываются разные терапевтические подходы для ингибирования PCSK9, включая сайленсинг гена посредством миРНК (малая интерферирующая РНК) или антисмысловых олигонуклеотидов и нарушение взаимодействия PCSK9-LDLR посредством антител (Brautbar et al., 2011, Nature Reviews Cardiology 8, 253-265). Например, и Chan, 2009, и Ni, 2011, сообщают о моноклональном антителе против PCSK9, имеющем активность, снижающую уровень LDL-C у мышей и приматов, не являющихся человеком; сообщали, что период полувыведения каждого антитела составляет приблизительно 61 ч и 77 ч, соответственно у приматов, не являющихся человеком, при введении в дозировке 3 мг/кг антагонистического антитела против PCSK9 (Chan, 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(24):9820-5; Ni, 2011, J Lipid Res. 52(1):78-86). Сообщали, что антагонистическое антитело 7D4 против PCSK9 эффективно снижает уровни сывороточного холестерина у яванского макака; период полувыведения 7D4 у яванских макаков составлял меньше чем 2 суток при одиночной дозе 10 мг/кг антагонистического антитела против PCSK9 (патентная заявка PCT WO 2010/029513).

Из информации, доступной в данной области, и имеющейся до настоящего изобретения, остается не ясным, были бы низкие, нечастые дозы антагонистического антитела против PCSK9 эффективны в уменьшении гиперхолестеринемии и ассоциированной заболеваемости CHD у пациентов-людей и, если это так, какие схемы дозировки нужны для такой эффективности in vivo.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к терапевтическим схемам для длительного снижения уровней LDL-C в крови путем ингибирования активности PCSK9 и к соответствующим эффектам PCSK9 на уровни LDL-C в плазме.

В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен способ лечения пациента-человека, подверженного расстройству, характеризующемуся повышенным уровнем холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) в крови, или у которого было диагностировано расстройство, включающий введение пациенту начальной дозы, составляющей по меньшей мере примерно 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 12 мг/кг, 50 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг или 400 мг антагонистического антитела против пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9); и введение пациенту множества последующих доз антитела в количестве, которое является примерно таким же или меньшим, чем начальная доза, где начальная доза и первая последующая, и дополнительные последующие дозы разделены во времени друг от друга по меньшей мере примерно одной, двумя, тремя или четырьмя неделями. Изобретение можно воплощать на практике, например, используя антагонистическое антитело L1L3 против PCSK9. В некоторых воплощениях изобретение можно осуществлять на практике с использованием антитела, содержащего три CDR (области, определяющие комплементарность) из вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:11, и три CDR из вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:12.

В некоторых воплощениях начальная доза может составлять примерно 0,25 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг или примерно 1,5 мг/кг, и начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени примерно одной неделей.

В других воплощениях начальная доза может составлять примерно 2 мг/кг, примерно 4 мг/кг, примерно 8 мг/кг или примерно 12 мг/кг, и начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно двумя неделями.

В других воплощениях начальная доза может составлять примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 150 мг или примерно 175 мг, и начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно двумя неделями.

В других воплощениях начальная доза может составлять примерно 3 мг/кг или примерно 6 мг/кг, и начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно четырьмя неделями. В других воплощениях начальная доза может составлять примерно 200 мг или примерно 300 мг, и начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно четырьмя неделями. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против PCSK9 вводится подкожно. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против PCSK9 вводится внутривенно.

В некоторых воплощениях начальная доза и первая последующая доза и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени примерно четырьмя неделями. В некоторых воплощениях начальная доза и первая последующая доза, и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени примерно восемью неделями. Каждая из множества последующих доз может представлять собой примерно такое же количество или меньшее, чем в начальной дозе.

В некоторых воплощениях расстройство может представлять собой гиперхолестеринемию, дислипидемию, атеросклероз, сердечно-сосудистое заболевание, коронарную болезнь сердца или острый коронарный синдром (ACS). Пациент-человек перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 может иметь общий уровень холестерина натощак, например, примерно 600 мг/дл или больше. Пациент-человек перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 может иметь уровень холестерина LDL натощак, например, примерно 130 мг/дл или больше. В некоторых воплощениях пациент-человек перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 может иметь уровень холестерина LDL натощак примерно 145 мг/дл или больше.

