Способ идентификации иммунных связывающих веществ поверхностных антигенов клетки

Способ идентификации иммунных связывающих веществ поверхностных антигенов клетки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Иммунные связующие вещества, в том числе антитела, их конъюгаты и производные, чрезвычайно важны с коммерческой точки зрения в качестве терапевтических и диагностических средств. В общепринятых способах получения или скрининга антител обычно используют растворимые антигены. Однако у определенных мембраносвязанных белковых антигенов конформационные антигенные эпитопы изменяются, в том числе, если антигены солюбилизированы из мембраны, что препятствует получению и скринингу антител. Кроме того, одной из основных проблем способов иммуноблоттинга и аффинной хроматографии является отбор антител со средним уровнем аффинности к антигену. Это подразумевает включение большого числа перекрестнореагирующих или липких антител, которые осложняют методику последовательного скрининга. Несмотря на то, что клетки, экспрессирующие мембраносвязанные антигены, уже были использованы непосредственно для получения антител, эффективный способ скрининга, способный выявлять и увеличивать количество антител с высокой степенью аффинности к поверхностным антигенам клетки, до сих пор отсутствует.

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к способам идентификации иммунных связующих веществ, таких как антитела scFv, способных специфически связываться с поверхностными антигенами клетки. Способы по изобретению в основном включают взаимодействие меченых клеток, экспрессирующих антиген, с мечеными клетками, экспрессирующими иммунное связующее вещество, и выделение клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество, которые связываются с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер. Эти способы особенно подходят для быстрой и эффективной идентификации иммунных связующих веществ против конформационных эпитопов, присутствующих в интегральных мембранных белках, таких как GPCR. Изобретение также относится к выделенным иммунным связующим веществам и нуклеиновым кислотам, кодирующим иммунные связующие вещества, идентифицированные с использованием способов по изобретению.

В одном из аспектов изобретение относится к способу идентификации иммунного связующего вещества, которое специфически связывается с мишеневым поверхностным антигеном клетки. Способ предусматривает наличие множества клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, функционально связанных с первой сортируемой меткой; наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген презентирован на поверхности экспрессирующей антиген клетки; взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с клетками, экспрессирующими иммунные связующие вещества; отделение от множества клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, одной или нескольких клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер (например, клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе (например, комплексе, образованном между антигеном и рецептором В-клетки) является индикатором связывания клетки, экспрессирующей иммунное связующее вещество, с антиген-экспрессирующией клеткой, тем самым идентифицируя иммунное связующее вещество, которое связывается с мишеневым антигеном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения отобранные клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, клонально выделяют. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, подвергают клональной экспансии. В других вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, выделяют из клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество. Подходящие способы выделения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, включают ПЦР, например, ПЦР одной клетки. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммунное связующее вещество, может быть выделена после клонального выделения клеток и/или после клональной экспансии.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, выделенные с использованием способов по изобретению, подвергают клеточному анализу для функциональной характеристики иммунного связующего вещества. Подходящий клеточный анализ включает CELISA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунным связующим веществом является антитело. Такие антитела включают мышиные, кроличьи, окрольчаченные, куриные, верблюжьи, оверблюженные, человеческие, гуманизированные и химерные антитела. Подходящие структуры антитела включают, помимо прочего, Fab, Dab, нанотело и scFv.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген экспрессируется с экзогенного гена. В других вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген является созданным способами генной инженерии антигеном. В других вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген является интегральным мембранным белком. Подходящие интегральные мембранные белки включают, помимо прочего, GPCR (например, CXCR2) или ионные каналы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая и вторая сортируемая метка является флуоресцентной меткой. Подходящие флуоресцентные метки включают, помимо прочего, флуоресцентные белки, конъюгаты антитело/фтор и флуоресцентные клеточные метки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки представляют собой дрожжевые клетки или клетки млекопитающих (например, клетки человека). В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки экспрессируют экзогенный антиген. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки трансфицируют экспрессионным вектором.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, представляют собой дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. Подходящие клетки млекопитающих включают, помимо прочего, В-клетки, например, кроличьи В-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клетки выделяют из иммунизированного животного, например, животного, иммунизированного вакцинацией ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунные связующие вещества, содержат иммунное связующее вещество, экспрессирующееся с экспрессионного вектора.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, идентифицированное способами по изобретения.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения иммунного связующего вещества, способного связывать мишеневый антиген, включающий введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, идентифицированное способами по изобретению, в экспрессионную среду так, чтобы происходил синтез кодируемого иммунного связующего вещества.

