Полипептиды

Полипептиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область настоящего изобретения

Настоящее раскрытие относится к классу сконструированных полипептидов со связывающей аффинностью к альбумину. Оно также относится к новым способам и применениям, в которых используется связывание этих и других соединений с альбумином в разных контекстах, некоторые из которых имеют значимость для лечения заболевания у млекопитающих, включая людей.

Предпосылки к созданию настоящего изобретения

Сывороточный альбумин

Сывороточный альбумин представляет собой имеющийся в наибольшем изобилии белок в сыворотках млекопитающих (40 г/л; примерно 0,7 мМ у людей), и одной из его функций является связывание молекул, таких как липиды и билирубин (Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985). Сывороточный альбумин лишен любой ферментативной или иммунологической функции. Более того, человеческий сывороточный альбумин (HSA) является природным переносчиком, вовлеченным в эндогенный перенос и доставку многочисленных природных а также терапевтических молекул (Sellers and Koch-Weser, Albumin Structure. Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159. 1977). Время полужизни сывороточного альбумина прямо пропорционально размеру животного, причем, например, человеческий сывороточный альбумин имеет время полужизни 19 дней, а сывороточный альбумин кролика имеет время полужизни приблизительно 5 дней (McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004). HSA широко распространен по всему организму, в частности, в интерстициальном и кровеносном компартментах, где он главным образом вовлечен в поддержание осмолярности. Структурно альбумины представляют собой одноцепочечные белки, включающие три гомологичных домена и, в общей сложности, 584 или 585 аминокислот (Dugaiczyk el: al, Proc Nati Acad Sci USA 79:71, 1982). Альбумины содержат 17 дисульфидных мостиков и отдельный реакционно-способный тиол, цистеин в положении 34, но лишены N-связанных и O-связанных углеводных остатков (Peters, 1985, supra; Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000).

Слияние или ассоциация с HSA приводит к увеличенному времени полужизни белков in vivo

Сообщалось о нескольких стратегиях либо ковалентного присоединения белков непосредственно к сывороточным альбуминам, либо к пептиду или белку, который даст возможность in vivo ассоциации с сывороточными альбуминами. Примеры последнего подхода были описаны, например, в документе W091/01743, в документе WO 01/45746 и в Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002). В первом документе описывается inter alia применение альбумин-связывающих пептидов или белков, полученных из белка G (SpG) стрептококка, для увеличения времени полужизни других белков. Идея состоит в том, чтобы слить полученный из бактерий альбумин-связывающий пептид/белок с представляющим терапевтический интерес пептидом/белком, который, как было показано, быстро элиминируется из крови. Таким образом, созданный гибридный белок связывается с сывороточным альбумином in vivo и приобретает преимущества благодаря своему более длинному периоду времени полужизни, который увеличивает общее время полужизни слитого представляющего терапевтический интерес пептида/белка. WOO 1/45746 и Dennis et al относятся к той же самой концепции, но в данном случае авторы используют относительно короткие пептиды для связывания сывороточного альбумина. Пептиды выбирали из библиотеки пептидов полученной с помощью фагового дисплея. В Dennis et al, упоминается ранняя работа, в которой было обнаружено усиление иммунологического ответа на рекомбинантное слияние альбумин-связывающего домена белка G стрептококка с человеческим комплементарным рецептором типа 1. Заявка на патент США, опубликованная как US 2004/0001827 (Dennis), также раскрывает применение конструкций, включающих пептидные лиганды, снова идентифицированные с применением метода фагового дисплея, которые связываются с сывороточным альбумином и которые конъюгированы с биоактивными соединениями для направленной доставки терапевтического соединения в область опухоли.

Альбумин-связывающие домены бактериальных рецепторных белков

Белок G стрептококка (SpG) является бифункциональным рецептором, присутствующим на поверхности определенных штаммов стрептококков и способным к связыванию как с IgG, так и сывороточным альбумином (Bjorck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). Структура является в высокой степени повторяющейся с несколькими структурно и функционально разными доменами (Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), более точно три Ig-связывающие домена и три домена, связывающие сывороточный альбумин (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). Была определена, структура одного из трех доменов, связывающих сывороточный альбумин в SpG, показывающая укладку в пучок из трех спиралей (Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). Мотив из 46 аминокислот определили как ABD ((albumin binding domain) альбумин-связывающий домен) и впоследствии также обозначили как G148-GA3 (GA - для связывания альбумина с G-родственным белком). Например, в документе WO 09/016043 раскрыты альбумин-связывающие варианты из мотива ABD из 46 аминокислот.