В некоторых воплощениях пациента лечат статином. В некоторых воплощениях пациента лечат ежесуточной дозой статина. В некоторых воплощениях пациенту-человеку перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 возможно вводили эффективное количество статина. В некоторых воплощениях перед введением начальной дозы антитела против PCSK9 пациент получает стабильные дозы статина. Стабильные дозы, например, могут представлять собой ежесуточную дозу или дозу через сутки. В некоторых воплощениях перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 пациент-человек получает ежесуточную стабильную дозу статина в течение по меньшей мере примерно двух, трех, четырех, пяти или шести недель. В некоторых воплощениях пациент-человек, получающий стабильные дозы статина, перед введением начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9 имеет уровень LDL холестерина натощак, составляющий, например, примерно 70 или 80 мг/дл.

В некоторых воплощениях данный способ кроме того включает введение эффективного количества статина.

В некоторых воплощениях начальная доза антагонистического антитела против PCSK9 может составлять примерно 3 мг/кг или примерно 6 мг/кг, и начальная доза и первая последующая доза и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени примерно четырьмя неделями или примерно одним месяцем. В некоторых воплощениях начальная доза антагонистического антитела против PCSK9 может составлять примерно 200 мг или примерно 300 мг, и начальная доза и первая последующая доза и дополнительные последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени примерно четырьмя неделями или примерно одним месяцем.

Статин может представлять собой, например, аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин, симвастатин, или комбинированную терапию, выбранную из группы, состоящей из симвастатина плюс эзетимиба, ловастатина плюс ниацина, аторвастатина плюс амлодипина и симвастатина плюс ниацина. В некоторых воплощениях доза статина может составлять, например, 40 мг аторвастатина, 80 мг аторвастатина, 20 мг розувастатина, 40 мг розувастатина, 40 мг симвастатина или 80 мг симвастатина.

В некоторых воплощениях способ включает введение пациенту начальной дозы по меньшей мере примерно 3 мг/кг или примерно 6 мг/кг антагонистического антитела L1L3 против PCSK9; и введение пациенту ряда последующих доз антитела, в количестве, которое является примерно таким же или меньшим, чем начальная доза, где начальная доза и первая последующая и дополнительные последующие дозы отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно четырьмя неделями, где пациента лечат стабильной ежесуточной дозой статина. В некоторых воплощениях стабильная ежесуточная доза статина может составлять 40 мг аторвастатина, 80 мг аторвастатина, 20 мг розувастатина, 40 мг розувастатина, 40 мг симвастатина или 80 мг симвастатина.

В некоторых воплощениях способ включает введение пациенту начальной дозы по меньшей мере примерно 200 мг или примерно 300 мг антагонистического антитела L1L3 против PCSK9; и введение пациенту ряда последующих доз антитела в количестве, которое является примерно таким же или меньшим, чем начальная доза, где начальная доза и первая последующая и дополнительные последующие дозы отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно четырьмя неделями, где пациента лечат стабильной ежесуточной дозой статина. В некоторых воплощениях способ включает введение пациенту начальной дозы по меньшей мере примерно 50 мг, примерно 100 мг, примерно 150 мг или примерно 175 мг антагонистического антитела L1L3 против PCSK9; и введение пациенту ряда последующих доз антитела в количестве, которое является примерно таким же или меньшим, чем начальная доза, где начальная доза и первая последующая и дополнительные последующие дозы отделены друг от друга во времени по меньшей мере примерно двумя неделями, где пациента лечат стабильной ежесуточной дозой статина. В некоторых воплощениях стабильная ежесуточная доза статина может составлять 40 мг аторвастатина, 80 мг аторвастатина, 20 мг розувастатина, 40 мг розувастатина, 40 мг симвастатина или 80 мг симвастатина.

В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против PCSK9 вводят подкожно или внутривенно.

Согласно изобретению также предложено изделие, содержащее контейнер, композицию в контейнере, содержащую антагонистическое антитело против PCSK9, и листок-вкладыш, содержащий инструкции по введению начальной дозы антагонистического антитела против PCSK9, составляющей по меньшей мере примерно 0,25 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 12 мг/кг, 50 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг или 400 мг, и по меньшей мере одной последующей дозы, которая представляет собой такое же или меньшее количество, чем начальная доза. В некоторых воплощениях изобретение можно осуществлять на практике с использованием антитела, содержащего три CDR из вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:11, и три CDR из вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:12. В некоторых воплощениях изобретение можно осуществлять на практике с использованием антагонистического антитела L1L3 против PCSK9.

Введение начальной дозы и последующих доз может быть отделено во времени, например, по меньшей мере примерно одной, по меньшей мере примерно двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью или восемью неделями. В некоторых воплощениях инструкции могут служить, например, для введения начальной дозы внутривенной инъекции и по меньшей мере одной последующей дозы - внутривенной или подкожной инъекции. В других воплощениях инструкции могут служить, например, для введения начальной дозы подкожной инъекции и по меньшей мере одной последующей дозы -внутривенной или подкожной инъекции.

