Пестицидная композиция, включающая изолированный штамм burkholderia sp., соединения, выделенные из burkholderia sp., их способы получения и применения

Пестицидная композиция, включающая изолированный штамм burkholderia sp., соединения, выделенные из burkholderia sp., их способы получения и применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В настоящем изобретении предложены виды Burkholderia sp, не обладающие известной патогенностью в отношении позвоночных животных, таких как млекопитающие, рыбы и птицы, но обладающие пестицидной активностью против растений, насекомых, грибов и нематод. Также предложены природные продукты, происходящие из культуры указанных видов, и способы борьбы с появлением и/или ростом двудольных, однодольных и осоковых сорняков, модуляции роста грибов и борьбы с вредителями, такими как насекомые и нематоды, с использованием указанных природных продуктов.

Предшествующий уровень техники

Природные продукты представляют собой вещества, продуцируемые микробами, растениями и другими организмами. Микробные природные продукты представляют собой богатый источник химического разнообразия, и имеется длительная история использования природных продуктов для фармацевтических задач. Одно из таких соединений представляет собой FR901228, выделенное из Chromobacterium, и обнаружено, что он полезен в качестве антибактериального агента и противоопухолевого агента (смотри, например, Ueda et al., патент US 7396665).

Тем не менее, обнаружено, что вторичные метаболиты, продуцируемые микробами, успешно используют для борьбы с сорняками и вредителями в сельскохозяйственных применениях (смотри, например, Nakajima et al. 1991; Duke et al., 2000; Lydon & Duke, 1999; Gerwick et al., патент US 7393812). Микробные природные продукты также успешно разработаны в области сельскохозяйственных инсектицидов (смотри, например, Salama et al. 1981; Thompson et al., 2000; Krieg et al. 1983). Иногда, такие природные продукты комбинированы с химическими пестицидами (смотри, например, Gottlieb, патент US 4808207).

Burkholderia

Род Burkholderia, β-подгруппа протеобактерий, включает более чем 40 видов, которые населяют различные экологические ниши (Compant et al., 2008). Бактериальные виды рода Burkholderia представляют собой распространенные организмы в почве и ризосфере (Coenye and Vandamme, 2003; Parke and Gurian-Sherman, 2001). Традиционно, они известны как растительные патогены, причем В. cepacia является первым, раскрытым и идентифицированным как патоген, вызывающий заболевание у луковичных растений (Burkholder, 1950). Несколько видов Burkholderia устанавливают благоприятные взаимодействия с хозяевами-растениями (смотри, например, Cabballero-Mellado et al., 2004, Chen et al., 2007). Также обнаружено, что некоторые виды Burkholderia представляют собой оппортунистические человеческие патогены (смотри, например, Cheng and Currie, 2005 и Nierman et al., 2004). Дополнительно, обнаружено, что некоторые виды Burkholderia обладают потенциалом в качестве биоконтрольных продуков (смотри, например, Burkhead et al., 1994; Knudsen et al., 1987; Jansiewicz et al., 1988; Gouge et al., заявка на патент US 2003/0082147; Parke et al., патент US 6,077,505; Casida et al., патент US 6689357; Jeddeloh et al., WO 2001055398; Zhang et al., патент US 7141407). Некоторые виды этого рода эффективны для биовосстановления для деконтаминации загрязненной почвы или грунтовых вод (смотри, например, Leahy et al. 1996). Кроме того, обнаружено, что некоторые виды Burkholderia секретируют разнообразие внеклеточных ферментов, обладающих протеолитическими, липолитическими и гемолитическими активностями, а также токсинов, антибиотиков и сидерофоров (смотри, например, Ludovic et al., 2007; Nagamatsu, 2001).