Также идентифицировали другие бактериальные альбумин-связывающие домены отличные от таковых в белке G, некоторые из которых структурно похожи на таковые белка G. Примерами белков, содержащих такие альбумин-связывающие домены, являются РАВ, PPL, MAG и ZAG белки (Rozak et al. Biochemistry 45:3263-3271, 2006). Исследования структуры и функции таких альбумин-связывающих доменов провели и опубликовали, например, Johansson с сотрудниками (Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997). Более того, Rozak et а1 сообщили о создании искусственных вариантов G148-GA3, которые были выбраны и исследованы в отношении специфичности и стабильности у разных видов (Rozak et а1, Biochemistry 45:3263-3271, 2006), тогда как Jonsson et al разработали искусственные варианты G148-GA3 с гораздо более улучшенной аффинностью к человеческому сывороточному альбумину (Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008). Для некоторых вариантов достигли более высокой аффинности за счет сниженной термостабильности.

В дополнение к белкам, содержащим три спирали, описанным выше, существуют также другие неродственные бактериальные белки, которые связывают альбумин.

ABD и иммунизация

За последнее время несколько Т- и В-клеточных эпитопов были экспериментально идентифицированы в пределах альбумин-связывающей области белка G штамма стрептококка 148 (G148) (Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003). Авторы в основе исследования интересовались использованием Т-клеточных эпитопов G148 в вакцинах, т.е. чтобы использовать врожденное иммуностимулирующее свойство альбумин-связывающей области. Goetsch et al дополнительно обнаружили В-клеточный эпитоп, т.е. область, связываемую антителом после иммунизации, в последовательности G148.

В фармацевтических композициях для введения человеку иммунный ответ является нежелательным. Таким образом, альбумин-связывающий домен G148 является как таковой непригодным для применения в таковых композициях вследствие вышеупомянутых иммуностимулирующих свойств.

Описание

Вышеупомянутые недостатки и неточности предыдущего уровня техники преодолеваются или уменьшаются в первом аспекте альбумин-связывающим полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из:

i) LAX₃AKX₆X₇ANX₁₀ ELDX₁₄YGVSDF YKRLIX₂₆KAKT VEGVEALKX₃₉X₄₀ILX₄₃X₄₄LP,

где независимо друг от друга

Х₃ выбран из Е, S, Q и С;

Х₆ выбран из Е, S и С;

Х₇ выбран из А и S;

Х₁₀ выбран из А, S и R;

X₁₄ выбран из А, S, С и K;

Х₂₆ выбран из D и Е;

Х₃₉ выбран из D и Е;

Х₄₀ выбран из А и Е;

Х₄₃ выбран из А и K;

Х₄₄ выбран из А, S и Е;

L в положении 45 присутствует или отсутствует; и

Р в положении 46 присутствует или отсутствует;

и

ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 95 % идентичности с последовательностью, определяемой в i).

Определенный выше класс родственных по последовательностям полипептидов со связывающей аффинностью к альбумину получают из общей исходной полипептидной последовательностью, которая укладывается в домен с пучком из трех альфа-спиралей. Более конкретно, полипептиды, которые описаны выше, получают из построения модели на основе структуры комплекса между сывороточным альбумином и альбумин-связывающим доменом G148-GA3 (Lejon et al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004), а также анализов связывания и структурных свойств ряда мутационных вариантов общей исходной полипептидной последовательности. Определенная выше аминокислотная последовательность i) включает аминокислотные замещения по сравнению с исходной полипептидной последовательностью, которые в результате дают класс полипептидов, которые, как предполагается, укладываются в почти идентичный домен с пучком из трех спиралей. Несмотря на то, что исходная полипептидная последовательность уже включает поверхность связывания для взаимодействия с альбумином, эту поверхность связывания модифицируют посредством некоторых из замещений согласно вышеприведенному определению. Замещения согласно вышеприведенному определению обеспечивают улучшенную альбумин-связывающую способность по сравнению с исходной полипептидной последовательностью.

