Анти-с4.4а антитела и их применение

Анти-с4.4а антитела и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантные антигенсвязывающие области и антитела, и функциональные фрагменты, содержащие такие антигенсвязывающие области, которые являются специфичными для заякоренного в мембране полипептида массой 29 кДа, называемого С4.4а, который сверхэкспрессируется в опухолях.

Кроме того, он имеет высокую распространённость в метастазах этих типов рака. Антитела, соответственно, могут применяться для лечения этих и других расстройств и состояний. Антитела в соответствии с настоящим изобретением также могут применяться в области диагностики, так же как и для дальнейшего исследования роли С4.4а в развитии нарушений, связанных с раком. Изобретение также обеспечивает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вышеупомянутые антитела, векторы, содержащие эти последовательности, фармацевтические композиции и наборы с инструкциями по применению.

Уровень техники

Терапия, основанная на антителах, оказывается очень эффективной при лечении различных раковых образований, включая солидные опухоли. Например, HERCEPTIN® успешно применяется для лечения рака молочной железы, и RITUXAN® эффективен при формах рака, связанных с В-клетками. Центральное место в развитии успешной терапии, основанной на антителах, является выделение антител против белков клеточной поверхности, про которые известно, что они предпочтительно экспрессируются на опухолевых клетках. Полипептид С4.4а (название гена: LYPD3) представляет собой заякоренный через гликофосфатидилинозитол (ГФИ) высокогликозилированный белок клеточной поверхности. Мышиный С4.4а был сначала описан как связанный с метастазами белок клеточной поверхности в раковых клетках крысы с метастазирующей опухолью поджелудочной железы (Wurfel, J. et. al. Gene 2001, 262:35-41). Человеческий С4.4а был клонирован из библиотеки плацентарной к-ДНК (Wurfel, J. et. al. Gene 2001, 262:35-41). С4.4а показывает структурную гомологию с uPAR-рецептором и содержит два домена LY6, показывающие типичные три складки белка цинкового пальца (Jacobsen В. & Ploug M., Current Medicinal Chemistry 2008, 15:2559-2573). Белок является высоко гликозилированным и содержит 6 предсказанных сайтов N-гликозилирования и несколько сайтов O-гликозилирования. Кроме того, С4.4а содержит в общей сложности 9 дисульфидных мостиков, локализованных в двух доменах Ly6 (Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857). С4.4а показывает сильную экспрессию в опухолевых клетках рака легких, колоректального рака, рака молочной железы, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, рак почек, рака головы и шеи и меланомы.

Нозерн-блоттинг продемонстрировал экспрессию С4.4а в ~50% первичных опухолей легкого и ~75% метастаз опухоли легкого, в то время как экспрессия в здоровой ткани легкого не была обнаружена (Wurfel J. et. al., Gene 2001, 262:35-41). Для немелкоклеточного рака легких С4.4а может использоваться в качестве прогностического маркера. В этом случае клинические данные ясно показывают, что высокая экспрессия С4.4а коррелирует с плохим прогнозом (Hansen L. et al., Lung Cancer 2007, 58:260-266). Детализированный анализ экспрессии в меланоме показал, что С4.4а не экспрессируется в меланоцитах и невусах, но экспрессируется в ~60% первичных злокачественных меланомах и в 100% метастаз в лимфатических узлах и коже (Seiter S. et al., J Invest Dermatol. 2001, 116(2):344-347). Кроме того, была обнаружена стимуляция экспрессии гена С4.4а в ткани рака молочной железы по сравнению с близлежащей нормальной тканью молочных желез (Fletcher G.C., Br. J. Cancer 2003, 88(4):579-585), в различных клеточных линиях рака молочной железы и при уротелиальном раке по сравнению с нормальным уротелием (Smith В. A. et al., Cancer Res 2001, 61(4):1678-1685). Экспрессия С4.4а была продемонстрирована с помощью FACS (клеточного сортера с возбуждением флуоресценции) с поликлональным антителом в различных опухолевых клеточных линиях колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы и рака простаты. В IHC (иммуногистохимических) исследованиях образцов колоректального рака, рака поджелудочной железы и рака молочной железы вариабельное гликозилирование С4.4а на человеческих опухолевых клеточных линиях препятствует связыванию этих антител. Поэтому С4.4а должен быть по меньшей мере частично дегликозилированным, чтобы дать возможность для связывания этих поликлональных антител. У больных колоректальным раком экспрессия С4.4а широко распространена, и С4.4а покидает поверхность клеток, что делает его прогностическим сывороточным опухолевым маркером. Экспрессия С4.4а на инвазивном фронте является новым прогностическим маркером для рецидива колоректального рака (K. Konishi et al., Cancer Science 2010). Диагностические антитела против растворимого сывороточного С4.4а не были описаны (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156). В нормальной ткани экспрессия С4.4а ограничена кератиноцитами кожи, эндотелиальными клетками пищевода и плацентарными клетками (Wurfel J. et. al., Gene 2001, 262:35-41), делая его идеальной мишенью для терапии опухоли. WO 01/23553 предлагает использование ингибитора С4.4а (например, анти-С4.4а антитело), который уменьшает или ингибирует экспрессию С4.4а или активность для лечения рака.

