Использование лхат для лечения анемии и дисфункции красных кровяных клеток

Использование лхат для лечения анемии и дисфункции красных кровяных клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ЗАЯВКЕ НА ПАТЕНТ

[0001] Настоящей заявкой на патент заявляется о приоритете по Предварительной заявке на патент США, серийный номер 61/186,668, поданной 12 июня 2009, и по Предварительной заявке на патент США, серийный номер 61/241,223, поданной 9 сентября 2010. Полное содержание Предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/186,668 и Предварительной заявки на патент США, серийный номер 61/241,223 включено в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение в целом относится к сфере медицины и, в частности, к лечению болезней, характеризующихся анемией и/или красными кровяными клетками, имеющими аномальные функции в отношении деформируемости, оксигенации, агрегации, метаболизма оксида азота или продолжительности жизни.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Качество и количество красных кровяных клеток (ККК), находящихся в кровотоке, часто снижается в периоды увеличенной физической нагрузки, что ведет к анемии и возрастанию риска заболеваемости и смертности. Физические нагрузки, которые связаны с развитием анемии, включают аутоиммунные заболевания, обширные оперативные вмешательства, травмы, инфекционные болезни, рак, критические заболевания, диабет, болезни печени, болезни почек, сердечную недостаточность и паразитарные болезни. Системное воспаление, о котором свидетельствуют повышенные уровни воспалительных цитокинов в кровотоке, является характерной общей чертой всех этих состояний. Даже у людей, предрасположенных к анемии из-за гемоглобинопатии, например серповидноклеточной болезни или талассемии, уровень воспалительных цитокинов часто увеличен и может обострять симптомы болезни, особенно во время кризисных эпизодов.

[0004] Одним из следствий повышенного уровня воспалительных цитокинов является сокращение производства печенью фермента лецитин-холестерин ацилтрансферазы (ЛХАТ). В норме ЛХАТ выделяется в плазму из печени, чтобы облегчить круговорот липидов в плазме и обеспечить баланс холестерина и фосфолипидов в крови и тканях, омываемых кровью. Избыточный холестерин удаляется из тканей, таких как артерии, и доставляется в печень для экскреции в составе желчи посредством процесса, известного как обратный транспорт холестерина (ОТХ). На первом этапе ОТХ холестерин переходит из тканевых клеток в липопротеины высокой плотности (ЛВП) в кровотоке. На втором этапе фермент ЛХАТ увеличивает способность ЛВП к переносу холестерина путем катализа трансэтерификации жирной кислоты от фосфатидилхолина (ФХ) (также известного как лецитин) до холестерина с формированием холестеринового эфира (ХЭ). Произведенный ХЭ накапливается в ядре ЛВП до тех пор, пока не удаляется ЛВП-рецепторами печени. ХЭ, доставленный ЛВП в печень, превращается в холестерин и желчные кислоты, которые выделяются в составе желчи.

[0005] Последствия для здоровья, вызванные уменьшением активности ЛХАТ в плазме, наиболее очевидны у людей с семейным дефицитом ЛХАТ (СДЛ), редким генетическим заболеванием, при котором активность ЛХАТ в плазме отсутствует. Отсутствие активности ЛХАТ в плазме ведет к значительному снижению содержания в плазме ХЭ, которое находит отражение в снижении ЛВП и липопротеина низкой плотности и в аккумуляции избыточного субстрата ЛХАТ в плазме. Главные последствия СДЛ для здоровья заключаются в ухудшении зрения в результате диффузного накопления липидов в роговице, возможного расстройства почек из-за аккумуляции липидов в почках (гломерулосклероз) и гемолитической анемии.