Альбумин-связывающие полипептиды согласно первому аспекту настоящего раскрытия проявляют ряд характеристик, которые, например, делают их пригодными для применения в качестве партнеров слияния или конъюгации для терапевтических молекул для введения человеку. Альбумин-связывающие полипептиды согласно настоящему раскрытию демонстрируют, например, по сравнению с родственными альбумин-связывающими полипептидами, такими как альбумин-связывающий домен G148-GA3, и альбумин-связывающими полипептидами, раскрытыми в документе WO 09/016043, по меньшей мере пять из следующих шести характеристик:

- полипептиды проявляют другую поверхность в сравнении с; например, G148-GA3 и другие полученные из бактерий альбумин-связывающие домены. Различие может снизить или устранить любой риск в отношении реакций с участием антител у субъекта, такого как человек, которого предварительно подвергали воздействию таких бактериальных белков;

- полипептиды включают меньшее количество потенциальных Т-клеточных эпитопов чем, например, G148-GA3 и другие родственные, но отличные мутационные варианты общей исходной полипептидной последовательности, и, в связи с этим, проявляют низкую иммуногенность при введении субъекту, такому как человек;

- полипептиды проявляют более низкую реактивность с циркулирующими антителами при введении субъекту, такому как человек. Таким образом, путем аминокислотного замещения в поверхности полипептидов, подвергающихся воздействию циркулирующих антител, т.е. в полипептидной поверхности, не вовлеченной в связывающее взаимодействие с альбумином. перекрестная реактивность антител снижена по сравнению с, например, перекрестной реактивностью антител, вызванной G148-GA3, как измерено в ряде тестов человеческих сывороток;

- полипептиды обладают высокой альбумин-связывающей способностью, как исходя из более высокой связывающей аффинности, определяемой К_D-значением, так и исходя из более медленной скорости диссоциации, определяемой k_off-значением, чем, например, известные встречающиеся в природе альбумин-связывающие полипептиды, такие как альбумин-связывающие домены, полученные из бактериальных белков;

- полипептиды включают меньшее количество аминокислотных остатков, которые ассоциированы с проблемами стабильности полипептидов, чем, например, известные встречающиеся в природе альбумин-связывающие полипептиды, такие как альбумин-связывающие домены, полученные из бактериальных белков. Таким образом, полипептиды не включают, например, подверженные окислению метионины или триптофаны, а только один аспарагин;

- полипептиды имеют более высокую структурную стабильность, определяемую по точке плавления свыше 55С, чем предыдущие альбумин-связывающие полипептиды, такие как те, что раскрыты в документе WO 09/016043.

В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту проявляет все шесть из вышеперечисленных характеристик. В другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту проявляет при связывании с альбумином более гидрофильный профиль чем, например, предыдущие альбумин-связывающие полипептиды, такие как те, что раскрыты в WO 09/016043. Поверхность альбумин-связывающего полипептида, которая подвергается воздействию окружающей среды, когда полипептид взаимодействует с альбумином, включает меньшее количество аминокислотных остатков, которые придают поверхности гидрофобность.

Специалист в данной области техники поймет, что функция любого полипептида, такая как альбумин-связывающая способность полипептидов согласно первому аспекту, зависит от третичной структуры полипептида. Однако возможно внести изменения в последовательность аминокислот в α-спиральном полипептиде не воздействуя на его структуру (Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38): 14412-17, 2008). Таким образом, модифицированные варианты i), которые являются таковыми, что полученная результирующая последовательность по меньшей мере на 95% идентична последовательности, принадлежащей классу, определяемому i), также охвачены первым аспектом. Например, возможно, что аминокислотный остаток, принадлежащей определенной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобный, гидрофильный, полярный и т.д.) можно было бы заменить на другой аминокислотный остаток из той же самой функциональной группы.

Выражение "% идентичный" или "% идентичности", применяемое в описании и формуле изобретения, определяют, как указано далее. Запрашиваемую выравнивают последовательность с целевой последовательностью с использованием алгоритма CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Сравнение делают по окну, соответствующему самым коротким из выровненных последовательностей. Самые короткие из выровненных последовательностей могут в некоторых случаях быть целевой последовательностью, такой как альбумин-связывающий полипептид, раскрываемый в настоящем документе. В других случаях запрашиваемая последовательность может составлять самую короткую из выровненных последовательностей. Запрашиваемая последовательность может, например, состоять из по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 30 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, например 45 аминокислотных остатков. Сравнивают аминокислотные остатки в каждом положении, а процент положений в запрашиваемой последовательности, которые имеют идентичные соответствия в целевой последовательности, описывают как % идентичности.

