Получение 1,4 диаминобутана

Получение 1,4 диаминобутана

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения 1,4-диаминобутана (DAB, ДАБ), включающему в себя по меньшей мере одну биокаталитическую стадию.

Соединение ДАБ является важным сырьем для получения некоторых важных технических пластмасс: полиамида-4,6 либо в форме гомополимера или сополимера, например, содержащего приблизительно 5 масс.% мономера полиамида-6 (капролактама). Гомополимер, полиамид-4,6 (найлон-4,6), описан еще в 1938 (US-A-2,130,948, Carothers). Он является продуктом поликонденсации мономеров ДАБ и адипиновой кислоты. В настоящее время главным образом продукты на основе полиамида-4,6 производит и продает фирма DSM в Нидерландах под торговой маркой STANYL®.

Для синтеза ДАБ известен ряд химических способов. Такие химические способы страдают от такого недостатка, как то, что исходные материалы получают из источников, которые считают невозобновляемыми. Таким образом существует реальная необходимость в предоставлении новых и осуществимых способов синтеза ДАБ, основанных на использовании возобновляемых углеродных источников и использующих биохимические способы (также называемых "биотрансформацией").

Способ получения ДАБ, включающий в себя по меньшей мере одну ферментативную стадию, описан в РСТ заявках, опубликованных как в WO 2006/005603 и в WO 2006/00504. Оба документа описывают ферментативное получение ДАБ в микроорганизме, имеющем повышенный уровень орнитиндекарбоксилазной активности.

Настоящий способ относится к альтернативному способу получения ДАБ. Способ согласно настоящему изобретению включает в себя по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, которая содержит биокаталитическое получение по меньшей мере одного N-защищенного предшественника ДАБ и последующее in vitro превращение N-защищенного предшественника в ДАБ.

Было показано, что выделение ДАБ после биокаталитического получения сопровождается значительными трудностями. В WO 2007/079944 описано выделение органического амина, например, ДАБ. В конкретном варианте осуществления, описанного в нем, концентрируют бесклеточную питательную среду, содержащую сульфатную или фосфатную соль амина (поэтому, например, DAB-дисульфат) и добавляют основание, например, аммиак. В зависимости от условий образуется двухслойная система. Из слоя, содержащего преимущественно органические соединения, может быть выделен нужный амин.

Подробное описание изобретения

Согласно одному из вариантов осуществления способ получения ДАБ включает в себя по меньшей мере одну биокаталитическую стадию и содержит стадии (а) биокаталитического получения N-защищенного предшественника ДАБ, приводящего к получению биокаталитической реакционной смеси, содержащей N-защищенный предшественник ДАБ, (b) выделения N-защищенного предшественника из биокаталитической реакционной смеси, (с) превращения N-защищенного предшественника в ДАБ.

Согласно конкретному варианту осуществления настоящее изобретение, относящееся к получению ДАБ включает в себя по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, которая содержит биокаталитическое получение по меньшей мере одного N-защищенного предшественника ДАБ, выбранного из группы, состоящей из ^-защищенного орнитина, N-защищенного ДАБ и N-защищенного 4-аминобутиральдегида и последующей конверсии in vitro N-защищенного предшественника в ДАБ.

Что касается "превращения in vitro", то здесь это означает превращение N-защищенного предшественника ДАБ в ДАБ в среде, находящейся вне клетки. Превращение in vitro может быть превращением по меньшей мере под действием одного биокатализатора или может быть химическим превращением, включающим в себя по меньшей мере одну химическую стадию или могут комбинацией по меньшей мере одной биокаталитической и одной химической стадии.

Что касается "N-защищенного предшественника ДАБ", то здесь это обозначает соединение, содержащее защищенную аминогруппу и которое может быть превращено в ДАБ посредством по меньшей мере одной химической или биокаталитической реакции или комбинации биокаталитической и химической реакций.

Что касается "N⁵-защищенного орнитина", то здесь это обозначает молекулу орнитина, которая содержит защитную группу у его N⁵ атома; что касается "N-защищенного ДАБ", то здесь это обозначает молекулу ДАБ, которая содержит защитную группу у одной из ее аминогрупп; и что касается "N-защищенного 4-аминобутиральдегида", то здесь это обозначает молекулу 4-аминобутиральдегида, которая содержит защитную группу у аминогруппы.