[0006] Отклонения в липидном составе липопротеинов плазмы из-за нарушений липидного обмена, таких как те, что являются результатом низкой активности ЛХАТ, связаны с изменениями в содержании липидов в ККК. Изменение липидов в ККК в ответ на изменения липидов в плазме, могут изменить функциональность и выживаемость ККК, т.к. эти свойства зависят от содержания липидов в клетке. Типы изменений липидов ККК, которые могут иметь место, обнаруживаются у пациентов, страдающих СДЛ, у которых ККК обогащены холестерином и ФХ и обеднены содержанием сфингомиелина (СМ). Свидетельство того, что эти аномалии липидов ККК зависят от липидных и липопротеиновых нарушений в плазме, являющихся результатом дефицита ЛХАТ, было получено в эксперименте, где временная нормализация содержания холестерина в ККК произошла после переливания больному СДЛ нормальной плазмы (Muryama et al., Амер. ж-л. Гематол. 16: 129-137, 1984). Эта временная нормализация липидов ККК могла произойти из-за пополнения ЛХАТ, ЛВП, аполипопротеина А-1 или других факторов плазмы, которые отсутствуют или значительно снижены у пациентов с СДЛ.

[0007] В менее тяжелых случаях уменьшения активности ЛХАТ в плазме не наблюдается связи между анемией и активностью ЛХАТ. Например, пациенты с заболеванием «рыбий глаз», мягкой формой дефицита ЛХАТ, проявляют активность ЛХАТ, составляющую менее 30% от нормальной активности ЛХАТ в плазме, но имеют нормальный гемоглобин и гематокрит (Rousset et al. Общепризнанные мнения в области иммунологии, Диабет, ожирение и обмен веществ, 16: 163-171, 2009). Сходным образом, при изучении пациентов с заболеваниями печени не найдено корреляции между пониженной активностью ЛХАТ и анемией (L.W.Powell et al. (1975) Австралийский и Новозеландский медицинский журнал, 5: 101-107) или между активностью ЛХАТ и аномалиями липидов ККК (RA Cooper et al. (1972) Журнал клинических исследований, 51: 3182-3192).

[0008] Хотя наблюдаются вредные изменения липидов ККК у тех, кто испытывает физический стресс, сходные с теми, которые обнаруживаются у пациентов с СДЛ, отсутствует явная связь между ЛХАТ и уровнем липидов в ККК. Примеры аномального состава липидов ККК включают сообщения об увеличенном отношении ФХ/СМ в ККК, выделенных из организма пациентов с заболеванием печени и пациентов с дислипидемией вследствие дефицита липопротеиновой липазы или болезнью Танжера. Мы (Фиг.1) и другие также обнаружили увеличение отношения ФХ/СМ в ККК пациентов с серповидноклеточной болезнью, не находящихся в кризисе. Кроме того, имеются сообщения об увеличении содержания холестерина в ККК у лиц, страдающих диабетом, болезнями сердца (включая острые коронарные синдромы), гиперхолестеринемией, серповидноклеточной анемией, и лиц после космического полета.

[0009] Последствия модификации липидного состава ККК не до конца известны, но в случае роста содержания в ККК холестерина доказано, что активность мембранных протеинов становится аномальной. Обогащенные холестерином ККК пациентов с заболеваниями печени показывают сниженную активность Mg++ АТФазы и ацетилхолинэстеразы. Обогащение холестерином связано с повышенным переносом фосфатидилсерина от внутренней стороны клеточной мембраны к внешней, что является сигналом для увеличения клиренса ККК ретикулоэндотелиальной системой. Увеличение холестерина ККК может снизить деформируемость ККК и стать причиной аномальной морфологии ККК, оба явления могут ухудшить прохождение эритроцитов через капилляры. Трансмембранный обмен газов, сущностная функция ККК, также подвергается воздействию повышения холестерина.

[0010] Современные данные говорят о том, что аномальный липидный состав ККК может иметь вредное влияние на функцию красных кровяных клеток, и, следовательно, есть потребность в способах нормализации липидного состава ККК и лечения дисфункции красных кровяных клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] В литературе нет единодушия относительно корреляции между ЛВП-X (холестерином липопротеинов высокой плотности) и эндогенной активностью ЛХАТ. Мы сделали неожиданное открытие, что увеличение уровня ЛХАТ в плазме путем инъекции рекомбинантной человеческой ЛХАТ вызывает быстрое удаление холестерина из тканей. Дополнительно, быстро увеличивалось содержание ЛВП-Х. Обусловленные равновесием, которое существует между ЛВП и ККК, эти неожиданные результаты означают, что инфузия ЛХАТ также может быть использована для быстрой коррекции липидных аномалий кровяных клеток и улучшить функцию кровяных клеток.