Оксазолы, тиазолы и индолы

Оксазолы, тиазолы и индолы широко распространены у растений, водорослей, губок и микроорганизмов. Значительное количество природных продуктов содержат один или более чем один из пятичленных оксазольных, тиазольных и индольных ядер/группировок. Эти природные продукты демонстрируют широкий спектр биологической активности с проявляемым терапевтическим значением. Например блеомицин A (Tomohisa et al.), широко предписываемое противораковое лекарство, осуществляет окислительную деградацию ДНК и использует битиазольную группировку для связи с последовательностями-мишенями ДНК (Vanderwall et al., 1997). Бацитрацин (Ming et al., 2002), тиазолин-содержащий пептидный антибиотик, нарушает новый биосинтез бактериальной клеточной стенки путем образования комплекса с С55-бактопренолпирофосфатом. Тиангазол (Kunze et al., 1993) содержит тандемную последовательность из одного оксазола и трех тиазолинов и демонстрирует противовирусную активность (Jansen et al., 1992). Другие оксазол/тиазол-содержащие природные продукты, такие как тиострептон (Anderson et al., 1970) и GE2270A (Selva et al., 1997) ингибируют стадии трансляции в синтезе бактериального белка. Более чем о 1000 алкалоидах с индольным скелетом сообщали для микроорганизмов. Одну-треть из этих соединений представляют собой пептиды, обладающие массами за пределами 500 Да, где индол происходит из триптофана. Структурное разнообразие оставшихся двух третей выше, и их биологическая активность по-видимому покрывает более широкий диапазон, включающий антимикробную, противовирусную, цитотоксическую, инсектицидную, антитромботическую или ингибирующую фермент активности.

Краткое изложение сущности изобретения

В изобретении предложен изолированный штамм Burkholderia sp., отличающийся от Burkholderia cepacia, отличающийся от Burkholderia plantari, отличающийся от Burkholderia gladioli, который обладает следующими характеристиками:

а. Имеет последовательность гена 16S рРНК, содержащую прямые последовательности, имеющие по меньшей мере 99,0% идентичности с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 8, 11 и 12, и обратную последовательность, имеющую по меньшей мере 99,0% идентичности с SEQ ID NO: 9, 10, 13-15;

b. Обладает пестицидной, в частности, гербицидной, инсектицидной, фунгицидной и нематицидной активностью;

с.Продуцирует по меньшей мере одно из соединений, выбранных из группы, состоящей из:

(i) соединения, обладающего следующими свойствами: (а) молекулярной массой приблизительно 525-555, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (б) Значениями ¹H ЯМР (ядерного магнитного резонанса): 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (в) значениями ¹³C ЯМР: 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 и (г) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CH₃CN);

(ii) соединения, имеющего оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу; по меньшей мере 17 атомов углерода и по меньшей мере 3 атома кислорода и 2 атома азота;

(iii) соединения, имеющего оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода и 2 атома азота;

(iv) соединения, имеющего по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода и по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота и

d. не является патогенным (не инфекционен) для позвоночных животных, таких как млекопитающие, птицы и рыбы;

е. чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, пиперациллину, имипенему и комбинации сульфаметоксазола и триметоприма и

f. содержит жирные кислоты 16:0, цикло 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, цикло 19:0 ω8c, 18:0.

В конкретном воплощении штамм обладает идентифицирующими характеристиками штамма Burkholderia A396 (NRRL №В-50319).

Здесь раскрыты изолированные соединения, которые возможно получают или происходят из видов Burkholderia, или альтернативно, организмы, способные продуцировать эти соединения, которые могут быть использованы для контроля различных вредителей, в частности фитопатогенных вредителей растений, примеры которых включают насекомых, нематод, бактерии, грибы, но не ограничиваются ими. Эти соединения также могут быть использованы в качестве гербицидов.

В частности, изолированные пестицидные соединения могут включать без ограничения:

(A) соединение, обладающее следующими свойствами: (1) молекулярной массой приблизительно 525-555, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (2) значениями δ в ¹Н ЯМР 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (3) значениями δ ¹³С ЯМР 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51, и (4) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC С-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CH₃CN);

(B) соединение, имеющее оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу; по меньшей мере 17 атомов углерода и по меньшей мере 3 атома кислорода и 2 атома азота;

(C) соединение, имеющее оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода и 2 атома азота;

(D) соединение, имеющее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода и по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота, и

(Е) соединение, имеющее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, эпоксиметиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку, по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода, по меньшей мере 8 атомов кислорода и по меньшей мере 1 атом азота.