Защитные группы, о которых выше шла речь, могут быть выбраны из группы, состоящей из ацильных групп, содержащих 1-6 атомов углерода или могут быть гуанидильной группой. Такую защитную группу следует выбирать так, чтобы была возможность осуществить по меньшей мере одно биокаталитическое превращение, легко выделить N-защищенный предшественник из биокаталитической реакционной смеси (например, из ферментационной питательной среды) и последующие биокаталитические и/или химические реакции, что в конечном итоге приводит к получению ДАБ.

N-защищенные предшественники ДАБ могут быть получены ацилированием, например, 4-аминобутиральдегида или орнитина. Например, ацилированием ангидридом уксусной кислоты в муравьиной кислоте для введения формильной защитной группы или реакцией ангидридов С₂-С₆карбоновых кислот или хлорангидридов для введения N-ацетильной, N-пропионильной, N-бутирильной, N-валерильной или N-капроильной защитной группы, соответственно.

Предшественниками, защищенными N-гуанидильной группой, являются, например, протеиногенный аргинин или N-гуанидиламинобутиральдегид или N-гуанидил-ДАБ. Описан ферментативный путь, например, в ЕР 1260588, который описывает биохимическое получение агматина из аргинина под действием аргининдекарбоксилазы. Агматин представляет собой N-гуанидил-защищенный ДАБ. Агматин (N-гуанидил-защищенный ДАБ) может быть легко депротектирован с образованием ДАБ путем кислотного гидролиза, например, кипячением агматина в концентрированном растворе минеральной кислоты, например, в водном концентрированном растворе хлористоводородной или серной кислоты. Это приводит к образованию дигидросоли ДАБ и побочных продуктов: диоксида углерода и аммиака (последний находится в форме его аммониевой соли с использованной минеральной кислотой). Для получения ДАБ в форме его свободного амина, следует выделить его дигидросоль, повторно растворить и нейтрализовать основанием.

В соответствии с последующим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу получения ДАБ, согласно которому по меньшей мере образуется один N-защищенный предшественник ДАБ, причем данный N-защищенный предшественник выбран из группы, состоящей из N⁵-ацетилорнитина, N-ацетилДАБ и N-ацетил-4-аминобутиральдегида.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления способ получения ДАБ, включающий по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, состоит из стадий: (а) биокаталитического получения N⁵-ацетилорнитина, приводящего к получению биокаталитической реакционной смеси, содержащей N⁵-ацетилорнитин, (b) выделения N⁵-ацетилорнитина из биокаталитической реакционной смеси и (с) превращения N⁵-ацетилорнитина в ДАБ.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления способ получения ДАБ, включающий по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, состоит из стадий: (а) биокаталитического получения N⁵-ацетилДАБ, приводящего к биокаталитической реакционной смеси, содержащей N-ацетилДАБ, (b) выделения N-ацетилДАБ из биокаталитической реакционной смеси и (с) превращения N-ацетилДАБ в ДАБ.

Согласно одному из конкретных вариантов осуществления способ получения ДАБ, включающий по меньшей мере одну биокаталитическую стадию, состоит из стадий: (а) биокаталитического получения N-ацетил-4-аминобутиральдегида, приводящего к биокаталитической реакционной смеси, содержащей N-ацетил-4-аминобутиральдегид, (b) выделения N-ацетил-4-аминобутиральдегида из биокаталитической реакционной смеси и (с) превращения N-ацетил-4-аминобутиральдегида в ДАБ.

При ссылке на амин или N-защищенный амин в прямом или косвенном виде, например, N-защищенный ДАБ, имеется в виду, что эти термины означают нейтральную аминогруппу, соответствующий заряженный протонированный амин, а также его соли.

Определения

Термин "или", так, как он использован здесь, определяется как "и/или" за исключением особо указанных случаев.

Термин, используемый в единственном числе, определяется как "по меньшей мере один" за исключением особо указанных случаев.

Имеется в виду, что при ссылке на существительное (например, соединение, добавку и т.д.) в единственном числе, включено также и множественное число.

При ссылке на соединение, которое существует в виде стереоизомеров, такое соединение может представлять собой любой из этих стереоизомеров или являться их комбинацией. Таким образом, при ссылке на аминокислоту, существующую в виде энантиомеров, аминокислота может быть L-энантиомером или D-энантиомером или являться их комбинацией. В случае, когда существует природный стереоизомер, соединение предпочтительно является природным стереоизомером.