[0012] Часто сообщается, что уровни ЛВП-Х в плазме уменьшаются в случаях физического стресса, например: аутоиммунных заболеваний, обширных оперативных вмешательств, травм, инфекционных болезней, рака, критических заболеваний, диабета, болезней печени, болезней почек, сердечной недостаточности и паразитарных болезней, и могут быть важным фактором в возникновении отклонений липидного состава ККК, в свете прямого липидного обмена между ККК и липопротеинами. Анемия широко распространена в случаях, где наблюдается уменьшение ЛВП.

[0013] Настоящее раскрытие относится к способам модуляции содержания липидов в мембранах красных кровяных клеток путем увеличения концентрации ЛХАТ и/или активности до уровней, превышающих нормальную концентрацию и/или активность ЛХАТ в организме человека введением терапевтически эффективных доз ЛХАТ.

[0014] Одним из вариантов раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, введением ему терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0015] Другим вариантом является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или красными кровяными клетками со сниженной деформируемостью, пониженной оксигенацией, пониженной функцией оксида азота, увеличенной адгезией и/или агрегацией, или уменьшенным временем жизни, или любым сочетанием этих явлений, введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0016] В другом варианте, способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся анемией или красными кровяными клетками со сниженной деформируемостью, пониженной оксигенацией, пониженной функцией оксида азота, увеличенной адгезией и/или агрегацией, или уменьшенной продолжительностью жизни, или любым сочетанием этих явлений, включая определение исходной деформируемости ККК, или оксигенации ККК, или агрегации ККК, или адгезии ККК, или продолжительности жизни ККК; введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение изменений, вызванных введением ЛХАТ, где увеличение деформируемости ККК, или оксигенации ККК, или уменьшение агрегации или адгезии ККК, или увеличение продолжительности жизни ККК указывает на улучшение состояния.

[0017] В некоторых вариантах, состояние, при котором проводится лечение, представляет собой серповидноклеточную болезнь, диабет, талассемию, ревматоидную болезнь, аутоиммунное заболевание, артрит, болезнь печени, цирроз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, слабоумие, анемию или микрососудистые расстройства, воспалительные заболевания, паразитарное заболевание, эректильную дисфункцию, рак, преэклампсию, критическое заболевание или травму.

[0018] Другой вариант представляет способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся высоким уровнем ФХ в мембранах ККК, включающий введение пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся высоким уровнем ФХ в мембранах ККК, включая определение исходного отношения ФХ к ФЛ; назначением пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение соотношения ФХ к ФЛ, появляющегося после введения ЛХАТ, причем уменьшение отношения ФХ к ФЛ указывает на улучшение состояния. Другой вариант представляет собой способ уменьшения содержания ФХ в кровяных клетках пациента, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0019] Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся увеличением соотношения ФХ/СМ в мембранах ККК, включающий в себя введение пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другой вариант представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся увеличением соотношения ФХ/СМ в мембранах ККК, включающий определение исходного соотношения ФХ/СМ; введением пациенту, в случае необходимости в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ; и определение соотношения ФХ/СМ после введения ЛХАТ, где уменьшение отношения ФХ к СМ указывает на улучшение состояния. Другой вариант представляет собой способ уменьшения соотношения ФХ/СМ кровяных клеток пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

[0020] Фигура 1 показывает фосфолипидный состав ККК нормальных пациентов и пациентов с серповидноклеточной болезнью.

[0021] Фигура 2 представляет собой график, изображающий увеличение уровня ЛВП-Х в плазме трансгенных мышей с геном, кодирующим человеческий аполипопротеин А-1, после инъекции ЛХАТ.

[0022] Фигура 3 изображает содержание холестерина в тканях трансгенных мышей гибридной линии, у которых сочетается нокаут гена ЛХАТ и экспрессия аполипопротеина А-1, после инъекции рекомбинантной человеческой ЛХАТ.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0023] Термин «терапевтически эффективное количество», используемый в настоящем документе, означает количество ЛХАТ, введенное в соответствии с желательным режимом лечения, при котором будет выявлен желательный терапевтический эффект или отклик. Предпочтительное терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество ЛХАТ, которое увеличивает уровень значений ЛХАТ в плазме до значений, превышающих нормальные.

