Полустабильное получение лентивирусных векторов

Полустабильное получение лентивирусных векторов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к получению лентивирусных векторов (LV) для генной терапии. Более конкретно, изобретение относится к полустабильным линиям пакующих лентивирусы клеток и способам получения линий пакующих клеток с использованием гибридного бакуло-аденоассоциированного вирусного (AAV) вектора для стабильной интеграции структурных и регуляторных лентивирусных белков.

Уровень техники

После самого первого клинического испытания LV фазы I против СПИДа в 2001 контролирующими органами были рассмотрены результаты 38 испытаний фазы I-II и два испытания фазы II-III, в которых использовали основанные на ВИЧ LV в качестве носителей для доставки генов; три из них еще находятся на рассмотрении. Наибольшее количество испытаний включает моногенные расстройства, некоторые из которых встречаются с высокой частотой, такие как анемия Кули или большая β-талассемия (4 испытания). Далее следуют злокачественные опухоли и инфекционные болезни, главным образом инфекция ВИЧ-1. Обычно количество пациентов, набираемых для испытаний, ограничено в фазе I/II, но не ограничено в фазе III. Таким образом существует неотложная необходимость в стабильных линиях пакующих клеток для 2-го (основанного на LTR) и 3-го (основанного на SIN) поколения LV, чтобы обеспечить неотложную потребность в крупномасштабном получении LV для испытаний фазы III, которые, как следует надеяться, могут быть осуществлены в будущем в большом количестве. Получение LV, основанное на временных протоколах, в действительности является непригодным для широкого применения с точки зрения безопасности, затрат и воспроизводимости.

Возрастающее количество доказательств свидетельствует о том, что LV, совсем недавно разработанные вирусные интегрирующиеся векторы для генной терапии, широко применимы для трансдукции либо окончательно дифференцированных, либо делящихся клеток, идеальны для поддержания долговременной экспрессии трансгена и более безопасны, чем предполагали вначале. Опыт, накопленный при использовании гамма-ретровирусных векторов (γ-RV) на основе вируса лейкоза мышей Молони (MoMLV) в последние два десятилетия, привел к быстрому прогрессу в создании LV-систем доставки, разработка которых началась в связи с необходимостью преодолеть неспособность ретровируса трансдуцировать неделящиеся клетки. В частности, создание самоинактивируемых (SIN) векторов для переноса делает более вероятными планы широкого применения LV в клинических испытаниях на человеке¹ при условии расширения и оптимизации такого эффективного способа производства. Однако в отличие от γRV, который может быть продуцирован несколькими коммерчески доступными линиями пакующих клеток человека и мыши, LV в настоящее время получают не только со степенью чистоты для исследований, но также со степенью чистоты, соответствующей стандарту GMP, почти исключительно в результате временной трансфекции. Такая методика является дорогостоящей, ее трудно стандартизовать и масштабировать и она требует многочисленных подтверждающих тестов в ходе выполнения. Кроме того, риск появления компетентных по репликации лентивирусов (RCL), вероятно возникающих в результате рекомбинации между вирусными последовательностями в пакующей конструкции и конструкции вектора для переноса, является редким, но более вероятным событием в ходе временной продукции, чем в ходе стабильной продукции.

Разработка стабильной линии пакующих клеток для LV, эквивалентной линии пакующих ретровирусы клеток, оказалась более медленной и более трудной, так как, в отличие от гамма-ретровируса, экспрессия лентивирусных белков, таких как env, протеаза и некоторые вспомогательные белки, является токсичной для клеток человека. Чтобы преодолеть такую проблему, вспомогательные гены, присутствующие в наиболее ранних вариантах пакующих клеток, затем в последних поколениях были удалены. Основанные на SIV- и ВИЧ линии пакующих LV клеток первого поколения получали из прикрепляющихся клеток либо Vero обезьян, либо COS, HeLa и 293 человека^2-5, сконструированных с использованием лентивирусных геномов, несущих несколько важных модификаций, таких как удаление сигнала упаковки. Ген gp120 env и большинство вспомогательных генов фактически сохранялись. Получаемый титр LV был очень низким^2-5 и, что более важно, возможное применение таких векторов неизбежно ограничено T-клетками CD4⁺ для способов направленной против СПИДа генной терапии. Позже gp120 env заменили гликопротеидом, полученным из вируса везикулярного стоматита (VSV-G), и все вспомогательные гены были удалены, поскольку, как было доказано, они являются необязательными для эффективной продукции LV. Чтобы предотвратить токсичность, также описанную для VSV-G, его экспрессию при определенных условиях индуцировали, используя множество различных систем, таких как Tet, экдизон, Rev и сочетание Tet и кумата⁶. Подобным образом, чтобы снизить токсический эффект вирусной протеазы во время клональной селекции, описана экспрессия гена gag-pol, обусловленная Tet и сочетанием лекарственных средств доксициклина и кумата⁶. Во всех таких системах гены gag-pol, rev и env были интегрированы посредством временной трансфекции плазмидной ДНК с последующим отбором с использованием лекарственных средств и клонированием клеток.