Когда упоминается фермент при ссылке на класс ферментов (ЕС) в скобках, класс ферментов представляет собой такой класс, в котором фермент классифицирован или может быть классифицирован согласно Номенклатуре Ферментов, предоставленной Комитетом по Номенклатуре Международного Союза по Биохимии и Молекулярной Биологии (NC-IUBMB), причем данная номенклатура может быть найдена в http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/. Имеется в виду, что включены и другие подходящие ферменты, которые пока не выделены в отдельный класс, но по существу могут быть классифицированы.

Термин "гомологичный" или "гомолог" или "ортолог" относится к родственным последовательностям, имеющим функциональную связь, и обычно определяется, исходя из степени идентичности последовательности. Эти термины могут описывать взаимосвязь, обнаруженную в генах одних видов, подвидов, разновидностей, сортов или штаммов и соответствующих или эквивалентных генов других видов, подвидов, разновидностей, сортов или штаммов. Они могут также описывать взаимосвязь между геном, найденным в природе и искусственно сконструированным геном или между двумя искусственно сконструированными генами. Функциональная взаимосвязь может проявляться одним из нескольких способов, включающих, но не ограничивающихся (а) степенью идентичности последовательности; (b) одной и той же или подобной биологической функцией. Предпочтительно, проявляются как (а), так и (b). Подразумевается также, что термин гомолог включает в себя последовательности нуклеиновых кислот (последовательности полинуклеотидов), которые отличаются от другой последовательности нуклеиновой кислоты из-за вырождаемости генетического кода и кодируют одну и ту же полипептидную последовательность.

Повсюду в тексте, где использован термин "гомолог" в применении к полипептиду, речь идет о полипептиде, имеющем ту же самую или подобную биологическую функцию и в определенной степени идентичную последовательность относительно стандартного полипептида. Конкретно речь идет об идентичности последовательности, соответствующей по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, особенно предпочтительно по меньшей мере, 60%, особенно предпочтительно по меньшей мере, 65%, особенно предпочтительно по меньшей мере, 70%, особенно предпочтительно по меньшей мере, 75%, особенно предпочтительно по меньшей мере, 80%, конкретно по меньшей мере 85%, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 90%, по меньшей, мере 91%, по меньшей мере, 92%, по меньшей мере, 93%, по меньшей мере, 94%>, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 96%, по меньшей мер, 97%, 98% или по меньшей мере, 99%).

"Идентичность последовательности" или "сходство последовательности" здесь определяется как взаимосвязь между двумя или несколькими полипептидными последовательностями или двумя или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, определенная сравнением последовательностей. Обычно, проводят сравнение идентичности или сходства последовательностей по всей длине последовательностей, но можно также проводить сравнение только между частями последовательностей, выровненных друг с другом. В данной области техники "идентичность" или "сходство" также означает степень сходства последовательностей между полипептидными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот, в зависимости от ситуации, что определяется совпадением между такими последовательностями.

Разработаны предпочтительные способы определения идентичности или сходства, дающие наибольшее соответствие между изученными последовательностями. В контексте настоящего изобретения способ предпочтительной компьютерной программы для определения идентичности и сходства между двумя последовательностями включает в себя BLASTP и BLASTN (Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410, открыто доступный из NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Предпочтительными параметрами сравнения полипептидной последовательности при использовании BLASTP являются штраф за открытие пробела 10,0, штраф за последующий пробел 0,5, матрица Blosum 62. Предпочтительными параметрами сравнения последовательности нуклеиновых кислот при использовании BLASTP являются штраф за открытие пробела 10,0, штраф за последующий пробел 0,5, полная матрица ДНК (матрица тождественности ДНК).

Что касается "биотрансформации" или "биокаталитической реакции", то здесь это означает биохимическую реакцию, в которой в качестве катализатора используют фермент.Везде согласно настоящему изобретению, указывают, что когда используют биокатализатор, по меньшей мере, одна реакционная стадия в настоящем способе катализируется биологическим материалом или веществом, выделенным из биологического источника, например, из организма, или биомолекулой, выделенной из него. В частности, биотрансформация может быть ферментативной стадией. В частности, биокатализатор может содержать один или несколько ферментов. Биокатализатор может быть использован в любой форме. В конкретном варианте осуществления используют один или несколько ферментов, выделенных из природного окружения (выделенных из организма, в котором они образуются), например, в виде раствора, эмульсии, дисперсии, (суспензии) лиофилизованных клеток, в виде лизата или будучи иммобилизованными на подложке. В одном из вариантов осуществления один или несколько ферментов образуют часть живого организма (например, живых цельных клеток). Ферменты могут выполнять каталитическую функцию внутри клетки. Также возможно, чтобы фермент мог секретироваться в среду, где находятся клетки.