[0024] Используемый в настоящем документе термин «уровень ЛХАТ» относится к концентрации ЛХАТ в плазме.

[0025] Используемый в настоящем документе термин «нормальный уровень» ЛХАТ означает концентрацию ЛХАТ в плазме, которая присутствует в среднем здоровом субъекте, не проходившем лечения, не получающем в данный момент никаких медикаментов, которые могли бы изменить уровни ЛХАТ. «Нормальный уровень» и «эндогенный уровень» используются здесь взаимозаменяемым образом.

[0026] Чтобы избежать сомнения, имеющиеся в настоящем документе ссылки на «лечение» и «способ лечения» включают целебное, паллиативное и профилактическое лечение.

[0027] «Субъект» и «Пациент» используются взаимозаменяемым образом.

[0028] «Между» используется в настоящем документе со ссылкой на эффективное количество или объединенную дозу, включительно, например, «между 1 мг и 5000 мг» включает 1 мг и 5000 мг.

[0029] «От» используется в настоящем документе со ссылкой на эффективное количество или единую дозу, включительно, например, «от 1 мг до 5000 мг» включает 1 мг и 5000 мг.

[0030] «СХ» является аббревиатурой для свободного холестерина и в используемом в настоящем документе значении означает не-этерифицированный холестерин.

[0031] «Функция оксида азота» означает процессы, в которых ККК играют роль посредника и которые зависят от оксида азота, включая производство оксида азота, доставку оксида азота в микрососуды, ингибирование адгезии тромбоцитов и лейкоцитов, вазодилатацию, деформируемость ККК и выживаемость ККК.

[0032] «ФХ» является аббревиатурой для фосфатидилхолина.

[0033] «СМ» является аббревиатурой для сфингомиелина.

[0034] «Деформируемость ККК» означает способность клеток адаптировать свою форму к динамически меняющимся условиям течения в направлении минимизации их сопротивления течению и обеспечения их прохода через просвет мелких кровеносных сосудов. Пониженная деформируемость приравнивается к увеличенной жесткости.

[0035] «Вектор генной терапии» означает агент, который используется для внедрения и активизации экспрессии целевого гена в хромосомах клеток паренхимной ткани. Например, аденовирус, перестроенный, чтобы нести ген ЛХАТ человека.

[0036] «Осмотическая хрупкость» означает чувствительность клеток к разрыву из-за изменений окружающего осмотического давления.

[0037] «Агрегируемость ККК» означает способность формировать многоклеточные агрегаты, обычно в форме монетных столбиков, в присутствии белков плазмы или других макромолекул.

[0038] «ЛХАТ» используется взаимозаменяемым образом с «лецитин-холестерин ацилтрансфераза».

[0039] «ЖАТ» или «ЛХАТ полипептид», когда используются в настоящем документе, включают нативную последовательность ЛХАТ, варианты ЛХАТ, модифицированную ЛХАТ и химерную ЛХАТ. Чтобы точно определить позиции аминокислот в последовательности ЛХАТ, делается ссылка на последовательность SEQ ID NO: 1

Человеческая ЛХАТ SEQ ID NO: 1 (Код доступа Генбанка №ААВ34898)

[0040] Специфичные аминокислоты в белковой последовательности нативной человеческой ЛХАТ записаны с использованием однобуквенных обозначений аминокислот, следующих друг за другом в белковой последовательности, например, W2 означает, что позицию 2 занимает триптофан. Чтобы представить замещение в конкретной позиции, замещающая аминокислота ставится следующей в эту же позицию, например W2Y означает, что триптофан в позиции 2 замещен тирозином.

[0041] «Нативная последовательность ЛХАТ» включает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, одинаковую с ЛХАТ, выделенной из природного объекта. Так, нативная последовательность ЛХАТ специфически включает в себя встречающиеся в природных условиях усеченные формы ЛХАТ, встречающиеся в природных условиях аллельные варианты ЛХАТ, встречающиеся в природе различные формы (например, формы, обязанные своим происхождением альтернативному сплайсингу). Предпочтительная нативная последовательность ЛХАТ - зрелая нативная последовательность ЛХАТ.