Точная функция С4.4а остается неизвестной; однако, он стимулируется в мигрирующих кератиноцитах при заживлении раны (Hansen L. et al., Biochem J. 2004, 380:845-857). В свете ассоциации с метастазами и структурной гомологии с uPAR предполагается, что эта молекула участвует в инвазии опухолевой клетки, вероятно, через взаимодействие с внеклеточным матриксом (Rosel М. et al., Oncogene 1998, 17(15):1989-2002; Paret С. et al, British Journal of Cancer 2007, 97:1146-1156). Потенциальными лигандами являются ламинин 1 и 5, галектин 3 (Paret С, Int. J. Cancer 2005, 115:724-733), а также agr2 (Anterior gradient homolog) и agr3 (Fletcher GC, Brit. J. Cancer 2003, 88:579-585).

Прогностическое значение ксенотрансплантатных мышиных моделей рака для клинического исхода болезни при терапии рака иммунотоксинами часто ограничивается отсутствием кросс-реактивности терапевтических антител с их мышиными ортологами, что приводит к уменьшенному неспецифическому связыванию с нормальной тканью. С другой стороны, нейтрализующие антимышиные Fv антитела, которые образуются у пациентов, которых лечат мышиными или химерными антителами, могут привести или к ограничивающей дозу токсичности, или к уменьшению терапевтической эффективности. Таким образом, чтобы полностью использовать потенциал специфической экспрессии С4.4а в терапии рака, требуются нацеливающие антитела, которые объединяют преимущества высокой аффинности связывания С4.4а с человеческими или гуманизированными антителами и с мышиной кросс-реактивностью.

Другим необходимым признаком новых антител является высокоаффинное связывание с различными линиями раковых клеток, экспрессирующими С4.4а на своей поверхности. С4.4а по-разному гликозилирован на опухолевых клетках (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156). Таким образом, эффективные анти-С4.4а антитела должны связываться с эпитопом, презентирующимся опухолевыми клетками различных пациентов, независимо от индивидуальных различий, включая, но не ограничиваясь этим, различия в характере гликозилирования, которые приводит к экспрессии различных форм С4.4а.

Настоящее изобретение обеспечивает антитела, антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты, которые связываются с С4.4а с высокой аффинностью, эффективно интернализуются, и которые предпочтительно являются кросс-реактивными с С4.4а из других видов. Также предлагаются основанные на антителе способы лечения рака, в особенности для опухолей экспрессирующих С4.4а, таких как рак молочной железы, дыхательных путей, мозга, репродуктивных органов, пищеварительного тракта, мочевых путей, глаза, печени, кожи, головы и шеи, щитовидной железы, паращитовидной железы и их отдаленных метастазов, также включая лимфомы, саркомы и лейкемии. Эти способы лечения используют антитела, антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты, которые облегчают доставку терапевтически активных компонентов к раковым клеткам.