Что касается "биокаталитической реакционной смеси", то это означает здесь среду, в которой проходит биокаталитическая реакция. Это может быть клеточное окружение (для внутриклеточных или внеклеточных биокаталитических реакций) или бесклеточная среда.

Что касается "ферментативной стадии", то здесь это означает стадию способа, на которой образование или конверсия конкретного химического соединения происходит в одноклеточном организме, особенно предпочтительно в микроорганизме в культуре клеток. "Ферментативное получение" означает здесь получение химического соединения в микроорганизме, содержащем биокатализатор в культуре клеток, содержащей ферментируемый источник углерода, в котором углерод входит в состав любого из указанных соединений, которые могут превращаться в конкретное химическое соединение, которое может быть получено или в котором клетки содержат соединение для его превращения в конкретное химическое соединение, которое может быть получено из источника углерода. Микроорганизм может быть природным производителем конкретного химического соединения или он может приобрести способность продуцировать конкретное химическое соединение в результате трансформации геном, кодирующим по меньшей мере один подходящий фермент, используя технологии рекомбинантной ДНК. Природный производитель конкретного химического соединения может быть также трансформирован геном, кодирующим по меньшей мере один подходящий фермент, используя технологию рекомбинантной ДНК для того, чтобы увеличить продукцию нужного химического соединения и/или уменьшить продукцию компонентов, которые могут снизить продуктивность нужного химического соединения или помешать осуществлению дальнейших стадий способа согласно настоящему изобретению.

Предпочтительные микроорганизмы для ферментативного получения N-защищенного предшественника ДАБ могут иметь эукариотическое или прокариотическое происхождение. В частности, они могут быть выбраны из клеток животных (в том числе человека), растительных клеток, бактерий, архебактерий, дрожжей и грибов. Особенно предпочтительно, чтобы микроорганизмы могли быть выбраны из группы, состоящей из бактерий, например, Bacillus (в частности, В. subtilis), Brevibacterium (в частности, В. ketoglutamicum), коринебактерий (в частности,С.glutamicum), Escherichia (в частности, Е. coli), Klebsiella (в частности, К. pneumoniae), молочнокислых бактерий (в частности, L. lactis), пропионовых бактерий, псевдомонад (в частности, P. putida), Rodococcus (в частности, R. erythropolis, Streptomyces (в частности, S. coelicor и S. clavuligerus), дрожжей, например, Kluyveromyces (в частности, К. lactis), Penicillium (в частности, P. chrysogenum), Saccharomyces (в частности, S. cerevisiae), Aspergillus (в частности, A. niger), Pichia (в частности, P. pastoris), Hansenula, Schizosaccharomyces (в частности,& pombe), Yarowia (в частности,Y. lypolytica), грибов, например, Talaromyces.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления ферментативное получение N-защищенного предшественника происходит в микроорганизме, в котором N-защищенный предшественник образуется in vivo. Предпочтительно, образование N-защищенного предшественника согласно настоящему изобретению представляет собой биотрансформацию в N-защищенный предшественник из любого подходящего источника углерода.

Источник углерода для способа ферментации может, в частности, содержать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы монофункциональных спиртов, полифункциональных спиртов, карбоновых кислот, диоксида углерода, жирных кислот, глицеридов, в том числе смесей, содержащих любые из указанных соединений. Подходящие монофункциональные спирты включают в себя метанол и этанол, подходящие полифункциональные спирты включают в себя глицерин и углеводы. Подходящие жирные кислоты или глицериды можно, в частности, получить в форме годного к употреблению в пищу масла, предпочтительно растительного масла.

В частности, можно использовать углеводы, поскольку углеводы обычно можно получить в больших количествах из биологически возобновляемых источников, например сельскохозяйственных продуктов, предпочтительно, сельскохозяйственных отходов. Предпочтительно используют углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, сахарозы, лактозы, сахарозы, крахмала, целлюлозы и гемицеллюлозы. Особенно предпочтительными являются глюкоза, олигосахариды, содержащие глюкозу, и полисахариды, содержащие глюкозу.