В некоторых воплощениях можно вводить ряд последующих доз. В этом ряду последующие дозы могут быть отделены друг от друга во времени, например, по меньшей мере двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью или восемью неделями.

В некоторых воплощениях листок-вкладыш может дополнительно включать инструкции для введения антагонистического антитела против PCSK9 пациенту, которого лечат статином. Статин может представлять собой, например, аторвастатин, церивастатин, флувастатин, ловастатин, мевастатин, питавастатин, правастатин, розувастатин, симвастатин, или комбинированную терапию, выбранную из группы, состоящей из симвастатина плюс эзетимиба, ловастатина плюс ниацина, аторвастатина плюс амлодипина и симвастатина плюс ниацина.

В некоторых воплощениях изделие может дополнительно включать этикетку на контейнере или ассоциированную с ним, на которой указано, что композицию можно использовать для лечения состояния, характеризующегося повышенным уровнем холестерина липопротеинов низкой плотности в крови. На этикетке может быть указано, что композицию можно использовать, например, для лечения гиперхолестеринемии, атерогенной дислипидемии, атеросклероза, сердечно-сосудистого заболевания и/или острого коронарного синдрома (ACS).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ.1 изображен график, демонстрирующий абсолютные уровни LDL-C натощак в мг/мл после введения антитела L1L3.

На ФИГ.2 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.3 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней общего холестерина натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.4 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней аполипопротеина В натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.5 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней холестерина липопротеинов высокой плотности натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.6 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней холестерина триглицеридных липопротеинов натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.7А изображен график, демонстрирующий абсолютные уровни LDL-C натощак в мг/дл после введения антитела L1L3. На ФИГ.7Б изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак в мг/дл относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.8 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3, в присутствии или в отсутствие статина. По оси Х показано количество дозы антагонистического антитела L1L3 против PCSK9 в мг/кг.

На ФИГ.9А-Е изображены смоделированные профили во времени для L1L3 (А-В) и LDL-C (Д-Е). (А) и (Г): антагонистическое антитело L1L3 против PCSK9 в дозировке 2 мг/кг.(Б) и (Д): антагонистическое антитело L1L3 против PCSK9 в дозировке 6 мг/кг.(В) и (Е): плацебо. По оси Х показано время в сутках.

На ФИГ.10 изображены смоделированные профили во времени для LDL-C после дозирования указанных количеств дозы L1L3.

На ФИГ.11 изображена схема исследования для монотерапии L1L3.

На ФИГ.12 изображен график, демонстрирующий абсолютные уровни LDL-C натощак в мг/дл после введения антитела L1L3.

На ФИГ.13 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.14 изображена таблица, демонстрирующая среднее процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.15 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3.

На ФИГ.16 изображен график, демонстрирующий процентное изменение уровней LDL-C натощак относительно исходного уровня после введения антитела L1L3 с исключением субъектов с отсутствующими дозами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Здесь предложены терапевтические схемы для лечения расстройств, характеризуемых заметными увеличениями уровней частиц LDL в плазме. Рассматриваемые терапевтические схемы включают введение антагонистического антитела против PCSK9, одного или в комбинации со статином. Рассматриваемые терапевтические схемы обеспечивают длительное снижение уровней холестерина LDL в крови и могут использоваться в предупреждении и/или лечении расстройств метаболизма холестерина и липопротеинов, включающих семейную гиперхолестеринемию, атерогенную дислипидемию, атеросклероз, острый коронарный синдром (ACS) и, в более общем случае, сердечно-сосудистое заболевание.

Общие методики

В воплощении настоящего изобретения на практике будут использоваться, если не указано иное, традиционные методики молекулярной биологии (включая методы генной инженерии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации специалистов в данной области. Такие методики полностью объяснены в литературе, как, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Определения

«Антитело» представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную к специфичному связыванию с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного сайта распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Термин «антитело» в том виде, как он здесь используется, охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его одиночную цепь, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена, включающую, например, без ограничения, scFv, однодоменные антитела (например, антитела акул и Camelid), макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и bis-scFv (см., например, Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136). Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или его подкласс), и антитело не должно принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть приписаны к разным классам. Есть пять главных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела в том виде, как он здесь используется, относится к одному или более чем одному фрагменту интактного антитела, который сохраняет способность специфично связываться с данным антигеном (например, PCSK9). Антигенсвязывающие функции антитела могут выполняться фрагментами интактного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают Fab; Fab′; F(ab′)₂; и фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одной ручки антитела; фрагмент в виде однодоменного антитела (dAb) (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546) и выделенную область, определяющую комплементарность (CDR).