Краткое изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител или их вариантов, которые являются высокоселективными для полипептида С4.4а, либо ГФИ-заякоренного на клеточной поверхности, либо растворимого благодаря удалению ГФИ-части, в сыворотке пациента и которые могут применяться в способах обнаружения экспрессии С4.4а, которая связана с заболеваниями, такими как рак легких, толстой кишки, молочной железы, шейки матки, поджелудочной железы, почки, головы и шеи или меланомы, и в лечении таких заболеваний. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение выделенных человеческих, гуманизированных или химерных антител или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, которые специфически связываются с эпитопом С4.4а, который присутствует в различных формах зрелого человеческого полипептида С4.4а из 278 аминокислот (SEQ ID 1), который представляется линиями раковых клеток, экспрессирующими С4.4а, и/или который связывается этими антителами с высокой аффинностью. Как применяется в описании настоящего изобретения, различные «формы» С4.4а включают, но не ограничиваются этим, различные гликоформы, различные изоформы или полипептиды С4.4а, которые подвергаются различным трансляционными и посттрансляционными модификациями. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые безопасны для введения человеку.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антителами, или антигенсвязывающими фрагментами этих антител, или их вариантами, которые связываются с человеческим С4.4а и являются кросс-реактивными с С4.4а других видов. Предпочтительно указанными другими видами являются грызуны, такие как, например мыши или крысы. Наиболее предпочтительно, чтобы антитела, или антигенсвязывающие фрагменты этих антител или их варианты связывались с человеческим С4.4а и являлись кросс-реактивными к мышиному С4.4а.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые связываются с широким набором различных клеток экспрессирующих С4.4а. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител или их вариантов, которые связываются с различными раковыми клетками или опухолевыми клетками, экспрессирующими С4.4а, и вызывают иммуноэффекторную активность (например, ADCC или CDC) против раковых клеток, экспрессирующих С4.4а, при помощи одного или более антител или их вариантов в соответствии с настоящим изобретением.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, или антигенсвязывающих фрагментов этих антител, или их вариантов, которые эффективно интернализуются после связывания с клеткой, экспрессирующей С4.4а. Антитело в соответствии с настоящим изобретением можно вводить одновременно с известными лекарственными средствами, и в некоторых случаях антитело может быть модифицировано само по себе. Например, антитело может быть конъюгировано с цитотоксическим агентом, иммунотоксином, токсофором или радиоизотопом для возможного дополнительного увеличения эффективности.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение антител, которые составляют инструмент для диагноза злокачественных или диспластических состояний, при которых экспрессия С4.4а повышается по сравнению с нормальной тканью или при которых С4.4а покидает поверхность клеток и становится детектируемым в сыворотке. Предлагаемые анти-С4.4а антитела являются конъюгированными с детектируемым маркером. Предпочтительными являются радиоактивно-меченные маркеры, ферментативно-меченные, меченные хромофором или люминофором.

Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты, к клеткам, экспрессирующим антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты, к способам получения антител в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающих фрагментов, к способам ингибирования роста диспластических клеток с применением антител в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающих фрагментов и к способам лечения и обнаружения рака, применяя антитела в соответствии с настоящим изобретением или их антигенсвязывающие фрагменты.

Изобретение обеспечивает антитела, которые отличаются от существующих антител С4.4а (Paret С. et al., British Journal of Cancer 2007 97:1146-1156) в том, что они а) связываются с природным, экспрессирующимся на клеточной поверхности и полностью гликозилированным С4.4а, предпочтительно с доменом S1 природного экспрессирующегося на клеточной поверхности и полностью гликозилированного С4.4а, b) являются кросс-реактивными по отношению к мышиному С4.4а, и с) эффективно интернализируются в клетках, экспрессирующих С4.4а. Эти и другие цели настоящего изобретения более полно описаны в настоящем описании.