[0042] «Модифицированная ЛХАТ» означает полипептид, где одна или более аминокислот в нативном полипептиде ЛХАТ замещены другой аминокислотой, или одна или большее число аминокислот добавлены к части нативного полипептида, включая, не ограничиваясь ими, N-концевые и С-концевые аминокислоты. В качестве неограничивающего примера модифицированная ЛХАТ может быть представлена модифицированным белком ЛХАТ, описанным в Предварительной заявке на патент США №12/179,815. В других вариантах, одна или более аминокислот замещены путем консервативного замещения. Неограничивающие примеры консервативных замещений приведены в Таблице 2. В других вариантах, одна или более аминокислот замещены не встречающейся в природных условиях аминокислотой. Дополнительно, модифицированные полипептиды ЛХАТ включают производные ЛХАТ или модифицированную ЛХАТ. Эти производные могут, например, улучшать растворимость, абсорбцию, биологическую продолжительность полужизни полипептидов. Производные полипептидов хорошо известны специалистам в данной области. Специалисту в данной области будет известно, как изменить полипептиды, чтобы улучшить их фармакологические свойства.

ТАБЛИЦА 2
Исходный остаток	Примерные консервативные замещения
А	G, S
R	K
N	Q, Н
D	Е
С	S
Q	N
Е	D
G	А, Р
Н	N, Q
I	L, V
L	I, V
K	R, Q, E
M	L, Y, I
F	М, L, Y
S	Т
Т	S
W	Y
Tyr	W, F
Val	I, L

[0043] Настоящее раскрытие направлено на способы лечения пациентов, имеющих состояния, характеризующиеся анемией или дисфункцией красных кровяных клеток, введением пациенту, нуждающемуся в этом, агента, который увеличивает активность ЛХАТ, или увеличивает уровень ЛХАТ в плазме, или оказывает оба эффекта. Уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ могут быть увеличены любыми доступными способами. Это включает, без ограничения, прямое введение ЛХАТ, экспрессию ЛХАТ посредством генной терапии и направленную на повышение уровня регуляцию эндогенной ЛХАТ посредством введения лекарств.

[0044] В одном из примеров, уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ увеличивается прямым введением ЛХАТ. Предпочтительно, ЛХАТ, которую вводят в способах согласно настоящему раскрытию, представляет собой продуцированную рекомбинантым путем человеческую ЛХАТ (например, с использованием животных, клеток млекопитающих, грибов, клеток насекомых или растений в качестве систем для экспрессии рекомбинантного белка). Способы производства белков рекомбинантным путем хорошо известны специалистам. ЛХАТ также может быть получена любым подходящим способом, например путем выделения из человеческой плазмы. ЛХАТ может быть подготовлена в формах постоянного объема или единой дозы. В одном из вариантов, уровень активности ЛХАТ увеличивается путем использования генной терапии. Используемый здесь термин «генная терапия» относится к переносу и, предпочтительно, устойчивой интеграции новой генетической информации в клетки субъекта. Способы увеличения уровней активности ЛХАТ путем генной терапии подразумевают трансфецирующие клетки с нуклеиновой кислотой, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую экспрессию ЛХАТ. Трансфецированные клетки осуществляют экспрессию ЛХАТ и выделяют ее в плазму субъекта. Клетки трансфецируются в достаточном числе или таком, чтобы обеспечить экспрессию ЛХАТ, достаточную для увеличения количества ЛХАТ до терапевтически эффективного уровня. Гены, кодирующие ЛХАТ, могут быть введены субъекту любым подходящим способом. В одном из вариантов, гены внедряются в клетки индивида in-vivo с помощью векторов экспрессии. В другом варианте, гены вводятся в клетки ex-vivo, и трансфецированные клетки, которые осуществляют экспрессию и секрецию ЛХАТ, вводятся субъекту. В подходах in-vivo, мишенями трансфекции являются клетки печени. Клетки печени продуцируют ЛХАТ, т.к. они обладают возможностями для выработки рекомбинантного белка. Кроме того, векторы, инъецированные в кровоток, быстро проходят через печень, так что клетки печени быстрее других подвергаются воздействию векторов. Кроветворные стволовые клетки также используются в качестве мишеней для генной терапии, потому что они быстро размножаются, тем самым создавая большее количество клеток, способных продуцировать ЛХАТ. Подходы ex-vivo также привлекательны, т.к. они допускают больший контроль над процессом трансфекции. Например, трансфецированные клетки могут быть протестированы и выбраны те, которые осуществляют экспрессию ЛХАТ в наиболее высоких количествах. Кроветворные стволовые клетки могут быть взяты у субъекта, трансфецированы ex-vivo и повторно введены пациенту. Поэтому, в одном из вариантов, клетки представляют собой клетки субъекта. Способы трансфецировать гены в клетки млекопитающих, как in-vivo, так и ex-vivo, и добиться их экспрессии хорошо известны в данной области.