В конкретном воплощении изолированные соединения могут включать без ограничения:

(A) соединение, имеющее оксазолил-индольную структуру, содержащую по меньшей мере одну индольную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу, по меньшей мере одну карбоксильную эфирную группу, по меньшей мере 17 атомов углерода, по меньшей мере 3 атома кислорода и по меньшей мере 2 атома азота; и которое обладает по меньшей мере одним из следующих: (i) молекулярной массой приблизительно 275-435; (ii) значениями δ в ¹H ЯМР 8,44, 8,74, 8,19, 7,47, 7,31, 3,98, 2,82, 2,33, 1,08; (iii) значениями δ в ¹³С ЯМР 163,7, 161,2, 154,8, 136,1, 129,4, 125,4, 123,5, 123,3, 121,8, 121,5, 111,8, 104,7, 52,2, 37,3, 28,1, 22,7, 22,7; (iv) временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-20 минут на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием вода:ацетонитрил (CH₃CN) с градиентной системой растворителей и УФ обнаружением при 210 нм; (v) полосами УФ поглощения при приблизительно 226, 275,327 нм;

(B) соединение, имеющее оксазолил-бензильную структуру, содержащую по меньшей мере одну бензильную группировку, по меньшей мере одну оксазольную группировку, по меньшей мере одну замещенную алкильную группу и по меньшей мере одну амидную группу; по меньшей мере 15 атомов углерода и по меньшей мере 2 атома кислорода, по меньшей мере 2 атома азота; и по меньшей мере одну из следующих характеристик: (i) молекулярную массу приблизительно 240-290, определенную при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (ii) значения δ в ¹H ЯМР при приблизительно 7,08, 7,06, 6,75, 3,75, 2,56, 2,15, 0,93, 0,93; (iii) значения δ в ¹³С ЯМР 158,2, 156,3, 155,5, 132,6, 129,5, 129,5, 127,3. 121,8, 115,2, 115,2, 41,2, 35,3, 26,7, 21,5, 21,5; (iv) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CH₃CN) и (v) Полосы поглощения в УФ при приблизительно 230, 285, 323 нм;

(C) отличающееся от эпоксида соединение, содержащее по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, по меньшей мере три метиленовые группы, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере двадцать пять атомов углерода, по меньшей мере восемь атомов кислорода и один атом азота, и по меньшей мере одну из следующих характеристик: (i) молекулярную массу приблизительно 530-580, определенную при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (ii) значения δ в ¹H ЯМР 6,40, 6,39, 6,00, 5,97, 5,67, 5,54, 4,33, 3,77, 3,73, 3,70, 3,59, 3,47, 3,41, 2,44, 2,35, 2,26, 1,97, 1,81, 1,76, 1,42, 1,37, 1,16, 1,12, 1,04; (iii) значения δ в ¹³С ЯМР 173,92, 166,06, 145,06, 138,76, 135,71, 129,99, 126,20, 123,35, 99,75, 82,20, 78,22, 76,69, 71,23, 70,79, 70,48, 69,84, 60,98, 48,84, 36,89, 33,09, 30,63, 28,55, 25,88, 20,37, 18,11, 14,90, 12,81, 9,41; (iv) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 7-12 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC C-18 с использованием вода:ацетонитрил (CH₃CN) с градиентной системой растворителей и УФ обнаружением при 210 нм; (v) молекулярную формулу C₂₈H₄₅NO₁₀, определенную путем интерпретации ESIMS (масс-спектрометрия с ионизацией путем распыления электронов) и анализа данных ЯМР; (vi) полосы УФ поглощения при приблизительно 210-450 нм;