Одной важной проблемой при использовании действительно стабильной линии пакующих клеток является выбор наилучших носителей для доставки вирусных генов. Большинство исследователей интегрировали гены gag-pol, rev и env посредством временной трансфекции плазмидной ДНК с последующим отбором с использованием лекарственных средств и клонированием клеток^2-9. Известно, что такая методика страдает таким недостатком, что с течением времени возникает сайленсинг генов и утрата генов¹⁰, что также может ставить под угрозу долговременную стабильность пакующего клона.

Альтернативные носители для доставки генов раскрыты, в частности, в случае линии пакующих клеток STAR¹¹ и в случае недавно разработанной линии пакующих клеток GPRG-TL-20¹², в которых гены gag, pol и rev были интегрированы в клетки HEK293T с помощью MLV-челночных векторов. Две копии регистрируемого гена gag-pol были стабильно интегрированы в STAR, тогда как для GPRG-TL-20¹² подобная информация отсутствует. В отличие от STAR, где осуществляли трансфекцию гена env, в GPRG-TL-20 все сохраняемые вирусные гены были введены посредством SIN-MLV.

Существует несколько систем, которые обеспечивают стабильную интеграцию чужеродного генома в клетки-хозяева. Palombo с соавторами, 1998¹³, описывают гибридный бакуловирусный-AAV-вектор для специфичной интеграции в клетки-хозяева. Такой вектор, по-видимому, является очень эффективным, если он содержит ген rep в том же гибридном бакуловирусном-AVV-векторе. В указанной публикации нет упоминания о конструкции согласно настоящему изобретению, не говоря уже о предложении использовать систему такого вида для продуцирования LV.

На протяжении последних почти двух десятилетий было предпринято несколько попыток создания стабильных линий клеток, пакующих LV. Несмотря на различные раскрытые методики, на сегодняшний день не одна из таких линий пакующих клеток еще не используется в клинических испытаниях и не вышла на рынок. Поэтому существует необходимость в новых системах для крупномасштабного получения LV, которые являются эффективными с точки зрения производительности и являются безопасными, рентабельными и воспроизводимыми.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к области получения LV. Проходит несколько клинических испытаний генной терапии с использованием LV в качестве носителей для доставки генов. Во всех таких испытаниях получение LV еще основано на временных протоколах.

Настоящее изобретение относится к новой методике создания основанной на ВИЧ-1 линии пакующих клеток. Такая методика основана на применении гибридного вектора, содержащего бакуловирусный остов, включающий в себя кассету интеграции, фланкированную инвертированными концевыми повторами AAV (ITR), так называемой гибридной системы бакуло-AAV, в сочетании с плазмидой, кодирующей белок rep. Такая система позволяет получать стабильную интеграцию структурных и регуляторных белков ВИЧ-1 gag/pol и rev. Система согласно настоящему изобретению включает в себя: a) гибридный вектор бакуло-AAV, отличающийся тем, что он содержит две кассеты экспрессии, одна из которых кодирует лентивирусные гены gag и pol, а другая кодирует лентивирусный rev и маркер селекции, и b) плазмиду, кодирующую белок rep. Предложенная система представляет собой новый и обладающий преимуществами путь доставки структурных и регуляторных белков ВИЧ, чтобы стабильно и эффективно сконструировать клетки-хозяева со структурными лентивирусными белками. Используя такую систему, получили первый промежуточный продукт, содержащий только структурные и регуляторные белки ВИЧ gag/pol и rev, применимый для получения полустабильной продукции LV или в качестве исходной точки для получения линий пакующих клеток 2-го и 3-го поколения, необязательно содержащих регуляторный белок (Tat) и представляющий интерес белок оболочки, а также линий клеток-продуцентов, также содержащих вектор для переноса.