В одном варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту Х₆ представляет собой Е.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₃ представляет собой S.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₃ представляет собой Е.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₇ представляет собой А.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₁₄ представляет собой S.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₁₀ представляет собой С.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₁₀ представляет собой А.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₁₀ представляет собой S.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₂₆ представляет собой D.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₂₆ представляет собой Е.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₃₉ представляет собой D.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₃₉ представляет собой Е.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₄₀ представляет собой А.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₄₃ представляет собой А.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₄₄ представляет собой А.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х₄₄ представляет собой S.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток L в положении 45 присутствует.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток Р в положении 46 присутствует.

В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток Р в положении 46 отсутствует.

В другом варианте осуществления объектом является альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту с оговоркой, что Х7 не является ни L, ни, Е, ни D.

Альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту можно получить для конъюгирования с пригодным партнером для конъюгирования путем замены доступных внешних аминокислотных остатков либо на, например, цистеин, либо на лизин. Эти замены можно ввести в N-концевую спираль, т.е. спираль один, полипептида, которая представляет собой спираль, расположенную дальше всего от сывороточного альбумина, когда альбумин-связывающий полипептид связывается с сывороточным альбумином. Таким образом, остаток лизина в положении X₁₄ определяемой последовательности в i) можно использовать, чтобы сделать возможным сайт-направленное конъюгирование. Это, более того, может быть преимущественным, когда молекулу получают путем химического синтеза пептидов, поскольку можно использовать ортогональную защиту эпсилон-аминогруппы указанного лизина. Более того, остаток цистеина можно вводить в аминокислотную последовательность, чтобы сделать возможным сайт-направленное конъюгирование. Например, остаток цистеина можно вводить в любое из положений Х₃, X₆ и/или X₁₄ в соответствии с вышеприведенным определением.

Связывание партнера для конъюгирования с эпсилон- аминогруппой лизина или тиоловой группой цистеина представляет две разные с химической точки зрения альтернативы для получения сайт-направленного конъюгирования с использованием аминокислотного остатка в пределах аминокислотной последовательности i). Как понятно специалисту в данной области техники, существуют другие химические альтернативы для получения аминокислотной последовательности для конъюгирования, и находятся как таковые также в пределах объема настоящего раскрытия. Одним примером такой химии является клик-химия, которая становится возможной благодаря введению тирозина, как представлено Ban et al (J Am Chem Soc 132:1523-5, 2009).

Выражения "связывание альбумина" и "связывающая аффинность к альбумину", применяемые в этом описании, относятся к свойству полипептида, которое можно протестировать, например, путем применения технологии поверхностного плазменного резонанса, как, например, на приборе Biacore. Например, как описано в примерах ниже, аффинность связывания альбумина можно протестировать в эксперименте, в котором альбумин или его фрагмент иммобилизирован на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий полипептид, который следует протестировать, пропускают через чип. В качестве альтернативы, полипептид, который следует протестировать, иммобилизирован на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий альбумин или его фрагмент, пропускают через чип. Альбумин может в этом отношении быть сывороточным альбумином млекопитающего, как, например, человеческий сывороточный альбумин. Специалист в данной области техники может затем интерпретировать результаты, полученные посредством таких экспериментов, чтобы установить по меньшей мере качественный показатель связывающей аффинности полипептида к альбумину. Если необходим количественный показатель, например, чтобы определить K_D-значение для взаимодействия, можно также применять способы поверхностного плазменного резонанса. Значения для связывания можно, например, определить на приборе Biacore2000 (GE Healthcare). Альбумин иммобилизуют надлежащим образом на сенсорном чипе для измерения, а образцы полипептида, чью аффинность следует определить, получают путем серийного разведения и впрыскивают. Значения K_D можно затем вычислить из результатов с применением, например, модели связывания 1:1 Ленгмюра на программном обеспечении BIAevaluation 4.1, поставляемым изготовителем прибора (GE Healthcare).

В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту связывается с альбумином, так что k_off значение взаимодействия составляет не более 5×10^-5 с^-1, как, например, не более 5×10^-6 с^-1.