[0045] Данное раскрытие относится к способам модуляции содержания липидов мембран красных кровяных клеток путем повышения уровней содержания и/или активности ЛХАТ свыше нормальных уровней содержания ЛХАТ в человеческом организме. Одним из вариантов раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Другим вариантом воплощения данного раскрытия является способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся дисфункцией красных кровяных клеток, включающий в себя введение субъекту терапевтически эффективного количества лекарства, которое увеличивает эндогенное продуцирование ЛХАТ или увеличивает активность ЛХАТ. В особых вариантах, лекарство представляет собой маленькую молекулу терапевтического агента.

[0046] Некоторые варианты направлены на способы нормализации содержания ФХ клеточных мембран ККК путем увеличения уровней ЛХАТ или активности ЛХАТ в организме пациента, который нуждается в этом. Один из вариантов согласно настоящему раскрытию представляет собой способ лечения пациента, имеющего состояние, характеризующееся наличием ККК с увеличенным содержанием ФХ, путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ нуждающемуся в этом пациенту. Увеличение уровней ЛХАТ быстро вызывает чистый переход ФХ из ККК в ЛВП, таким образом изменяя состав мембраны ККК в направлении более текучего состояния. Это действие увеличивает оксигенацию ККК, улучшает реологию (увеличивает деформируемость, текучесть, уменьшает экстернализацию фосфатидилсерина, уменьшает склонность к адгезии и агрегации), уменьшает анемию (уменьшает механический стресс и деструкцию, связанные со снижением деформируемости, увеличивает длительность жизни ККК) и увеличивает способность ККК к оксигенации тканей, в особенности периферических тканей. В некоторых вариантах, эритропоэз увеличивается вследствие введения терапевтически эффективного количества ЛХАТ. В некоторых вариантах, функция оксида азота увеличивается после введения терапевтически эффективного количества ЛХАТ. Существует много состояний, при которых клеточные мембраны ККК имеют повышенные уровни ФХ по отношению к уровням содержания фосфолипидов. Увеличение содержания ФХ в мембранах кровяных клеток присутствует при ряде болезненных состояний, включая, не ограничиваясь ими, серповидноклеточную болезнь, диабет, талассемию, ревматоидную болезнь, аутоиммунное заболевание, артрит, заболевание печени, цирроз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, деменцию, анемию или микрососудистые нарушения, воспалительные заболевания, паразитарные болезни, эректильную дисфункцию, рак, преэклампсию, критическое заболевание или травму.

[0047] Несмотря на отсутствие в этих заболеваниях первичной патологии, изменение состава и функции ККК ведет к обострению заболеваемости подчиненными расстройствами. Таким образом, одним из вариантов настоящего раскрытия является способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистыми нарушениями, воспалительными заболеваниями, паразитарными болезнями, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ пациенту, нуждающемуся в этом.