В другом аспекте изобретение представляет иммунное связующее вещество, получаемое способами по изобретению.

В другом аспекте изобретение также относится к способу идентификации В-клеточного клона, который специфически связывается с поверхностным мишеневым антигеном клетки, предусматривающий: иммунизирование животного ДНК, кодирующей поверхностный антиген клетки; выделение В-клеток из иммунизированного животного; мечение В-клеток первой сортируемой меткой; наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген презентирован на поверхности экспрессирующей антиген клетки; взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с В-клетками; и отделение от множества В-клеток одной или нескольких В-клеток, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер, где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе является индикатором связывания В-клетки с антиген-экспрессирующей клеткой, тем самым идентифицируя клон В-клетки, который связывается с мишеневым антигеном.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 схематически демонстрирует В-клетку 1, меченную флуоресцентным антителом 2, взаимодействующую с мишень-экспрессирующей клеткой, окрашенной внутриклеточным красителем 3. (4: мишень отбора/антиген; 5: В-клеточный рецептор (BCR)).

Фиг.2: процесс отбора способом FACS кроличьих В-клеток, связывающихся с растворимой мишенью ESBA903. Фиг.2А: Лимфоциты были отобраны в соответствии с прямым и боковым светорассеянием. Фиг.2В: Среди них IgG+ IgM- клетки (вероятно, В-клетки памяти) были выделены (отмечены кругом). Фиг.2С: Ожидалось, что клетки, дважды окрашенные ESBA903-PE и ESBA903-PerCP (отмечены кругом), кодируют высоко аффинные IgG к ESBA903. Клетки, демонстрирующие самую яркую флуоресценцию (не отмечены кругом), были отсортированы в 96-луночных плашках.

Фиг.3: Бусы, покрытые антителами анти-TNFальфа (меченые РЕ), связываются с TNFальфа-трансфицированными клетками СНО (верхняя панель). Контрольные бусы, покрытые антителами анти-CD19 (меченые АРС), не связывали TNFальфа-трансфицированные клетки СНО (средняя панель). Бусы, покрытые антителами анти-TNFальфа (меченые РЕ), не связывали клетки СНО дикого типа (wt) (нижняя панель). Точечные диаграммы слева демонстрируют прямое и боковое светорассеяние, что указывает, соответственно, на размер и зернистость объектов. Популяция обособленных бус (~3 мкм) была отобрана в Р2. Клетки СНО, в конечном итоге связавшиеся с бусами (~30 мкм), были отобраны в Р1. Точечные диаграммы посередине демонстрируют объекты Р1 (клетки СНО) применительно к их окрашиванию РЕ или АРС. Таким образом, клетки, взаимодействующие с анти-TNFальфа-бусами, окажутся в Р3, и клетки, взаимодействующие с анти-CD19-бусами, окажутся в Р4. Справа, статистические данные для каждого образца детализированы.

Фиг.4: Бусы, покрытые анти-TNFальфа-РЕ, и бусы, покрытые анти-CD19-АРС, были смешаны вместе с TNFальфа-трансфицированными клетками СНО. Клетки СНО были отобраны (Р1), и среди них клетки, связывающиеся либо с бусами, покрытыми анти-TNFальфаРЕ, либо с бусами, покрытыми анти-CD19-АРС, показаны в группах Р3 и Р4, соответственно. Несвязанные бусы видны в группе Р2.

Фиг.5а: FACS-анализ 3 различных суспензий СНО-TNFα - В-клеток памяти. В верхнем левом углу: точечная диаграмма, демонстрирующая прямое и боковое светорассеяние клеточной суспензии. Жизнеспособные клетки, включающие большую популяцию трансгенных клеток СНО и небольшую популяцию В-клеток памяти, были отобраны. В нижнем левом углу: точечная диаграмма, демонстрирующая флуоресценцию АРС и FITC. В данном случае, В-клетки памяти (IgG+/IgM-) были отобраны. Эти две точечные диаграммы были идентичными для всех трех образцов; ввиду этого они представлены только единожды.