Кроме того, в качестве источника углерода могут быть использованы аминокислоты или их производные, глутамат или его производные и/или орнитин или его производные.

В качестве источника азота могут быть использованы неорганические азотсодержащие соединения, например, аммиак, соли аммония, мочевина, нитраты и нитриты или органические азотсодержащие соединения, например, аминокислоты или их производные, особенно предпочтительно, глутамат или его производные и/или орнитин или его производные.

Когда здесь ссылаются на биокатализатор, это может относиться к организму, экспрессирующему по меньшей мере один фермент, необходимый для биокаталитической функции, или это может относиться по меньшей мере к одному ферменту, полученному или выделенному из этого организма. Организм может иметь эукариотическое или прокариотическое происхождение. В частности, организм может быть выбран из животных (в том числе человека), растений, бактерий, архебактерий, дрожжей и грибов.

В одном из вариантов осуществления биокатализатор образуется в животных, в частности, в их частях, например, печени, поджелудочной железе, мозгу, почках, сердце или других органах. Животные могут, в частности, быть выбраны их группы млекопитающих, особенно предпочтительно, могут быть выбраны их группы приматов (например, Homo sapiens), Leporidae, Muridae, Suidae и Bovidae.

Подходящими растениями в качестве источника биокатализаторов могут являться растения, выбранные их группы Asplenium; Cucurbitaceae, в частности, Cucurbita, например, Cucurbita moschata (сквош), или Cucumis; Mercurialis, например, Mercurialis perennis; Hydnocarpus; и Ceratonia.

Подходящие бактерии в качестве источника биокатализаторов могут, в частности, быть выбраны их группы Acinetobacter, Agrobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Brevibacterium, Clostridium, Corynebacterium, Deinococcus, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Geobacillus, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Legionella, Mycobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Novosphingobium, Paracoccus, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Thermus, Vibrio и Zymomonas.

Подходящие архебактерий в качестве источника биокатализаторов могут, в частности, быть выбраны их группы Aeropyrum, Archaeoglobus, Halobacterium, Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanocaldococcus, Methanococcus, Methanopyrus, Methanosarcina, Methanosphaera, Pyrobaculum и Thermoplasma.

Подходящие грибы в качестве источника биокатализаторов могут, в частности, быть выбраны их группы Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Rhizopus и Trichoderma.

Подходящие дрожжи в качестве источника биокатализаторов могут, в частности, быть выбраны их группы Candida, Cytophagia, Hansenula, Humicola, Kluyveromyces, Mucor, Rhizoctonia, Saccharomyces и Yarrowia.

Специалистам в данной области техники будет ясно, что могут быть использованы биокатализаторы, встречающиеся в природе (дикого типа), или мутанты биокатализаторов, встречающихся в природе, обладающие подходящей активностью в способе согласно настоящему изобретению. Свойства биокатализатора, встречающегося в природе, могут быть улучшены использованием биологических способов, известных специалистам в данной области техники, например, молекулярной эволюцией или рациональным дизайном. Мутанты биокатализаторов дикого типа могут, например, быть получены модификацией кодирующей ДНК в организме, способном действовать как биокатализатор или способном продуцировать биокаталитическое соединение (например, фермент), используя способы мутагенеза, известные специалистам в данной области техники (случайный мутагенез, сайт-направленный мутагенез, направленную эволюцию, рекомбинацию генов и т.д.). В частности, ДНК может быть модифицирована так, чтобы она кодировала фермент, который бы отличался от фермента дикого типа по меньшей мере на одну аминокислоту, так, чтобы она кодировала фермент, который бы отличался от фермента дикого типа наличием одного или нескольких замещений аминокислот, делеций и/или инсерций или так, чтобы мутант сочетал в себе последовательности двух или нескольких исходных ферментов или оказывал влияние на экспрессию подобным образом модифицированной ДНК в подходящей клетке (хозяине). Последнее может быть достигнуто способами, известными специалистам в данной области техники, например, оптимизацией кодона или оптимизацией пар кодонов, например, на основе способа, описанного в WO 2008/000632.