(D) соединение, содержащее (i) по меньшей мере одну сложноэфирную, по меньшей мере одну амидную, эпоксидную метиленовую группу, по меньшей мере одну тетрагидропиранозную группировку и по меньшей мере три олефиновые двойные связи, по меньшей мере шесть метильных групп, по меньшей мере три гидроксильные группы, по меньшей мере 25 атомов углерода, по меньшей мере 8 атомов кислорода и по меньшей мере 1 атом азота, (ii) значения δ в ¹³С ЯМР 174,03, 166,12, 143,63, 137,50, 134,39, 128,70, 126,68, 124,41, 98,09, 80,75, 76,84, 75,23, 69,87, 69,08, 68,69, 68,60, 48,83, 41,07, 35,45, 31,67, 29,19, 27,12, 24,55, 19,20, 18,95, 13,48, 11,39, 8,04, (iii) молекулярную формулу C₂₈H₄₅NO₉ и по меньшей мере одну из характеристик: (i) значения δ в ¹H ЯМР при приблизительно 6,41, 6,40, 6,01, 5,97, 5,67, 5,55, 4,33, 3,77, 3,75, 3,72, 3,64, 3,59, 3,54, 3,52, 2,44, 2,34, 2,25, 1,96, 1,81, 1,76, 1,42, 1,38, 1,17, 1,12, 1,04; (ii) время удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 6-15 минут, на обращенно-фазовой колонке для HPLC С-18 с использованием градиента вода:ацетонитрил (CH₃CN); (iii) полоса УФ поглощения при приблизительно 210-450 нм и конкретней при приблизительно 234 нм.

В конкретном воплощении предложены соединения, включающие без ограничения:

(А) соединение, имеющее структуру ##STR001##

или его пестицидно приемлемую соль или стереоизомеры, где М равен 1, 2, 3 или 4; n равен 0, 1, 2, или 3; p и q независимо равны 1 или 2; X представляет собой О, NH или NR; R1, R2 и R3 являются одинаковыми или отличающимися и независимо представляют собой боковую группировку аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты и R представляет собой низшую алкильную, арильную или арилалкильную группировку;

(В) соединение, имеющее структуру ##STR002##

где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой --О, --NR₁, или --S, где R₁ представляет собой --Н или C₁-C₁₀алкил; каждый из R₁, R₂ и m независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил и "m" может располагаться где угодно на оксазольном кольце;

(С) соединение, имеющее структуру ##STR002a##

где R₁ представляет собой --Н или C₁-С₁₀алкил; R₂ представляет собой алкильный сложный эфир;

(D) соединение, имеющее структуру ##STR003##

где: каждый из Х и Y независимо представляет собой --ОН, --NR₁, или --S, где R₁ представляет собой --Н или C₁-С₁₀алкил; каждый из R₁, R₂ и m, заместитель на оксазольном кольце, независимо представляет собой --Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(Е) соединение, имеющие структуру ##STR003a##

где R₁ представляет собой --Н или C₁-С₁₀алкил;

(F) соединение, имеющее структуру ##STR004a##

где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C₁-С₁₀алкил; каждый из R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.

(G) соединение, имеющее структуру ##STR004b##

где каждый из R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид, или сульфурил;

(Н) соединение, имеющее структуру ##STR004c##

где каждый из R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₁₁ независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(I) соединение, имеющее структуру ##STR005##

где каждый из Х и Y независимо представляет собой --ОН, --NR₁, или --S, где каждый из R₁, R₂ независимо представляет собой --Н, алкил (например C₁-С₁₀алкил), замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, --C(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(J) соединение, имеющее структуру ##STR006a##

где каждый из X, Y и Z независимо представляет собой -О, -NR, или -S, где R представляет собой Н или C₁-C₁₀алкил; каждый из R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₁₁, R₁₂ и R₁₃ независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероциклическую группу, замещенную гетероциклическую группу, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенную алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидрокси, галоген, амино, амидо, карбоксил, -С(0)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.