Фиг.5b: гистограммы и иерархия популяций 3 образцов: сверху: CHO-TNFα клетки + ESBA105 + В-клетки памяти кролика, иммунизированного ESBA105; посередине: CHO-TNFα клетки + ESBA105 + В-клетки памяти неиммунизированного кролика; внизу: CHO-TNFα клетки + В-клетки памяти кролика, иммунизированного ESBA105. На гистограммах В-клетки памяти, связавшиеся с клетками СНО, были отобраны.

Фиг.6: FACS-анализ суспензии, состоящей из иммунизированных лимфоцитов, смешанных с трансгенными по TNFα клетками СНО, «покрытых» ESBA105. Фиг.6а: точечная диаграмма, демонстрирующая прямое и боковое светорассеяние клеточной суспензии. Жизнеспособные клетки, включающие большую популяцию трансгенных клеток СНО и небольшую популяцию лимфоцитов, были отобраны. Фиг.6b: точечная диаграмма, демонстрирующая флуоресценцию APC и FITC. В данном случае, В-клетки памяти (IgG+/IgM-) были отобраны. Фиг.6с: гистограмма, демонстрирующая флуоресценцию кальцеина отсортированных В-клеток памяти. Отобранная популяция была отсортирована (В-клетки памяти, связывающиеся с комплексом СНО-TNFα-ESBA105).

Фиг.7: Изображения светлопольной микроскопии бус, покрытых IgG анти-TNFальфа, которые взаимодействуют с трансгенными клетками СНО-TNFальфа (B220).

Фиг.8: Изображения светлопольной микроскопии (левая колонка) и изображения флуоресцентной микроскопии (правая колонка) клеток СНО-TNFальфа/ESBA105 (большие клетки), связанных с В-клетками, которые имеют антитела анти-ESBA105 на поверхности (клетки меньшего размера).

Подробное описание изобретения

Изобретение относится к способам идентификации иммунных связующих веществ, таких как антитела scFv, способных специфически связываться с поверхностными антигенами клетки. Способы по изобретению в основном включают взаимодействие меченых антиген-экспрессирующих клеток с мечеными клетками, экспрессирующими иммунное связующее вещество, и выделение клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество, которые связываются с экспрессирующими антиген клетками, используя клеточный сортер. Эти способы, в частности, подходят для быстрой и эффективной идентификации иммунных связующих веществ против конформационных эпитопов, представленных в интегральных белках мембраны, таких как GPCR. Изобретение также относится к выделенным иммунным связующим веществам и нуклеиновым кислотам, кодирующим иммунные связующие вещества, идентифицированные с использованием способов по изобретению.

В одном из аспектов изобретение относится к способу идентификации иммунного связующего вещества, которое специфически связывается с мишеневым поверхностным антигеном клетки. Способ предусматривает: наличие множества клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, функционально связанных с первой сортируемой меткой; наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген презентирован на поверхности экспрессирующей антиген клетки; взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с клетками, экспрессирующими иммунные связующие вещества; отделение от множества клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, одной или нескольких клеток, экспрессирующих иммунные связующие вещества, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер (например, клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе (например, комплексе, образованном между антигеном и рецептором В-клетки) является индикатором связывания клетки, экспрессирующей иммунное связующее вещество, с антиген-экспрессирующей клеткой, тем самым идентифицируя иммунное связующее вещество, которое связывается с мишеневым антигеном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения отобранные клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, клонально выделяют.

В определенных вариантах осуществления изобретения клонально выделенные клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, подвергаются клональной экспансии, используя способы, хорошо известные специалистам в данной области техники.

В других вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, выделяют из клеток, экспрессирующих иммунное связующее вещество. Выделение последовательности нуклеиновой кислоты можно проводить после клонального выделения или после клональной экспансии. Подходящие способы выделения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, включают ПЦР, например, ПЦР одной клетки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, выделенные с использованием способов по изобретению, подвергают клеточному анализу для функциональной характеристики иммунного связующего вещества. Подходящий клеточный анализ включает CELISA.