[0048] Мутации гена гемоглобина, такие как наблюдаемые при серповидноклеточной болезни (СКБ), талассемиях и формировании гемоглобина Е (Гб Е), могут выразиться во множестве патологий, которые уменьшают деформируемость ККК и их способность переносить/доставлять кислород. Например, СКБ представляет собой наследственное расстройство, вызываемое одиночным замещением аминокислоты в субъединице бета-глобулина гемоглобина (Гб С). В условиях низкого содержания кислорода, ГбС полимеризуется (подвергается агрегации), что приводит к изменению формы ККК из нормальной вогнутой в «серповидную». Формирование жестких полимеров ГбС уменьшает эластичность или деформируемость ККК, что вредит их функции, т.к. для оксигенации тканей они должны быть способны многократно проходить сквозь капилляры, в четыре раза меньше их собственного размера. Следовательно, серповидная форма ведет к вазоокклюзивному расстройству из-за окклюзии посткапиллярных венул всех размеров и увеличивает хрупкость ККК, приводя к лизису и гемолитической анемии. Хотя выработка серповидноклеточных эритроцитов при низком содержании кислорода вызывает острый кризис и главные проблемы, связанные с этим заболеванием, ККК пациентов, не подверженных серповидноклеточной деформации, при нормальном содержании кислорода, имеют более жесткие мембраны с пониженной деформируемостью и повышенной способностью к агрегации. Химический анализ мембран эритроцитов пациентов с СКБ также показывает увеличение содержания ФХ. Дополнительно эти пациенты имеют низкий уровень ЛВП с пониженным содержанием холестеринового эфира (ХЭ), подразумевающим пониженную активность ЛХАТ или функциональный дефицит ЛХАТ. Фактически, в одном из исследований было показано уменьшение на 30% активности ЛХАТ у пациентов с СКБ. Соответственно, один из вариантов настоящего раскрытия представляет способ лечения пациента, имеющего серповидноклеточную болезнь, введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0049] Инъецирование высоких уровней ЛХАТ, например количества, которое приводит к увеличению эндогенной активности ЛХАТ от двухкратного до 1000-кратного у пациентов с СКБ, вызвало бы выход ФХ из ККК и сопутствующее увеличение уровней ЛВП-Х в плазме. Снижение содержания ФХ в ККК привело бы к увеличению деформируемости ККК и улучшило бы уровень кислородного обмена. Улучшенная функция ККК может уменьшить случаи окклюзии, как из-за улучшенной способности крови к течению, так и из-за пониженного уровня выработки серповидноклеточных эритроцитов (благодаря лучшей ре-оксигенации ККК). В другом варианте, введение терапевтически эффективного количества ЛХАТ пациенту, нуждающемуся в этом, увеличивает деформируемость ККК и оксигенацию ККК. В некоторых вариантах, продолжительность жизни ККК увеличивается вследствие введения ЛХАТ.

[0050] В случае заболевания печени, содержание холестерина в ККК растет и часто возникает анемия. Терапия ЛХАТ будет нормализовать содержание холестерина в ККК, восстанавливать нормальную форму и функцию подвергшихся воздействию ККК, снижать деструкцию ККК, увеличивать продолжительность их жизни, тем самым уменьшая склонность к анемии. Таким образом, еще одним вариантом является способ лечения пациента, страдающего анемией, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества ЛХАТ.

[0051] Анемия мишеневидных клеток и шпоровидных клеток (акантоцитоз). Шпоровидные клетки и мишеневидные клетки имеют увеличенное содержание ФХ, ведущее к снижению функции и увеличению гемолиза и анемии.

[0052] В состояниях, таких как сепсис, ревматические болезни и воспалительные заболевания (включая анемию воспаления), существует множество патологий, таких как снижение деформируемости ККК и аномальная реология, которые ведут к дальнейшим осложнениям. Вред, нанесенный системам тканей и органов из-за пониженной оксигенации и увеличенной агрегации ККК, ведет к росту заболеваемости и смертности, начиная с инициального воспалительного удара. Следовательно, еще один вариант является способом уменьшения агрегируемости ККК путем введения пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества ЛХАТ. ЛХАТ может также воздействовать на окисленные фосфолипиды, появляющиеся в период воспаления. Окисленные липиды очень реактивны и могут увеличить вред, наносимый клеткам и системам органов. Нормализация липидов мембран ККК улучшила бы течение крови и оксигенацию тканей и уменьшила бы концентрацию реактивных окисленных липидов. Это было бы полезно после оперативных вмешательств, где скрытые инфекции могут снижать функцию ККК, увеличивая время заживления ран.