В конкретном воплощении соединения могут включать без ограничения:

(i) темплазол А;

(ii) темплазол В;

(iii) темпламид А;

(iv) темпламид В;

(v) FR90128;

(vi)

(vii)

(viii)

(ix)

(x)

(xi)

(xii)

(xvi)

(xv)

(xvi)

(xxii)

(xviii)

(xix)

(xx)

(xxi)

(xxii)

(xxiii)

(xl) FR901465

Также предложены способы получения вышеприведенных соединений. В частности, в способе осуществляют выращивание раскрытого здесь штамма Burkholderia и продукцию соединения. Также предложен способ выделения этих соединений путем выделения соединения(ий), продуцируемых штаммом Burkholderia, при котором выделяют соединения, продуцируемые из супернатанта культуры указанного штамма Burkholderia.

Дополнительно предложена комбинация, содержащая (а) первое вещество, выбранное из группы, состоящей из (1) чистой культуры, клеточной фракции или супернатанта, полученного из представленного выше штамма Burkholderia или его экстракта для применения возможно в качестве пестицида; (2) одного или более чем одного приведенного выше соединения (б) возможно второе вещество, где указанное второе вещество представляет собой химический или биологический пестицид, и (в) возможно по меньшей мере одно вещество, выбранное из носителя, разбавителя, поверхностно-активного вещества, адъюванта или пестицида. В конкретном воплощении комбинация представляет собой композицию. В связанном аспекте здесь предложено семя, покрытое указанной композицией.

В связанном аспекте здесь раскрыт способ модулирования заражения растения вредителями, при котором применяют в отношении растения и/или его семян, и/или субстрата, используемого для роста указанного растения, и/или способ модулирования появления и/или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков, при котором применяют в отношении указанного сорняка или почвы количество:

(I) (а) выделенных представленных выше соединений и (b) возможно еще одного вещества, где указанное вещество представляет собой пестицид (например, нематоцид, гербицид, фунгицид, инсектицид) или

(II) композицию или комбинацию, представленную выше

в количестве, эффективном для модулирования заражения вредителями и/или появления или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков.

В еще одном связанном аспекте предложено применение штаммов, культур, экстрактов, супернатантов, комбинаций, перечисленных выше соединений для модулирования заражения вредителями растений, при котором применение осуществляют в отношении растения и/или их семян, и/или субстрата, используемого для выращивания указанного растения, и/или способ для модулирования появления и/или роста однодольных, осоковых или двудольных сорняков.

Краткое описание графических материалов

Фиг.1 демонстрирует сравнение скорости роста Burkholderia A396 и Burkholderia multivorans ATCC 17616.

Фиг.2 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на вьюнок. Фиг.3 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на амарант.Фиг.4 демонстрирует действие экстракта Burkholderia A396 на совку ни (Tricoplusia ni).

Фиг.5 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia A396 на совку малую (Spodoptera exigua).

Фиг.6 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia

A396 на подвижность ювенильных клубеньковых нематод (Meloidogyne incognita).

Фиг.7 представляет собой схематическое представление способа очистки для получения соединений темплазола и темпламида.

Фиг.8 демонстрирует результаты анализа in vitro для тестирования фунгицидного действия FR90128 на Botrytis cinerea (слева) и Phytophtora sp. (справа).

Фиг.9 демонстрирует действие культурального бульона Burkholderia А396 на средний индекс галлов (% относительно контроля) корней огурца сорта Toschka, инокулированных 3000 яйцами Meloidogyne sp.через 14 суток после инокуляции и применения.

Фиг.10 Действие культурального бульона Burkholderia A396 на средний индекс галлов корней огурца сорта Toschka, инокулированных 3000 яйцами Meloidogyne sp.через 14 суток после инокуляции и применения.

Подробное описание воплощений

Хотя вышеприведенные композиции и способы могут быть подвергнуты различным модификациям и альтернативным формам, примеры воплощений здесь будут описаны подробно. Тем не менее, понятно, не предполагается ограничение изобретения конкретными раскрытыми формами, а наоборот, изобретение охватывает все модификации, эквиваленты и альтернативы, оказывающиеся в пределах сущности и объема изобретения, определенных в формуле изобретения.