В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунным связующим веществом является антитело. Такие антитела включают мышиные, кроличьи, окрольчаченные, куриные, верблюжьи, оверблюженные, человеческие, гуманизированные и химерные антитела. Подходящие структуры антитела включают, помимо прочего, Fab, Dab, нанотело и scFv.

В некоторых вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген экспрессируется с экзогенного гена. В других вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген является созданным способами генной инженерии антигеном. В других вариантах осуществления изобретения мишеневый антиген является интегральным мембранным белком. Подходящие интегральные мембранные белки включают, помимо прочего, рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR, такие как CXCR2), или ионные каналы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первая и вторая сортируемая метка является флуоресцентной меткой. Подходящие флуоресцентные метки включают, помимо прочего, флуоресцентные белки, конъюгаты антитело/фтор и флуоресцентные клеточные метки.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки представляют собой дрожжевые клетки или клетки млекопитающих (например, клетки человека). В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки экспрессируют экзогенный антиген. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-экспрессирующие клетки трансфицируют экспрессионным вектором.

В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунное связующее вещество, представляют собой дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. Подходящие клетки млекопитающих включают, помимо прочего, В-клетки, например, кроличьи В-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения В-клетки выделяют из иммунизированного животного, например, животного, иммунизированного вакцинацией ДНК. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, экспрессирующие иммунные связующие вещества, содержат иммунное связующее вещество, экспрессирующееся с экспрессионного вектора.

В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, идентифицированное способами по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения иммунного связующего вещества, способного связывать мишеневый антиген, включающий введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей иммунное связующее вещество, идентифицированное способами по изобретению, в экспрессионную среду так, чтобы происходил синтез кодируемого иммунного связующего вещества.

В другом аспекте изобретение относится к иммунному связующему веществу, получаемому способами по изобретению.

В другом аспекте изобретение также относится к способу идентификации В-клеточного клона, который специфически связывается с поверхностным мишеневым антигеном клетки, предусматриывающий: иммунизирование животного ДНК, кодирующей поверхностный антиген клетки; выделение В-клеток из иммунизированного животного; мечение В-клеток первой сортируемой меткой; наличие множества антиген-экспрессирующих клеток, функционально связанных со второй сортируемой меткой, где мишеневый антиген представлен на поверхности экспрессирующей антиген клетки; взаимодействие антиген-экспрессирующих клеток с В-клетками; и отделение от множества В-клеток одной или нескольких В-клеток, которые могут специфически связываться с антиген-экспрессирующими клетками, используя клеточный сортер, где присутствие первой и второй сортируемой метки в одном клеточном комплексе является индикатором связывания В-клетки с антиген-экспрессирующей клеткой, тем самым идентифицируя В-клеточный клон, который связывается с мишеневым антигеном.

Определения

Для большей ясности настоящего изобретения, отдельные термины определены, как указано ниже. Дополнительные определения изложены на всем протяжении подробного описания.

Термин «антитело» относится к целым антителам или любому антиген-связывающему фрагменту (т.е. «антиген-связывающая часть», «антиген-связывающий полипептид» или «иммунное связующее вещество») или одиночная цепь вышеперечисленного. «Антитело» относится к гликопротеину, включающему, по меньшей мере, две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, сцепленные друг с другом дисульфидными мостиками, или его антиген-связывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно в настоящем документе как VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно в настоящем документе как VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные области, названные определяющими комплементарность областями (CDR), вперемежку с областями, являющимися более консервативными, названными каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.

Термин «химерное антитело» относится к молекуле антитела, в которой (а) константная область или ее часть изменена, замещена или заменена таким образом, что сайт связывания антигена (вариабельная область) соединен с константной областью другого или видоизмененного класса, эффекторной функции и/или вида, или совершенно другой молекулой, которая придает новые свойства химерному антителу, например, ферментом, токсином, гормоном, ростовым фактором, лекарственным средством, и т.д.; или (b) вариабельная область или ее часть изменена, замещена или заменена вариабельной областью, имеющей другую или измененную антигенную специфичность.