Термин «моноклональное антитело» (Mab) относится к антителу, которое происходит от одной копии или клона, и включает, например, любой клон эукариотического, прокариотического или фагового происхождения, а не способ, посредством которого оно получено. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению существует в гомогенной или по существу гомогенной популяции.

Термин «гуманизированное» антитело относится к формам антител, не являющихся человеческими (например, мышиным), которые представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab; Fab′; F(ab′)₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Предпочтительно гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в котором остатки из области, определяющей комплементарность (CDR), реципиента заменены остатками из CDR вида, не являющегося человеком (донорное антитело), такого как мышь, крыса или кролик, имеющими желательную специфичность, аффинность и эффективность.

Термин «человеческое антитело» в том виде, как он здесь используется, означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, которое может продуцироваться человеком, и/или которое было получено с использованием любой из методик для получения человеческих антител, известных специалистам в данной области или раскрытых здесь. Данное определение человеческого антитела включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Одним таким примером является антитело, содержащее полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи. Человеческие антитела можно получать с использованием разных методик, известных в данной области. В одном воплощении человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, где данная фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Человеческие антитела также могут быть получены иммунизацией животных, в которых вместо эндогенных локусов были трансгенно введены локусы человеческого иммуноглобулина, например, мышей, у которых были частично или полностью инактивированы эндогенные гены иммуноглобулинов. Данный подход описан в патентах США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425 и 5661016. В качестве альтернативы, человеческое антитело может быть получено посредством создания бессмертных человеческих В-лимфоцитов, которые продуцируют антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты можно выделять из индивидуума или можно иммунизировать in vitro) (см., например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77, 1985; Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95 и патент США №5750373).

Термин «вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо одной, либо в комбинации. Как известно в данной области, каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области, и содействует образованию антигенсвязывающего сайта антител. Если желательны варианты рассматриваемой вариабельной области, конкретно с заменой аминокислотных остатков вне области CDR (т.е. в каркасной области), подходящую аминокислотную замену, предпочтительно консервативную аминокислотную замену, можно идентифицировать путем сравнения рассматриваемой вариабельной области с вариабельными областями других антител, которые содержат последовательности CDR1 и CDR2 того же самого канонического класса, что и рассматриваемая вариабельная область (Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987). При выборе FR для фланкирования рассматриваемых CDR, например, при проведении гуманизации или оптимизации антитела, предпочтительными являются FR из антител, которые содержат последовательности CDR1 и CDR2 того же самого канонического класса.

"CDR" вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки в пределах вариабельной области, которые идентифицированы согласно определениям Kabat, Chothia, сочетанию Kabat и Chothia, AbM, контактному и/или конформационному определениям, или любым способом определения CDR, хорошо известным в данной области. CDR антитела могут быть идентифицированы как гипервариабельные области, исходно определенные Kabat et al. (см., например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.). Положения CDR также можно идентифицировать как структуры, имеющие форму петель, первоначально описанные Chothia с соавторами (см., например, Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883). Другие подходы к идентификации CDR включают «определение АbМ», которое представляет собой компромисс между определениями Kabat и Chothia и является результатом использования программы для моделирования антител АbМ от Oxford Molecular (теперь Accelrys^®), или «контактное определение» CDR, основанное на наблюдаемых контактах с антигеном, изложенное в MacCaIlum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. В другом подходе, названном здесь «конформационное определение» CDR, положения CDR можно идентифицировать как остатки, которые осуществляют энтальпический вклад в связывание антигена (см., например, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166). Кроме того, другие пограничные определения CDR могут строго не следовать одному из приведенных выше подходов, но, тем не менее, будут перекрываться по меньшей мере с частью CDR Kabat, хотя они и могут быть укорочены или удлинены в свете предсказания или экспериментальных сведений о том, что конкретные остатки или группы остатков, или даже целые CDR значимо не влияют на связывание антигена. Термин «CDR» в том виде, как он здесь используется, может относиться к CDR, определенным любым подходом, известным в данной области, включая комбинации подходов. В применяемых здесь способах могут использоваться CDR, определенные согласно любому из данных подходов. Для любого данного воплощения, содержащего более чем одну CDR, эти CDR могут быть определены согласно любому определению: по Kabat, Chothia, расширенному, АbМ, контактному и/или конформационному.