Мутантный биокатализатор может обладать улучшенными свойствами, например, в отношении одного или нескольких следующих аспектов: селективности к субстрату, активности, стабильности, устойчивости к действию растворителей, рН профилю, температурному профилю, субстратному профилю, чувствительности к ингибированию, использованию кофакторов и сродству к субстрату. Мутанты с улучшенными свойствами могут быть идентифицированы применением, например, подходящей высокой пропускной способностью скрининга или селекционных способов, основанных на способах, известных специалистам в данной области техники.

Когда ссылаются на биокатализатор, в частности, на фермент из конкретного источника, рекомбинантные биокатализаторы из конкретного источника, рекомбинантные биокатализаторы, в частности, ферменты, находящиеся в организме донора, но фактически образующиеся в организме хозяина (генетически модифицированном), обычно имеют в виду, что они включены как биокатализаторы, в частности, ферменты из первого организма.

Условия реакции для любой биокаталитической стадии в контексте настоящего изобретения могут быть выбраны в зависимости от известных характеристик данного биокатализатора, в частности, фермента, информации, представленной здесь и необязательно от некоторых обычных экспериментов.

Использованные значения рН реакционной среды, могут быть выбраны в широких пределах, определяемых активностью биокатализатора при этих значениях рН. Могут быть использованы щелочные, нейтральные или кислые условия в зависимости от биокатализатора и других факторов. В том случае, если способ включает в себя использование микроорганизма, например, для экспрессирования фермента, являющегося катализатором в данном способе изобретения, рН выбирают так, чтобы этот микроорганизм был способен выполнять свою запланированную функцию или функции. В частности, рН может находиться в пределах четырех единиц рН ниже нейтрального значения рН и двух единиц рН выше нейтрального значения рН, т.е. между рН 3 и рН 9 в случае преимущественно водной системы при 25°С. Систему считают водной, если вода является единственным растворителем или преобладающим растворителем (>50 масс.%, в частности >90 масс.% в расчете на общую массу жидкости), в котором, например, может быть растворено небольшое количество спирта или другого растворителя (<50 масс.%), в частности <10 масс % в расчете на общую массу жидкости) (например, в качестве источника углерода) в такой концентрации, чтобы присутствующий микроорганизм сохранял свою активность. В частности при использовании дрожжей и/или грибов предпочтительны кислые условия, в частности, рН может находиться в диапазоне от рН 3 до рН 8 в расчете на преимущественно водную среду при 25°С. При желании рН может быть изменен при использовании кислоты и/или основания или забуферен подходящей комбинацией кислоты и основания.

Условия инкубации могут быть выбраны в широких пределах, определяемых сохранением достаточной активности биокатализатора и/или ее ростом. Они включают в себя аэробные, микроаэробные условия, условия с ограниченным содержанием кислорода и анаэробные условия.

Анаэробные условия здесь определяются как условия в отсутствии кислорода или условия, в которых практически кислород не поглощается биокатализатором, в частности, микроорганизмом, и обычно соответствуют скорости поглощения кислорода, меньшей, чем 5 ммоль/л.час, в частности, скорости поглощения кислорода, меньшей, чем 2,5 ммоль/л.час. или меньшей, чем 1 ммоль/л.час.

Аэробные условия являются условиями, в которых достаточное количество кислорода для неограниченного роста растворено в среде, способной поддержать скорость поглощения кислорода при значении по меньшей мере равной 10 ммоль/л.час, особенно предпочтительно более чем 20 ммоль/л.час, еще более предпочтительно, более чем 50 ммоль/л.час, и наиболее предпочтительно, более чем 100 ммоль/л.час.

Условия с ограниченным содержанием кислорода определяют как условия, в которых поглощение кислорода ограничивается переносом кислорода из газовой фазы в жидкость. Нижний предел для условий с ограниченным содержанием кислорода определяют по нижнему пределу для анаэробных условий, т.е. обычно при скорости, равной по меньшей мере 1 ммоль/л.час, и, в частности, равной по меньшей мере 2,5 ммоль/л.час. или по меньшей мере 5 ммоль/л.час. Верхний предел для условий с ограниченным содержанием кислорода определяют по нижнему пределу для аэробных условий, т.е. при скорости, меньшей, чем 100 ммоль/л.час, меньшей, чем 50 ммоль/л.час, меньшей, чем 20 ммоль/л.час. или меньшей, чем 10 ммоль/л.час.