Термин «антиген-связывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, TNF). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры фрагментов связывания, подразумеваемые под термином «антиген-связывающая часть» антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (v) одиночный домен, такой как фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR) или (vii) комбинацию двух или более выделенных CDR, которые могут дополнительно быть объединены синтетическим линкером. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены, используя способы рекомбинации, синтетическим линкером, который дает им возможность быть синтезированными в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH составляют пару с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подразумевают под термином «антиген-связывающая часть» антитела. Эти фрагменты антитела получают, используя общепринятые способы, известные специалистам в данной области техники, и фрагменты отбирают на пригодность таким же образом, как интактные антитела. Антиген-связывающие части могут быть получены способами рекомбинантных ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть разных изотипов, например, антитело IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Термин «иммунное связующее вещество» относится к молекуле, которая содержит весь антиген-связывающий участок антитела или его часть, например, весь вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи или его часть таким образом, что иммунное связующее вещество специфически узнает мишеневый антиген. Неограниченные примеры иммунных связывающих веществ включают полноразмерные иммуноглобулиновые молекулы и scFv, а также фрагменты антитела, включая, помимо прочего, (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fab', который по сути является Fab с частью шарнирной области (см., FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (v) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела, (vi) однодоменное антитело, такое как фрагмент Dab (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH или VL, антитело Camelid (см. Hamers-Casterman, et al., Nature 363:446-448 (1993) и Dumoulin, et al., Protein Science 11:500-515 (2002)) или Shark (например, акульи Ig-NAR Nanobodies®); и (vii) нанотело, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую один вариабельный домен и два константных домена.

Термин «функциональная характеристика» в том смысле, в котором он используется в настоящем описании, означает характеристику полипептида (например, иммунного связующего вещества), для которого усовершенствования (например, относительно обычного полипептида) желательны и/или предпочтительны одному из специалистов в данной области техники, например, для улучшения производственных характеристик или терапевтической эффективности полипептида. В одном из вариантов осуществления функциональной характеристикой является улучшенная стабильность (например, улучшенная термостабильность). В еще одном варианте осуществления изобретения функциональной характеристикой является улучшенная растворимость (например, в клеточных условиях). В еще одном варианте осуществления изобретения функциональной характеристикой является отсутствие агрегации. В еще одном варианте осуществления изобретения функциональной характеристикой является усовершенствование в экспрессии (например, в прокариотической клетке). В еще одном варианте осуществления изобретения функциональной характеристикой является усовершенствование в выраженности рефолдинга вслед за процессом очистки телец включения. В определенных вариантах осуществления изобретения функциональной характеристикой не является улучшение аффинности связывания антигена.

Термин «каркасные участки» относится к хорошо известным в области техники частям вариабельной области антитела, которые находятся между более отличающимися областями CDR. Такие каркасные области обычно называются каркасными областями с 1 по 4 (FR1, FR2, FR3 и FR4) и обеспечивают область фиксации, в трехмерном пространстве, трех CDR, обнаруженных в вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, таким образом, что CDR могут образовывать антигенсвязывающую поверхность. Такие каркасные области также могут называться подложками, так как они обеспечивают представление более отличающихся CDR. Другие CDR и каркасные области суперсемейства иммуноглобулинов, такие как анкириновые повторы и фибронектин, могут быть использованы в качестве антигенсвязывающих молекул (см. также, например, патенты США №№ 6300064, 6815540 и публикации США № 20040132028).

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на антигене, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитоп, как правило, включает, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфическое связывание», «селективное связывание», «селективно связывается» и «специфически связывается» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD), приблизительно, менее чем 10^-7 М, как, например, приблизительно, менее чем 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже.

Термин «K_D» относится к равновесной константе диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитела по изобретению связываются с антигеном с равновесной константой диссоциации (K_D), равной менее чем приблизительно 10^-7 М, как, например, приблизительно менее чем 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М или даже ниже, например, как определяется с использованием поверхностной плазмонной резонансной (SPR) технологии в аппарате BIACORE.