Одним объектом настоящего изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат антигенсвязывающую область, которая связывается специфически с природным экспрессирующимся на клеточной поверхности и полностью гликозилированным С4.4а, предпочтительно связывается специфически с доменом S1 (аминокислоты 1-85 из С4.4а; SEQ ID NO:1) природного экспрессирующегося на клеточной поверхности и полностью гликозилированного С4.4а полипептида. В другом варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты интернализуются в клетку, экспрессирующую С4.4а, после связывания антитела или антигенсвязывающего фрагмента с вышеупомянутой клеткой. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с человеческим С4.4а с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты конкурируют за связывание с С4.4а человека и грызуна с антителами М31-В01 или M20-D02 S-A, дополнительный предпочтительный вариант осуществления состоит в том, что С4.4а грызунов является мышиными С4.4а.

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:5 (H-CDR1), SEQ ID NO:9 (H-CDR2) и SEQ ID NO:13 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:17 (L-CDR1), SEQ ID NO:21 (L-CDR2) и SEQ ID NO:25 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержит антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:6 (H-CDR1), SEQ ID NO:10 (H-CDR2) и SEQ ID NO:14 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:18 (L-CDR1), SEQ ID NO:22 (L-CDR2) и SEQ ID NO:26 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:7 (H-CDR1). SEQ ID NO:11 (H-CDR2) и SEQ ID NO:15 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:19 (L-CDR1), SEQ ID NO:23 (L-CDR2) и SEQ ID NO:27 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:8 (H-CDR1), SEQ ID NO:12 (H-CDR2) и SEQ ID NO:16 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:20 (L-CDR1), SEQ ID NO:24 (L-CDR2) и SEQ ID NO:28 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:45 (H-CDR1), SEQ ID NO:46 (H-CDR2 и SEQ ID NO:47 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:48 (L-CDR1), SEQ ID NO:49 (L-CDR2) и SEQ ID NO:50 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:55 (H-CDR1), SEQ ID NO:56 (H-CDR2) и SEQ ID NO:57 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:58 (L-CDR1), SEQ ID NO:59 (L-CDR2) и SEQ ID NO:60 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением или его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:65 (H-CDR1), SEQ ID NO:66 (H-CDR2) и SEQ ID NO:67 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:68 (L-CDR1), SEQ ID NO:69 (L-CDR2) и SEQ ID NO:70 (L-CDR3).

В дополнительном более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:75 (H-CDR1), SEQ ID NO:76 (H-CDR2) и SEQ ID NO:77 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:78 (L-CDR1), SEQ ID NO:79 (L-CDR2) и SEQ ID NO:80 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:85 (H-CDR1), SEQ ID NO:86 (H-CDR2) и SEQ ID NO:87 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:88 (L-CDR1), SEQ ID NO:89 (L-CDR2) и SEQ ID NO:90 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:95 (H-CDR1), SEQ ID NO:96 (H-CDR2) и SEQ ID NO:97 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:98 (L-CDR1), SEQ ID NO:99 (L-CDR2) и SEQ ID NO:100 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:105 (H-CDR1), SEQ ID NO:106 (H-CDR2) и SEQ ID NO:107 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:108 (L-CDR1), SEQ ID NO:109 (L-CDR2) и SEQ ID NO:110 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:115 (H-CDR1), SEQ ID NO:116 (H-CDR2) и SEQ ID NO:117 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:118 (L-CDR1), SEQ ID NO:119 (L-CDR2) и SEQ ID NO:120 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:125 (H-CDR1), SEQ ID NO:126 (H-CDR2) и SEQ ID NO:127 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:128 (L-CDR1), SEQ ID NO:129 (L-CDR2) и SEQ ID NO:130 (L-CDR3).