[0053] Микрососудистые расстройства могут случаться, когда увеличивается содержание ФХ в ККК, таким образом вызывая твердость, увеличивая адгезию и агрегируемость ККК. Эти изменения увеличиваются при слабом течении (или низком давлении) крови, обнаруживаемом в капиллярах и венулах. Когда ККК не способны деформироваться правильно, их прохождение существенно замедляется в этих мелких сосудах. С увеличением склонности к агрегации и адгезии появляется высокая вероятность блокады периферических сосудов. В органах, где микрососуды являются критическими для нормального функционирования (например, глазах, ушах, мозге, почках, пенисе, легких), повторные ишемические события в этих сосудах могут вести к потере функции (например, слепоте, потере слуха, почечной недостаточности, ишемическому микрососудистому поражению мозга (например, деменции, болезни Альцгеймера), эректильной дисфункции). Лечение ЛХАТ уменьшило бы содержание ФХ в ККК, улучшило реологию ККК, снизило бы риск дальнейшего возникновения сосудистых блокад и прекратило бы повреждение органов.

[0054] Как показано в Примере 1 настоящего раскрытия, мыши с приблизительно 30-кратным нормальным уровнем активности ЛХАТ имели увеличенную массу ККК по сравнению с нормальными мышами, что показывает, что активность ЛХАТ является главным фактором в регуляции массы ККК и в связи с этим может лимитировать ее уровень.

[0055] Таким образом, введение высокой дозы ЛХАТ, например, в диапазоне от 1-кратной до 1000-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ, или от 1-кратной до 500-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ, или от 1-кратной до 100-кратной от эндогенного уровня ЛХАТ пациенту, имеющему состояние, характеризующееся аномальной реологией (анемия, пониженная деформируемость, увеличенная агрегация, пониженная текучесть, уменьшенная продолжительность жизни ККК) привело бы к улучшению состояния.

[0056] Таким образом, еще один вариант представляет способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ. Еще одним вариантом настоящего раскрытия является способ лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения лекарства, которое увеличивает активность ЛХАТ или уровень ее содержания. В предпочтительных вариантах, лекарство представляет собой маленькую молекулу, обладающую терапевтическим действием. В другом варианте, уровень ЛХАТ и/или активность ЛХАТ увеличиваются с помощью генной терапии.

[0057] Еще один вариант представляет собой способ лечения пациента, страдающего деменцией, связанной с болезнью Альцгеймера, путем введения терапевтически эффективной дозы ЛХАТ. Другой вариант представляет собой метод лечения пациента с серповидноклеточной болезнью, диабетом, талассемией, ревматоидной болезнью, аутоиммунным заболеванием, артритом, заболеванием печени, циррозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцией, анемией или микрососудистым расстройством, воспалительным заболеванием, паразитарной болезнью, эректильной дисфункцией, раком, преэклампсией, критическим заболеванием или травмой путем введения терапевтически эффективной дозы модифицированной ЛХАТ. В некоторых вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит консервативную аминокислотную замену. В некоторых вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит замещение в позиции F1, L3, N5, L7, С31, N384 или Е416. В различных вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит аминокислотное замещение в позиции ЗЕВ других вариантах воплощения, модифицированная ЛХАТ содержит C31Y замещение и замещение одного или более аминокислотных остатков F1, L4, L32, N34. В другом варианте воплощения, модифицированная ЛХАТ содержит замену C31Y и одну или более из следующих замен: F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F или L32H. В различных вариантах, модифицированная ЛХАТ содержит одно или более из следующих замещений: F1A, F1G, F1I, F1L, F1M, F1P, FIV, F1Y, F1T, F1Q, F1N, F1H, F1D, L3I, L3F, L3C, L3W, L3Y, L4A, L4I, L4M, L4F, L4V, L4W, L4Y, L4T, L4Q, L4R, N5A, N5M, N5H, N5K, N5D, N5E, L7M, L7R, L7E, C31A, C31I, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R, C31H, N384C, N384Q, или E416C. В других вариантах, уровень ЛХАТ у пациента увеличивается с использованием техники генной терапии. В других вариантах, экспрессия ЛХАТ повышается с помощью введения лекарства.

[0058] В способах, согласно настоящему раскрытию, ЛХАТ обычно вводится субъекту в составе фармацевтической композиции, которая включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Фармацевтическая композиция может быть создана в соответствии с обычными методиками, как фармацевтическая композиция, адаптированная к выбранному пути введения препарата, т.е. пероральным, парентеральным, внутривенным, внутримышечным или подкожным путем.

[0059] Фармацевтические к