Термин «идентичность» в том смысле, в котором он используется в настоящем описании, относится к совпадению последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Если в двух сравниваемых последовательностях в определенном положении расположены одинаковые основания или аминокислотные мономерные субъединицы (например, если в каждой из двух молекул ДНК в определенной положении расположен аденин или в каждом из двух полипептидов в определенной положении расположен лизин), тогда соответствующие молекулы идентичны в данном положении. «Процент идентичности» между двумя последовательностями является функцией числа положений совпадения, принадлежащих двум последовательностям, деленного на число сравниваемых положений, × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают, тогда две последовательности имеют 60% идентичность. В качестве примера, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT имеют 50% идентичность (3 из всех 6 положений совпадают). Как правило, сравнительный анализ проводят, если выравнивают две последовательности для достижения максимальной идентичности. Такое выравнивание может быть обеспечено, используя, например, способ Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, удобно реализуемый с помощью компьютерных программ, таких как программа Align (DNAstar, Inc.). Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может также быть определен, используя алгоритм E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), используя таблицу веса остатков PAM120, штраф за длину бреши размером 12 и штраф за брешь размером 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен, используя алгоритм Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в программном обеспечении GCG (имеется в наличии на www.gcg.com), используя либо матрицу Blossum 62, либо матрицу PAM250, и вес бреши размером 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины размером 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

«Сходные» последовательности - это последовательности, которые при выравнивании, имеют идентичные и сходные аминокислотные остатки, где сходные остатки являются консервативными заменами соответствующих аминокислотных остатков в выравниваемой эталонной последовательности. В связи с этим «консервативная замена» остатка в эталонной последовательности является заменой остатком, который физически или функционально сходен с соответствующим эталонным остатком, например, который имеет сходный размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи или тому подобное. Таким образом, «последовательность, модифицированная консервативной заменой» - это последовательность, которая отличается от эталонной последовательности или последовательности дикого типа в том, что присутствует одна или несколько консервативных замен. «Процент сходства» двух последовательностей является функцией числа положений, которые содержат совпадающие остатки или консервативные замены, принадлежащие двум последовательностям, деленного на число сравниваемых положений, × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают и 2 из 10 положений содержат консервативные замены, тогда две последовательности имеют 80% положительное сходство.

Термин «модификации консервативной последовательности» в том смысле, в котором он используется в настоящем описании, предназначен для обозначения аминокислотных модификаций, которые не оказывают негативного влияния или не изменяют характеристик связывания антитела, содержащего аминокислотную последовательность. Такие модификации консервативной последовательности включают нуклеотидные и аминокислотные замены, присоединения и делеции. Например, модификации могут быть введены стандартными методиками, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают таковые, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, теоретически найденный несущественный аминокислотный остаток может быть заменен другим аминокислотным остатком из того же самого семейства боковых цепей. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не нарушают связывание антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997)).

Термин «аминокислотная консенсусная последовательность» в том смысле, в котором он используется в настоящем описании, относится к аминокислотной последовательности, которая может быть получена, используя матрицу, по меньшей мере, двух и предпочтительно большего количества выравниваемых аминокислотных последовательностей, и допуская бреши при выравнивании таким образом, что оказывается возможным определить наиболее часто встречаемый аминокислотный остаток в каждом положении. Консенсусная последовательность - это та последовательность, которая включает аминокислоты, которые наиболее часто представлены в каждом положении. В том случае, если две или более аминокислоты равнозначно представлены в одном положении, консенсусная последовательность включает обе или все эти аминокислоты.

Аминокислотная последовательность белка может быть проанализирована на различных уровнях. Например, консервативность или вариабельность может быть обнаружена на уровне одного остатка, уровне множественных остатков, множественных остатков с брешами, и т.д. Остатки могут демонстрировать консервативность идентичного остатка или могут быть консервативными на уровне класса. Примеры классов аминокислот включают полярные, но незаряженные группы R (серин, треонин, аспарагин и глутамин); положительно заряженные группы R (лизин, аргинин и гистидин); отрицательно заряженные группы R (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота); гидрофобные группы R (аланин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин и тирозин); и особые аминокислоты (цистеин, глицин и пролин). Другие классы известны специалистам в данной области техники и могут быть определены, используя структурный анализ или другие данные для оценки взаимозаменяемости. В этом смысле взаимозаменяемая аминокислота может относиться к любой аминокислоте, которая может быть заменена и сохранять функциональную консервативность в данном положении.

Общепризнанно, однако, что аминокислоты одного и того же класса могут изменяться по степени их биофизических свойств. Например, общ