В более предпочтительном варианте осуществления антитело в соответствии с настоящим изобретением его антигенсвязывающий фрагмент содержат антигенсвязывающую область тяжелой цепи, которая содержит SEQ ID NO:135 (H-CDR1), SEQ ID NO:136 (H-CDR2) и SEQ ID NO:137 (H-CDR3), и содержит антигенсвязывающую область легкой цепи, которая содержит SEQ ID NO:138 (L-CDR1), SEQ ID NO:139 (L-CDR2) и SEQ ID NO:140 (L-CDR3).

Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть IgG (например, IgG1 IgG2, IgG3 IgG4), в то время как фрагмент антитела может быть Fab, Fab', F(ab')₂ или scFv, например. Фрагмент антитела в соответствии с настоящим изобретением, соответственно, может представлять собой или может содержать антигенсвязывающую область, которая ведет себя одним или более способами как описано в настоящем изобретении.

Изобретение также относится к выделенным последовательностям нуклеиновой кислоты, каждая из которых может кодировать вышеупомянутое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые является специфичными для эпитопа С4.4а. Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением подходят для продуцирования антител или антигенсвязывающих фрагментов антител с помощью рекомбинантных технологий. Таким образом, настоящее изобретение также относится к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут применяться для терапевтических или профилактических применений. Изобретение поэтому включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения нарушения или состояния, связанных с нежелательным присутствием клеток, экспрессирующих С4.4а. В предпочтительном варианте осуществления вышеупомянутым нарушением является рак. Такой способ содержит стадии введения нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, которая содержит антитело в соответствии с настоящим изобретением, как описано или рассмотрено в настоящем изобретении.

Изобретение также обеспечивает инструкции по применению библиотеки антител для выделения одного или более членов такой библиотеки, которые связываются специфически с С4.4а.

Описание чертежей

Фиг.1 показывает результат эксперимента по группированию эпитопов (Epitope grouping), выполненного с использованием сэндвич-анализа поверхностного плазменного резонанса. Y представляет собой единицы резонанса, Х - время в секундах. Одно из антител в соответствии с настоящим изобретением использовали для покрытия чипа. А указывает время добавления С4.4а. В указывает время добавления вторичного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Оба антитела неспособны одновременно связаться с С4.4а, что указывает по меньшей мере на перекрывающийся эпитоп.

Фиг.2 обеспечивает данные по связыванию анти-С4.4а антител в соответствии с настоящим изобретением с рекомбинантным человеческим (а) и мышиным (b) С4.4а на человеческом IgGI. Значения ЕС₅₀ определяли с помощью ELISA, как описано в Примере 4. М31-В01 (А) связывается с EC₅₀ 0,24 и 0,29 нМ с человеческим и мышиным С4.4а, соответственно. М20 В02 S-A (В) связывается с ЕС₅₀ 0,3 и 0,38 нМ с человеческим и мышиным С4.4а, соответственно. Х представлена как log нМ; Y представляет поглощение при 360 нм.

Фиг.3 обеспечивает данные по специфическому связыванию антител в соответствии с настоящим изобретением с различными опухолевыми клеточными линиями, либо трансфецированными hC4.4а, например A549:hC4.4a (а), либо с опухолевыми клеточными линиями с природной экспрессией С4.4а, например NCI H322 (b) NCI H292 (с), H1975/BCRP (d) или ВхРС3 (е). Значения ЕС₅₀ для связывающих М31-В01 (незакрашенные кружки) и M20-D02 S-A (закрашенные кружки) суммированы в (f). Контроль в виде изотипических IgGI (закрашенные треугольники) не показал связывания с клетками. Все данные были получены с помощью титрования FACS. Х представляет собой концентрацию (log нМ), и Y - среднее геометрическое значение флуоресценции (х10³).