Вопрос о том, являются ли условия аэробными, анаэробными или условиями с ограниченным содержанием кислорода, зависит от условий, в которых проводится способ, в частности, от количества и состава входящего потока газа, реальных свойств перемешивания/массопереноса, характерных для используемого оборудования, типа используемого микроорганизма и плотности микроорганизма.

Используемая температура не является критической до тех пор, пока биокатализатор, в частности фермент, обладает достаточной активностью. Обычно, температура может быть равна по меньшей мере 0°С, в частности, по меньшей мере 15°С, особенно предпочтительно по меньшей мере 20°С. Нужная максимальная температура зависит от биокатализатора. Обычно, такая максимальная температура известна в данной области техники, например, указана в спецификации в случае коммерчески доступного биокатализатора или может быть определена по стандартной методике, исходя из обычных общих знаний и представленной здесь информации. Температура обычно равна 90°С или меньше, предпочтительно, 70°С или меньше, в частности, 50°С или меньше, особенно предпочтительно 40°С или меньше.

В частности, если биокаталитическая реакция происходит вне организма хозяина, реакционная среда, содержащая органический растворитель, может быть использована в высокой концентрации (например, в большей, чем 50%,или в большей, чем 90 масс.%), в случае, если используют фермент, который сохраняет достаточную активность в такой среде.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биокаталитическому способу, в результате которого образуется N-защищенный предшественник ДАБ, N⁵-защищенный орнитин. Например, получение N⁵-ацетилорнитина может содержать одну или несколько следующих реакций, катализируемых ферментами:

1. глутамат в N-ацетилглутамат

2. N-ацетилглутамат в N-ацетилглутамат-5-фосфат

3. N-ацетилглутамат-5-фосфат в N-ацетилглутаматполуальдегид

4. N-ацетилглутаматполуальдегид в N -ацетилорнитин

5. N-ацетилорнитин в N-ацетилорнитин

Реакцию 1) можно катализировать ферментом, выбранным из группы ацилтрансфераз (ЕС 2.3.1), предпочтительно, из группы аминокислотных N-ацетилтрансфераз (ЕС 2.3.1.1). Предпочтительно, фермент должен быть специфичным к ацетил-КоА в качестве донора ацетильной группы и к глутамату в качестве акцептора ацетильной группы. Аминокислотная N-ацетилтрансфераза может быть получена из прокариот или эукариот. Типичные белки, которые могут катализировать реакцию 1) приведены в таблице 1 вместе с их номером доступа в базе данных Uniprot и их источником (микро)организмом.

Реакцию 2) можно катализировать ферментом, выбранным из группы ацетилглутаматкиназ (ЕС 2.7.2.8). Фермент может использовать АТФ в качестве кофактора. Ацетилглутаматкиназа может быть получена из прокариот или эукариот. Типичные белки, которые могут катализировать реакцию 2) приведены в таблице 1 вместе с их номером доступа в базе данных Uniprot и их источником (микро)организмом.

Реакцию 3) можно катализировать ферментом, выбранным из группы оксидоредуктаз (ЕС 1.2.1), предпочтительно из группы N-ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктаз (ЕС 1.2.1.38). Этот фермент может использовать NADH или NADPH в качестве кофактора. N-ацетил-гамма-глутамилфосфатредуктаза может быть получена из прокариот или эукариот. Типичные белки, которые могут катализировать реакцию 3) приведены в таблице 1 вместе с их номером доступа в базе данных Uniprot и их источником (микро)организмом.

Реакцию 4) можно катализировать ферментом, выбранным из группы трансаминаз (ЕС 2.6.1), предпочтительно, из группы ацетилорнитинтрансаминаз (ЕС 2.6.1.11). Этот фермент может использовать глутамат в качестве донора аминогруппы. Ацетилорнитинтрансаминаза может быть получена из прокариот или эукариот.Типичные белки, которые могут катализировать реакцию 4) приведены в таблице 1 вместе с их номером доступа в базе данных Uniprot и их источником (микро)организмом.

Реакцию 5) можно катализировать N-ацилтрансферазой, например, глутамат-N-ацетилтрансферазой (ЕС 2.3.1.35).

Глутамат может быть получен из подходящего источника углерода в результате реакций биосинтеза глутамата, хорошо известных в данной области техники. Предпочтительно, используют микроорганизмы, аккумулирующие большое количество глутаминовой кислоты, например, Corynebacterium glutamicum. В данной области техники хорошо известны способы получения глутаминовой кислоты, например, генетической инженерией (Kimura Е., Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003; 79:37-57).