Когда предложен диапазон значений, понятно, что здесь включено каждое промежуточное значение до десятой доли единицы нижнего предела, если в контексте ясно не указано иное, расположенное между верхним и нижним пределом диапазона, и любое иное указанное или промежуточное значение в указанном диапазоне. Меньшие диапазоны также включены. Здесь также включены верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов, подчиняющиеся любому специфически исключаемому пределу в указанном диапазоне.

Если не определено иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понимают любой из специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, похожие или эквивалентные описанным здесь, также могут быть использованы при практической реализации изобретения или тестировании настоящего изобретения, здесь описаны предпочтительные способы и материалы.

Следует отметить, что используемые здесь и в формуле изобретения формы единственного числа также включают обозначение множественного числа, если в контексте ясно не указано иное.

Определенный здесь термин "происходят из" обозначает непосредственно выделенный или полученный из конкретного источника или альтернативно обладающий идентифицирующими характеристиками вещества или организма, выделенного или полученного из конкретного источника.

Определенное здесь "выделенное соединение" по существу не содержит другие соединения или вещества, например, является по меньшей мере приблизительно на 20% чистым, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 40% чистым, более предпочтительно приблизительно на 60% чистым, еще более предпочтительно приблизительно на 80% чистым, наиболее предпочтительно приблизительно на 90% чистым, и наиболее предпочтительно приблизительно на 95% чистым, что определяестя при помощи аналитических способов, включающих без ограничения хроматографические способы, электрофоретические способы.

Используемый здесь термин "алкил" относится к одноцепочечной или разветвленной углеводородной группе, имеющей от одного до приблизительно 12 атомов углерода, включающих метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, трет-бутил, н-гексил и т.п.

Используемый здесь термин "замещенный алкил" относится к алкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, выбранный из гидрокси, алкокси, меркапто, циклоалкила, замещенного циклоалкила, гетероциклической, замещенной гетероциклической, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, арилокси, замещенной арилокси, галогена, циано, нитро, амино, амидо, -C(O)H, ацила, оксиацила, карбоксила, сульфонила, сульфонамида, сульфурила и т.п.

Используемый здесь термин "алкенил" относится к прямоцепочечным или разветвленным гидрокарбильным группам, имеющим одну или более чем одну углерод-углеродную двойную связь, и имеющим приблизительно от 2 до 12 атомов углерода, и "замещенный алкенил" относится к алкенильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "алкинил" относится к прямоцепочечным или разветвленным гидрокарбильным группам, имеющим по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, и имеющим от приблизительно 2 до 12 атомов углерода, и "замещенный алкинил" относится к алкинильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "арил" относится к ароматическим группам, имеющим от 6 до 14 атомов углерода, и "замещенный арил" относится к арильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "гетероарил" относится к ароматическим кольцам, содержащим один или более чем один гетероатом (например N, О, S, и т.п.) как часть кольцевой структуры, и имеющим от 3 до 14 атомов углерода, и "замещенный гетероарил" относится к гетероарильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "алкокси" относится к группировке --O-алкил-, где алкил является таким, как определено выше, и "замещенная алкокси" относится к алкоксильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "тиоалкил" относится к группировке --S-алкил-, где алкил является таким, как определено выше, и "замещенный тиоалкил" относится к тиоалкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "циклоалкил" относится к содержащим кольцо алкильным группам, содержащим от приблизительно 3 до 8 атомов углерода, и "замещенный циклоалкил" относится к циклоалкильным группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Используемый здесь термин "гетероциклическая" относится к циклическим (т.е. содержащим кольцо) группам, содержащим один или более чем один гетероатом (например, N, О, S и т.п) как часть кольцевой структуры, и имеющим от 3 до 14 атомов углерода, и "замещенная гетероциклическая" относится к гетероциклическим группам, дополнительно несущим один или более чем один заместитель, представленный выше.