Фиг.4(а) обеспечивает данные по специфической интернализации флуоресцентно-меченных анти-С4.4а антител в клетках А549:hC4.4а. Фиг.4(b) обеспечивает данные по нетрансфецированным клеткам А549 в качестве отрицательного контроля. А - М31-В01 (закрашенные квадраты); В - М20-D02 S-A (незакрашенные квадраты); С является контролем в виде изотипических hIgGI (звездочки); Х представляет время в минутах, и Y - количество гранул/клетка [* 10³]. Оба типа С4.4а антител интернализуются специфически, эффективно и быстро в опухолевых клетках, несущих С4.4а.

Фиг.4(с) и (d) представляет данные по интернализации М31-В01 в клетках А549:hC4.4а. Через 5 минут (с) можно наблюдать только слабое окрашивание клеточной поверхности. Через 90 минут (d) ясно видны интенсивно окрашенные эндосомы, содержащие интернализованное антитело М31-В01 , которое несет рН-зависимый флуоресцентный краситель, что указывает на эффективную интернализацию.

Фиг.5 представляет данные, что эпитоп М31-В01 и M20-D02 S-A связывается, как определено с помощью вестерн-блоттинга. А) показывает окрашенный Кумасси 250 SDS-PAGE различных видов С4.4а (линии 2+7 hC4.4а, линии 3+8 mC4.4a, линии 4+9 hC4.4a домен SI-Fc-his6, линии 5+10 hC4.4a домен S2-Fc-his6; линии 1, 6 и 11 содержат маркеры молекулярной массы; линии 2-5 содержат невосстановленные образцы; линии 6-10 содержат восстановленные образцы), В), и С) показывают соответствующие вестерн-блоты с одинаковой нагрузкой образца как в А). В) инкубировали с М31-В01, и С) инкубировали с M20-D02 S-A как идентифицирующее антитело. Оба антитела показывают окрашивание, специфическое, зависимое от восстановления, указывающее на конформационный эпитоп. Однако оба связываются с человеческим и мышиным полноразмерным С4.4а и с доменом S1 человеческого С4.4а, но не доменом S2 человеческого С4.4а.

Фиг.6 представляет данные по ингибированию пролиферации опухолевых клеток in vitro посредством антитела в соответствии с настоящим изобретением (В01-3), определенные с помощью измерений анализатором xCELLigence. Клетки A549:hC4.4a были либо совместно инкубированы с 100 нМ несвязывающих контрольных изотипических антител hIgGI (А), либо с 100 нМ В01-3 (В) в однолуночном планшете E-plate в течение времени, указанного в условиях, описанных в примере 15. Х - время в часах, Y -относительный уровень пролиферации клеток. Клетки A549:hC4.4a, инкубированные с В01-3, показывают уменьшенную пролиферацию клеток по сравнению с контрольными IgGI.

Фиг.7 показывает последовательности в соответствии с настоящим изобретением.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии новых антител, которые являются специфичными для С4.4а или имеют высокую аффинность к С4.4а и могут обеспечить терапевтическую полезность для субъекта. Антитела в соответствии с настоящим изобретением, которые могут быть человеческим, гуманизированными или химерными, могут использоваться во многих контекстах, которые более полно описаны в настоящем изобретении.

Определения

"Человеческое" антитело или его антигенсвязывающий фрагмент настоящим определено как такое, которое не является химерным (например, не "гуманизированным") и не из (ни полностью, ни частично) видов, отличных от человека. Человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть получены от человека или могут быть синтетическим человеческим антителом. "Синтетическое человеческое антитело" определяется в настоящем изобретении как антитело, получившее последовательность, полностью или частично, in silico из синтетических последовательностей, которые основаны на анализе известных человеческих последовательностей антител. Конструирование in silico последовательности человеческого антитела или его фрагмента может быть достигнуто, например, с помощью анализа базы данных человеческих антител или последовательностей фрагмента антител и созданием полипептидной последовательности, с использованием данных, полученных оттуда. Другим примером человеческого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента является антитело, которое кодируется нуклеиновой кислотой, выделенной из библиотеки последовательностей антител человеческого происхождения (например, такой библиотеки, которая основана на антителах, взятых из человеческого природного источника). Примеры человеческих антител включают антитела, описанные в Soderlind et al., Nature Biotech. 2000, 18:853-856.