Альтернативно, получение N⁵-ацетилорнитина может содержать одну или несколько следующих реакций, катализируемых ферментами:

6) глутамат в N-ацетилглутамат

7) N-ацетилглутамат плюс орнитин в N²-ацетилорнитин

8) N²-ацетилорнитин в N⁵-ацетилорнитин

Таблица 1.
Ферменты для реакционных стадий 1-8
Реакционная стадия	Номер доступа в базе данных Uniprot	Фермент	Микроорганизм
1/6	Р0А6С5	Аминокислотная ацетилтрансфераза	Escherichia coli
1/6	Р40360	Аминокислотная ацетилтрансфераза, митохондриальная	Saccharomyces cerevisiae
2	Q01217	Белок ARG5,6, митохондриальный	Saccharomyces cerevisiae
2	Р0А6С8	Ацетилглутаматкиназа	Escherichia coli
3	Q01217	Белок ARG5,6, митохондриальный	Saccharomyces cerevisiae
3	Q8ZKL8	N-ацетил гамма-глутамилфосфат редуктаза	Salmonella typhimurium
4	Р18335	Ацетилорнитин/сукцинилдиаминопи мелатаминотрансфераза	Escherichia coli
4	P18544	Ацетилорнитинаминотрансфераза	Saccharomyces cerevisiae
5/7/8	Q04728	Бифункциональный белок ARG7, участвующий в биосинтезе аргинина, митохондриальный	Saccharomyces cerevisiae
5/7/8	Q9HW04	Глутамат-N-ацетилтрансфераза	Pseudomonas aeruginosa
5/7/8	Q59280	Глутамат-N-ацетилтрансфераза	Corynebacterium glutamicum

Реакция 6) идентична реакции 1) и ее можно катализировать тем же самым типом ферментов.

Реакцию 7) можно катализировать ферментом, выбранным из группы ацилтрансфераз (ЕС 2.3.1), предпочтительно, глутамат-N-ацетилтрансфераз (ЕС 2.3.1.35). Предпочтительно, фермент использует орнитин в качестве акцептора ацетильной группы, благодаря чему образуется глутамат и N-ацетилорнитин в качестве продукта реакции. Глутамат-N-ацетилтрансферазы могут проявлять гидролитическую активность в отношении N-ацетилглутамата, образуя в качестве продуктов гидролиза глутамат и ацетат. Предпочтительно, используемый фермент не проявляет заметной гидролитической активности; альтернативно фермент дикого типа может быть модифицирован так, что его гидролитическая активность будет существенно ниже в сравнении с ферментом дикого типа. Глутамат-N-ацетилтрансфераза может быть получена из прокариот или эукариот. Типичные белки, которые могут катализировать реакцию 7) приведены в таблице 1 вместе с их номером доступа в базе данных Uniprot и их источником (микро)организмов.

Реакция 8) идентична реакции 5) и ее можно катализировать тем же самым ферментом.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биокаталитическому способу, в результате чего N-защищенный ДАБ образуется из N⁵-защищенного орнитина. Обычно, подходящая декарбоксилаза обладает декарбоксилазной активностью в отношении N⁵-защищенного орнитина и способна катализировать превращение N⁵-защищенного орнитина в N-защищенный ДАБ.

Фермент, способный декарбоксилировать N⁵-защищенный орнитин, может, в частности, быть выбран из группы декарбоксилаз (Е.С. 4.1.1), предпочтительно из группы орнитиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.17), диаминопимелатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.20), декарбоксилаз разветвленноцепных альфа-кетокислот (ЕС 4.1.1.72), декарбоксилаз альфа-кетоизовалерата, декарбоксилаз альфа-кетоглутарата (ЕС 4.1.1.71).

Одна или несколько подходящих декарбоксилаз может быть выбрана из группы оксалатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.2), ацетоацетатдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.4), валиндекарбоксилаз/лейциндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.14), аспартат-1-декарбоксилаз (ЕС 4.1.1.11), 3-гидроксиглутаматдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.16), лизиндекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.18), аргининдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.19), 2-оксоглутаратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.71) и диаминобутиратдекарбоксилаз (ЕС 4.1.1.86).

Декарбоксилаза может, в частности, представлять собой декарбоксилазу в организме, выбранном из группы тыквенных; огурцов; дрожжей; грибов, например, Candida flareri, Hanse