Как известно в данной области, термин «константная область» антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, либо одной, либо в комбинации.

Термин «PCSK9» в том виде, как он здесь используется, относится к любой форме PCSK9 и его вариантам, которые сохраняют по меньшей мере часть активности PCSK9. Если не указано иначе, как, например, посредством конкретной ссылки на человеческий PCSK9, PCSK9 включает PCSK9 с нативной последовательностью всех видов млекопитающих, например, человеческий, собачий, кошачий, лошадиный или коровий. Один типичный человеческий PCSK9 можно найти под номером доступа Uniprot Q8NBP7 (SEQ ID NO:1).

Термин «антагонистическое антитело против PCSK9» в том виде, как он здесь используется, относится к антителу против PCSK9, которое способно ингибировать биологическую активность PCSK9 и/или последующий(-ие) путь (пути), опосредованный(-ые) сигналингом PCSK9, включая опосредованную PCSK9 понижающую регуляцию LDLR и опосредованное PCSK9 снижение клиренса LDL в крови. Антагонистическое антитело против PCSK9 охватывает антитела, которые блокируют, оказывают антагонистический эффект, подавляют или уменьшают (в любой степени, включая значительную) биологическую активность PCSK9, включая последующие пути, опосредованные сигналингом PCSK9, такие как взаимодействие с LDLR и/или индукция клеточного ответа на PCSK9. Для цели настоящего изобретения будет недвусмысленно понятно, что термин «антагонистическое антитело против PCSK9» охватывает все ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам PCSK9, биологическая активность PCSK9 (включая ее способность опосредовать любой аспект взаимодействия с LDLR, понижающую регуляцию LDLR и пониженный клиренс LDL в крови, но не ограничиваясь ими) или последовательности биологической активности по существу исчезают, снижаются или нейтрализуются в любой значимой степени. В некоторых воплощениях антагонистическое антитело против PCSK9 связывается с PCSK9 и предотвращает взаимодействие с LDLR. Примеры антагонистических антител против PCSK9 приведены, например, в публикации заявки на патент США №20100068199, которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.

Термин «полный антагонист» в том виде, как он здесь используется, представляет собой антагонист, который, при эффективной концентрации, по существу полностью блокирует измеримый эффект PCSK9. Под частичным антагонистом подразумевается антагонист, который способен частично блокировать измеримый эффект, но который, даже при наивысшей концентрации, не является полным антагонистом. Под «по существу полностью» подразумевается по меньшей мере примерно 80%-ное, предпочтительно по меньшей мере примерно 90%-ное, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95%-ное и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 98%-ное или 99%-ное блокирование измеримого эффекта. Релевантные «измеримые эффекты» описаны здесь и включают понижающую регуляцию LDLR антагонистом PCSK9 при анализе в клетках Huh7 in vitro, снижение in vivo уровней общего холестерина в крови (или в плазме) и снижение in vivo уровней LDL в крови (или в плазме).

Термин «клинически значимый» в том виде, как он здесь используется, означает по меньшей мере 15%-ное снижение уровней холестерина LDL в крови у людей или по меньшей мере 15%-ное снижение уровня общего холестерина в крови у мышей. Очевидно, что измерения в плазме или в сыворотке могут служить в качестве заменителей измерений уровней в крови.

Термин «схема дозирования» в том виде, как он здесь используется, относится ко всему курсу лечения, назначенному пациенту, например, к лечению антагонистическим антителом против PCSK9.

Термин «непрерывный» в том виде, как он здесь используется, в контексте времени, в которое средний уровень холестерина LDL в крови находится в пределах определенного интервала уровней, означает, что время, в течение которого средний уровень находится в данном определенном интервале, не прерывается каким-либо временем, в которое данный средний уровень не находится в пределах данного определенного интервала уровней.

Термин «не непрерывный» в том виде, как он здесь используется, в контексте времени, в которое средний уровень холестерина LDL в крови находится в пределах определенного интервала уровней, означает, что время, в течение которого средний уровень находится в данном определенном интервале, прерывается некоторым количеством времени (например, 15 минут, 20 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 5 часов, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов, 20 часов, 24 часа, 28 часов, 32 часа, 36 часов, 40 часов, 44 часа, 48 часов, 60 часов, 72 часа, 84 часа, 90 часов или любой интервал времени, имеющий верхнюю и нижнюю границы из любого из приведенных выше конкретно определенного времени), в которое данный средний уровень не находится в пределах этого определенного интервала уровней.

Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для того, чтобы назвать цепи аминокислот любой длины, предпочтительно относительно короткие (например, из 10-100 аминокислот). Данная цепь м