"Гуманизированное антитело" или его гуманизированный антигенсвязывающий фрагмент определяются в настоящем изобретении как такие, которые (i) получаются из нечеловеческого источника (например, трансгенной мыши, которая несет гетерологичную иммунную систему), антитело которого происходит из последовательности человеческой зародышевой линии; (ii), где аминокислоты каркасной области нечеловеческого антитела частично заменены человеческими аминокислотными последовательностями с помощью генетической инженерией или (iii) привитые на гипервариабельном участке (CDR), где гипервариабельные участки CDR вариабельного домена имеют нечеловеческое происхождение, в то время как одна или более структур вариабельного домена имеют человеческое происхождение, а константный домен (если таковой имеется) имеет человеческое происхождение.

"Химерное антитело" или его антигенсвязывающий фрагмент определяется в настоящем изобретении как антитело, в котором вариабельные домены имеют нечеловеческое происхождение, а некоторые или все константные домены имеют человеческое происхождение.

Термин "моноклинальное антитело", как применяется в описании настоящего изобретения, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть, индивидуальные антитела, содержащиеся в популяции, являются идентичными антителами за исключением возможных мутаций, например, естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Таким образом, термин "моноклональный" указывает на характер антител, как не являющихся смесью отдельных антител. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против единственного эпитопа на антигене. В дополнение к их специфичности препараты моноклональных антител имеют преимущество в том, что они как правило, неконтаминированы другими иммуноглобулинами. Термин "моноклональный" не следует истолковывать, как требование продуцирования антитела каким-то особым методом. Термин моноклональное антитело специфически включает химерные, гуманизированные и человеческие антитела.

Как использующиеся в настоящем изобретении, антитело, которое "связывается специфически с" антигеном, "является специфическим к/для" антигену/антигена или "специфически узнает" антиген, представляющий интерес, например, опухоль-ассоциированную полипептидную антигенную мишень (в настоящем изобретении С4.4а), является антителом, которое связывает антиген с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело становится полезным как терапевтический агент в клетке-мишени или ткани-мишени, экспрессирующих антиген, и имеющее незначительную кросс-реактивность с другими белками или имеющее незначительную кросс-реактивность с такими белками как ортологи и варианты (например, мутантные формы, варианты сплайсинга или протеолитически усеченные формы) вышеупомянутой антигенной мишени. Выражение "специфически узнает" или "связывается специфически с" или является "специфическим к/для" по отношению к конкретному полипептиду или эпитопу на конкретной полипептидной цепи, как применяется в описании настоящего изобретения, может демонстрироваться, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, имеющим моновалентную Ко для антигена меньше, чем около 10^-4 М, альтернативно меньше, чем около 10^-5 М, альтернативно меньше, чем около 10^-6 М, альтернативно меньше, чем около 10^-7 М, альтернативно меньше, чем около 10^-8 М, альтернативно меньше, чем около 10^-9 М, альтернативно меньше, чем около 10^-10 М, альтернативно меньше, чем около 10^-11 М, альтернативно меньше, чем около 10^-12 М, или меньше. Антитело "связывается специфически с" антигеном, "специфическое к/для" антигену/антигена или "специфически узнает" антиген, если такое антитело в состоянии отличить такой антиген от одного или более ссылочного антигена(ов). В своей самой общей форме, "специфическое связывание", "связывается специфически с", является "специфическим к/для" или "специфически узнает" относится к способности антитела различать между антигеном, представляющим интерес, и неродственным антигеном, как определяется, например, в соответствии с одним из нижеследующих способов. Такие способы включают, но не ограничены этим: Вестерн-блоттинг, ELISA, РИА (радиоиммуноанализ), ECL (электрогенерированная хемилюминесценция), IRMA (иммунорадиометрический анализ) и пептидное сканирование. Например, может быть осуществлен стандартный анализ ELISA. Оценка может осуществляться посредством стандартного развития окрашивания (например, вторичное антитело с пероксидазой хрена и тетраметилбензидином с перекисью водорода). Реакция в определенных лунках оценивается по оптической плотности, например, при 450 нм. Типичная фоновая интенсивность (= негативной реакции) может быть 0,1 OD; типичная положительная реакция может давать 1 OD. Это означает, что отношение положительное/отрицательное может быть более чем 5-кратное, 10-кратное, 50-кратное и предпочтительно более чем 100-кратное. Как правило, определение специфичности связывания осуществляется при помощи не единственного референс-антигена, но набора от около трех до пяти неродственных антигенов, таких как молочный порошок, БСА, трансферрин и т.п.