Штамм Burkholderia

Представленный здесь штамм Burkholderia отличается от комплекса Burkholderia cepacia, отличается от Burkholderia plantari, отличается от Burkholderia gladioli, Burkholderia sp и не является патогенным в отношении позвоночных животных, таких как птицы, млекопитающие и рыбы. Этот штамм может быть выделен из образца почвы с использованием способов, известных в области техники и описанных Lorch et al., 1995. Штамм Burkholderia может быть выделен из множества отличающихся типов почвы или ростовой среды. Образец затем высевают на картофельно-декстрозном агаре (PDA). Бактерии являются грамотрицательными и образуют округлые непрозрачные колонии кремового цвета, который меняется на розовый и розово-коричневый и слизеподобный или вязкий с течением времени.

Колонии выделяют из планшет с картофельно-декстрозным агаром и отбирают колонии, обладающие биологическими, генетическими, биохимическими и/или энзиматическими характеристиками штамма Burkholderia по настоящему изобретению, изложенными в нижеприведенных примерах. В частности, штамм Burkholderia имеет ген 16S рРНК, содержащий прямую последовательность, которая, по меньшей мере приблизительно на 99,0%, предпочтительно приблизительно на 99,5%, более предпочтительно приблизительно на 99,9%, и наиболее предпочтительно приблизительно на 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, 11 и 12, и прямую последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 99,0%, предпочтительно приблизительно на 99,5%, более предпочтительно приблизительно на 99,9% и наиболее предпочтительно приблизительно на 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 и 15, определенной при помощи программного обеспечения Clustal. Кроме того, как представлено ниже, этот штамм Burkholderia может, как представлено ниже, обладать пестицидной активностью, в частности, вироцидной, гербицидной, гермицидной, фунгицидной, нематицидной, бактерицидной и инсектицидной и конкретней, гербицидной, инсектицидной, фунгицидной и нематицидной активностью. Он не патогенен для позвоночных животных, таких как млекопитающие, птицы, и рыбы.

Дополнительно, штамм Burkholderia продуцирует по меньшей мере пестицидные соединения, представленные в данном описании.

Штамм Burkholderia чувствителен к канамицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, пиперациллину, имипенему и комбинации сульфаметоксазола и триметоприма, и содержит жирные кислоты 16:0, цикло 17:0, 16:0 3-ОН, 14:0, цикло 19:0, 18:0.

Этот штамм Burkholderia может быть получен путем культивирования микроорганизма, обладающего идентифицирующими характеристиками Burkholderia A396 (NRRL Accession No. B-50319), на картофельно-декстрозном агаре (PDA) или в ферментирующей среде, содержащей определенные источники углерода, такие как глюкоза, мальтоза, фруктоза, галактоза и неопределенные источники азота, такие как пептон, триптон, сойтон и NZ амин.

Пестицидные соединения

Раскрытое здесь пестицидное соединение может обладать следующими свойствами: (а) получено из новых видов рода Burkholderia, например, A396; (b) в частности, токсично для большинства обычных сельскохозяйственных вредителей-насекомых; (с) обладает молекулярной массой приблизительно 525-555 и конкретней, 540, определенной при помощи жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS); (d) обладает значениями δ ¹H ЯМР 6,22, 5,81, 5,69, 5,66, 5,65, 4,64, 4,31, 3,93, 3,22, 3,21, 3,15, 3,10, 2,69, 2,62, 2,26, 2,23, 1,74, 1,15, 1,12, 1,05, 1,02; (d) обладает значениями δ ¹³C ЯМР 172,99, 172,93, 169,57, 169,23, 167,59, 130,74, 130,12, 129,93, 128,32, 73,49, 62,95, 59,42, 57,73, 38,39, 38,00, 35,49, 30,90, 30,36, 29,26, 18,59, 18,38, 18,09, 17,93, 12,51 (е) обладает временем удерживания в жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) приблизительно 10-15 минут, конкретней приблизительно 12 минут и конкретней приблизительно 12,14 мин на обращенно-фазовой колонке С-18 HPLC (Phenomenex, Luna 5µ C18 (2) 100А, 100×4,60 мм) с использованием вода:ацетонитрил (CH₃CN) с градиентной системой