Как описано выше, альбумин-связывающие полипептиды, которые определены аминокислотной последовательностью i), получают из общей исходной полипептидной последовательности, которая укладывается в домен с пучком из трех альфа-спиралей. В одном варианте осуществления домен из трех спиралей этой исходной полипептидной последовательности образует часть белка G из штамма G148 Streptococcus, в частности, домен СА3.

В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность альбумин-связывающего полипептида выбрана из любой из SEQ ID NO:1-144 и SEQ ID NO:164-203, как например, выбрана из любой из SEQ ID NO:1-144. Более конкретно, аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 и SEQ ID NO:192-203. Таким образом, аминокислотную последовательность можно выбрать из SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 и SEQ ID NO:49-50.

В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту дополнительно включает один или несколько дополнительных аминокислотных остатков, расположенных на N- и/или С-конце последовательности, определяемой в i). Эти дополнительные аминокислотные остатки могут играть роль в усилении связывания альбумина полипептидом и улучшении конформационной стабильности уложенного альбумин-связывающего домена, но могут с таким же успехом служить для других целей, связанных, например, с одной или несколькими из получения, очистки, стабилизации in vivo или in vitro, присоединения, мечения или детекции полипептида, а также любой их комбинации. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут включать один или несколько из аминокислотного остатка (остатков), присоединенных в целях химического присоединения, например, к хроматографической смоле, чтобы получить аффинную матрицу, или к хелатирующему фрагменту для комплексообразования с радиометаллом.

Аминокислоты непосредственно предшествующие или следующие за альфа-спиралью на N- или С-конце аминокислотной последовательности i) могут, таким образом, в одном варианте осуществления влиять на конформационную стабильность. Одним примером аминокислотного остатка, который может способствовать улучшенной конформационной стабильности, является остаток серина, расположенный на N-конце аминокислотной последовательности i), как определено выше. N-концевой остаток серина может в некоторых случаях образовывать канонический S-X-Х-Е кэппирующий бокс, путем вовлечения образования водородной связи между гамма-кислородом серинсодержащей боковой цепи и NH остатка глутаминовой кислоты полипептидного остова. Это N-концевое кэппирование может способствовать стабилизации первой альфа-спирали домена из трех спиралей, входящего в состав альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту настоящего раскрытия.

Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают по меньшей мере один остаток серина на N-конце полипептида. Аминокислотной последовательности, другими словами, предшествует один остаток или несколько остатков серина. В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида дополнительные аминокислоты включают остаток глицина на N-конце полипептида. Понятно, что аминокислотной последовательности i) может предшествовать один, два, три, четыре или любое подходящее количество аминокислотных остатков. Таким образом, аминокислотной последовательности может предшествовать одиночный остаток серина, одиночный остаток глицина или комбинация из двух, как, например, комбинация глицина-серина (GS) или комбинация глицина-серина-серина (GSS). Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающих дополнительные амино-остатки на N-конце, изложены в SEQ ID NO:145-163, как, например, в SEQ ID NO:145-148 и SEQ ID NO:162-163. Еще в другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки включают глутаминовую кислоту на N-конце полипептида, как определено последовательностью i).

Подобным образом, С-концевое кэппирование можно использовать, чтобы улучшить стабильность третьей альфа-спирали домена из трех спиралей, входящего в состав альбумин-связывающего полипептида. Остаток пролина, если присутствует на С-конце аминокислотной последовательности, определяемой в i), может по меньшей мере частично функционировать в качестве кэппирующего остатка. В этом случае остаток лизина после остатка пролина на С-конце может способствовать дополнительной стабилизации третьей спирали альбумин-связывающего полипептида посредством образования водородной связи между эпсилон-аминогруппой остатка лизина и карбонильными группами аминокислот, локализованных за два и три остатка до лизина в полипептидном остове, например, если присутствуют как L45, так и Р46, карбонильные группы остатков лейцина и аланина аминокислотной последовательности, определяемой в i). Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают остаток лизина на С-конце полипептида.