"Связывающая способность" относится к силе сумме общих нековалентных взаимодействий между единственным связывающим участком молекулы и ее партнером по связыванию. Если не обозначено иначе, как использующаяся в настоящем изобретении, "связывающая способность" относится ко внутренней связывающей способности, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары по связыванию (например, антителом и антигеном). Константа диссоциации "K_D" обычно используется, чтобы описать сродство между молекулой (такой как антитело) и его партнером по связыванию (таким как антиген), то есть, как сильно лиганд связывается с конкретным белком. Аффинности лиганд-белок зависят от нековалентных межмолекулярных взаимодействий между этими двумя молекулами. Аффинность может быть измерена общепринятыми методиками, известными в данной области техники, включая описанные в настоящем изобретении. В одном варианте осуществления "K_D" или "значение K_D" в соответствии с настоящим изобретением измеряются при помощи анализа поверхностного плазменного резонанса с использованием прибора BiaCore T100 (GE Healthcare Biacore, Inc.) в соответствии с Примером 3. Вкратце, антитела иммобилизовывали на сенсорный чип СМ5 через непрямой реагент захвата, Fc античеловеческого IgG. Реактивы из "Human Antibody Capture Kit" (BR-1008-39, GE Healthcare Biacore, Inc.) использовались, как описано изготовителем.

Приблизительно 5000 резонансных единиц (RU) моноклональных мышиных античеловеческих антител IgG (Fc) были иммобилизованы на клетку. Анти-С4,4 антитела вводили для достижения уровня захвата приблизительно 200-600 RU. Различные концентрации человеческого или мышиного С4.4а вводили поверх иммобилизованных анти-С4.4а антител. Сенсограммы были генерированы после in-line коррекции сравнительной ячейки, с последующим вычитанием буфера образца. Константу равновесия диссоциации (K_D) вычисляли на основании отношения констант скоростей ассоциации (k_on) и диссоциации (k_off), полученных с помощью аппроксимации сенсограммы по первому порядку 1:1 модели связывания с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation Software. Другими подходящими устройствами являются BIACORE(R)-2000, BIACORE (R)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), или прибор ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Термин "антитело", как применяется в описании настоящего изобретения, описывает иммуноглобулиновые молекулы, предпочтительно состоящие из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, которые, как правило, связываются дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (сокращаемые в настоящем изобретении как VH) и константный домен тяжелой цепи. Константный домен тяжелой цепи может содержать, например, три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи (сокращаемый в настоящем изобретении как VL) и константный домен легкой цепи. Константный домен легкой цепи содержит один домен (CL). Домены VL и VH могут быть дополнительно подразделены на гипервариабельные участки, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), вкрапленные в области, которые являются более консервативными, называемые каркасными участками (FR). Каждый VH и VL, как правило, состоит из трех CDR и до четырех FR. расположенных от N-конца к С-концу, например, в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Как применяется в описании настоящего изобретения, термин «участки, определяющие комплементарность» (CDR; например, CDR1, CDR2