Как обсуждалось выше, дополнительные аминокислоты могут иметь отношение к получению альбумин-связывающего полипептида. В частности, если альбумин-связывающий полипептид согласно варианту осуществления, в котором Р46 присутствует, получают путем химического синтеза пептидов, то один или несколько факультативных аминокислотных остатков после С-концевого пролина могут обеспечивать преимущества. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут, например, предотвращать образование нежелательных веществ, таких как дикетопиперазин, на стадии дипептидов в ходе синтеза. Одним примером такого аминокислотного остатка является глицин. Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают остаток глицина на С-конце полипептида, непосредственно после остатка пролина или после дополнительного остатка лизина и/или глицина, как рассматривалось выше. В качестве альтернативы, получение полипептидов может извлекать пользу от амидирования С-концевого остатка пролина аминокислотной последовательности i), если присутствует. В данном случае С-концевой пролин включает дополнительную аминогруппу на углероде карбоксильной группы. В одном варианте осуществления полипептидов, описанных в настоящем документе, в особенности тех, которые заканчиваются пролином на их С-конце или другой аминокислотой, которая, как известно, рацемизируется на протяжении синтеза пептидов, вышеупомянутое присоединение глицина к С-концу или амидирование пролина, если присутствует, может также противодействовать потенциальным проблемам с рацемизацией С-концевого аминокислотного остатка. Если полипептид, амидированный таким способом, предназначен для получения посредством рекомбинантных способов, а не посредством химического синтеза, амидирование С-концевой аминокислоты можно осуществить посредством нескольких способов, известных в настоящем уровне техники, например, через применение амидирующего РАМ-фермента.

Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающие дополнительные аминокислотные остатки на С-конце, изложены в SEQ ID NO:145-152, как, например, в SEQ ID NO:148-150. Специалист в данной области техники осведомлен о способах выполнения С-концевой модификации, как, например, посредством разных типов предварительно изготовленных матриц для синтеза пептидов.

В другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки включают остаток цистеина на N- и/или С-конце полипептида. Такой остаток цистеина может непосредственно предшествовать и/или следовать за аминокислотной последовательностью, как определено в i) или может предшествовать и/или следовать за любыми другими дополнительными аминокислотными остатками, как описано выше. Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающих остаток цистеина на N- и/или С-конце полипептидной цепи, изложены в SEQ ID NO:149-150 (С-конец) и SEQ ID NO:151-152 (N-конец). Путем присоединения остатка цистеина к полипептидной цепи можно получить тиоловую группу для сайт-направленного конъюгирования альбумин-связывающего полипептида. В качестве альтернативы можно вводить остаток селеноцистеина на С-конце полипептидной цепи похожим образом, как для введения остатка цистеина, чтобы облегчить сайт-специфичное конъюгирование (Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006).

В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид включает не более двух остатков цистеина. В другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид включает не более одного остатка цистеина.

В другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки альбумин-связывающего полипептида включают "метку" для очистки или детекции полипептида, такую как гексагистидиловую (Hise) метку, или "myc" ("с-Мус") метку, или "FLAG" метку для взаимодействия с антителами, специфичными к метке и/или, чтобы применять ее в очистке. Специалист в данной области техники осведомлен о других альтернативах.

Еще в другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту связывается с человеческим сывороточным альбумином. В других вариантах осуществления альбумин-связывающий полипептид связывается с альбумином других видов, отличных от человеческого вида, как, например, альбумином мыши, крысы, собаки и яванских макак.

"Дополнительные аминокислотные остатки", обсуждаемые выше, могут также составлять один полипептидный домен или несколько полипептидных доменов с любой необходимой функцией, как например, с такой же функцией связывания, как у первого альбумин-связывающего домена, или другой функцией связывания, или терапевтической функцией, или ферментативной функцией, или флюресцентной функцией и их комбинациями.

Следовательно, в другом, родственном аспекте приведен гибридный белок или конъюгат, включающий

i) Первый фрагмент, состоящий из альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту, который описан в настоящем документе; и

ii) Второй фрагмент, состоящий из полипептида с требуемой биологической активностью.

Гибридный белок или конъюгат, включающий альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту раскрытия и второй фрагмент, может увеличить in vitro и/или in vivo время полужизни второго фрагмента по сравнению с in vivo временем полужизни второго фрагмента per se. В результате этого, если гибридный белок или конъюгат согласно этому аспекту вводят субъекту, такому как человеческий субъект, in vivo воздействие второго фрагмента может усилиться, что может привести к улучшенной эффективности биологической активности второго фрагмента по сравнению с эффективностью in vivo воздействия второго фрагмента при введении самого по себе.

Необходимой биологической активностью может, например, быть терапевтическая активность, активность связывания или ферментативная активность. Если необходимая биологическая активностью представляет собой терапевтическую активность, второй фрагмент, проявляющий эту активность, может быть терапевтически активным полипептидом. Неограничивающими примерами терапевтически активных полипептидов являются биомолекулы, такие как молекулы, выбранные из группы, состоящей из человеческих эндогенных ферментов, гормонов, факторов роста, хемокинов, цитокинов и лимфокинов, и не относящихся к человеку биологически активных белков, таких как белки, выбранные из группы, состоящей из бактериальных токсинов (например, экзотоксин синегнойной палочки и стафилококковые или стрептококковые суперантигены), ферментов (например, РНКаза и бета-лактамаза) и активирующих белков (например, стрептокиназа). Неограничивающие примеры терапевтически активных биомолекул, которые могут оказаться полезными при слиянии или конъюгировании с альбумин-связывающм полипептидом, выбраны из группы, состоящей из IL-2, GLP-1, BNP (Alb-бета-натрийуретического пептида), IL-1-RA (антагониста рецептора интерлейкина-1), KGF (фактора роста кератиноцитов), Stemgen®, гормона роста (GH), G-CSF, CTLA-4; миостатина, фактора VII, фактора VIII и фактора IX.

Неплотно соединенные дефективные кровеносные сосуды опухолевой ткани делают ее сосудистую сеть (эндотелиальный барьер) проницаемой для макромолекул, тогда как в кровеносных сосудах здоровой ткани только небольшие молекулы могут проходить через эндотелиальный барьер. Подобным образом, проницаемость гематоартикулярного барьера для альбумина в воспаленных суставах пациентов с ревматоидным артритом заметно увеличена. Таким образом, гибридные белки или конъюгаты согласно этому аспекту, по-видимому, проникают через кровеносный сосуд в опухолевой ткани и гематоартикулярный барьер в воспаленных суставах.

Если указанная необходимая биологическая активность второго фрагмента представляет собой активность связывания, то указанным вторым фрагментом может быть связывающий полипептид, способный к избирательному взаимодействию с целевой молекулой. Такой связывающий полипептид можно, например, выбрать из группы, состоящей из антител, и фрагментов, и их доменов, в значительной степени сохраняющих связывающую активность антител; микротелец, макротелец, авимеров и других малых связанных дисульфидной связью белков; и связывающих белков, полученных из скаффолда, выбранных из группы, состоящей из белка А стафилококка и его доменов, других трехспиральных доменов, липокалинов, доменов с анкириновым повтором, доменов, связывающих целлюлозу, γ-кристаллинов, зеленого флуоресцентного белка, антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, ингибиторов протеаз, таких как домены Kunitz, PDZ доменов, SH3 доменов, пептидных аптамеров, нуклеазы стафилококка, тендамистатов, домена фибронектина типа III, трансферрина, доменов "цинковых пальцев" и конотоксинов.

В некоторых вариантах осуществления целевую молекулу для связывания указанного целевого связывающего полипептида можно выбрать из группы, состоящей из амилоидного В (АВ) пептида болезни Альцгеймера; других ассоциированных с заболеваниями амилоидных пептидов; токсинов, таких как бактериальные токсины и змеиные яды; факторов свертывания крови, таких как фактор фон Виллебранда; интерлейкинов, таких как IL-13; миостатина; провоспалительных факторов, таких как TNF-α, рецептор TNF-α, IL-1, IL-8 и IL-23; факторов комплемента, таких как С3 и С5; медиаторов гиперчувствительности, таких как гистамин и IgE; опухолевых специфических антигенов, таких как CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX (карбонангидраза IX), СЕА, рецептор IL-2, MUC1, PSMA, TAG-72; и других биологических молекул, таких как G-CSF, GM-CSF, гормон роста (GH), инсулин и соматостатин.

Как понятно специалисту в данной области техники, альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту может быть полезным в гибридном белке или в качестве партнера для конъюгирования с любым другим фрагментом. Таким образом, вышеприведенные перечни терапевтически активных полипептидов, связывающих полипептидов и целевых молекул не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом.

В одном варианте осуществления гибридного белка или конъюгата согласно настоящему раскрытию второй фрагмент конъюгирован с альбумин-связывающи