Первый промежуточный продукт несет две копии рекомбинантной пакующейся конструкции бакуло-AAV, экспрессирующей гены ВИЧ-1 gag-pol и rev в трехцистронной конфигурации. Такой промежуточный продукт был назван PK-7 и упоминается как PK-7 в примерах. Геномной интеграции пакующегося вектора бакуло-AAV способствовала временная экспрессия белка AAV rep78, который, как известно, необходим для ITR-опосредованной интеграции вектора AAV¹⁴. Показано, что такой первый промежуточный продукт обладает неожиданной генетической стабильностью в течение 1 года культивирования, что свидетельствует о непрерывной продукции функционального LV после временной трансфекции оставшихся генетических элементов. Кроме того, в таких клетках не наблюдали явления сайленсинга. Кроме того, благодаря точному картированию сайта интеграции двух тандемно интегрированных пакующих векторов AAV в некодирующей межгенной транскрипционно активной области авторы получили аргумент в пользу безопасности и против возможной активации опасных генов, мРНК которых может быть включена в LV и в конечном итоге в клетки-хозяева, являющиеся мишенями.

Разработанная пакующая система на основе применения гибридного вектора бакуло-AAV для стабильной экспрессии лентивирусных gag-pol и rev была названа «MolPack». Система экспрессии, используемая в настоящем изобретении, успешно обеспечивает возможность стабильного и безопасного введения структурных (gag/pol) и регуляторных (rev) белков ВИЧ с использованием только одного раунда трансфекции и клонирования. Получение LV, в настоящее время используемых в клинических испытаниях, все еще основано на временной трансфекции всех требуемых белков. Напротив, промежуточный продукт, полученный с использованием системы экспрессии согласно настоящему изобретению, является стабильным без проявления явления сайленсинга, позволяет получать полустабильную продукцию LV, обеспечивая при этом большие преимущества с экономической точки зрения. Действительно, полустабильная продукция требует меньшего количества трансфицируемых конструкций для получения конечного продукта. Кроме того, также неожиданно было обнаружено, что при использовании полустабильной продукции согласно настоящему изобретению только одна треть количества ДНК, используемой для продуцирования в случае временной трансфекции, достаточна для получения LV, имеющих титр, сравнимый с титром временно продуцируемых LV. Кроме того, использование меньшего количества трансфицируемых конструкций уменьшает вероятность событий рекомбинации с образованием RCL, тем самым делая получение лентивирусных частиц более безопасным. Таким образом, система экспрессии, полустабильная линия пакующих клеток и способ получения согласно настоящему изобретению имеют большие преимущества по сравнению со средствами и способами, применяемыми в настоящее время в клинических испытаниях.

Основные положения изобретения

Согласно первому аспекту изобретения предлагается система для стабильной экспрессии лентивирусных структурных и регуляторных белков, состоящая из:

i) гибридного вектора, содержащего бакуловирусный остов, который содержит кассету интеграции, фланкированную ITR AAV, включающую в себя две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер, и

ii) экспрессирующей плазмиды, содержащей открытую рамку считывания (ORF) rep AAV под контролем промотора.

Предпочтительно две кассеты экспрессии гибридного вектора находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета управляется конститутивным промотором и поли-A, предпочтительно промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α SFFV и RSV, более предпочтительно промотором является промотор CMV IE.

Предпочтительно селектируемый маркер выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину, зеомицину, более предпочтительно селектируемым маркером является ген резистентности к гигромицину.

Более предпочтительно селектируемый маркер клонируют ниже участка внутренней посадки рибосомы (IRES).

Согласно другому аспекту изобретения предлагается полустабильная линия пакующих лентивирусы клеток, состоящая из клеток, стабильно экспрессирующих лентивирусные gag pol и rev, отличающаяся тем, что такие клетки содержат стабильно интегрированную в их геном, по меньшей мере, одну копию кассеты интеграции, фланкированную ITR AAV, включающую в себя две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер.

Предпочтительно клеткой является линия клеток человека, предпочтительно выбранная из HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 или HeLa, более предпочтительно линией клеток является HEK293-T.

Предпочтительно две кассеты экспрессии находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета управляется конститутивным промотором и поли-A; предпочтительно промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV, более предпочтительно конститутивным промотором является промотор CMV IE.

Предпочтительно селектируемый маркер выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину, зеомицину; более предпочтительно селектируемым маркером является ген резистентности к гигромицину. Более предпочтительно селектируемый маркер клонируют ниже IRES.

Предпочтительно белок rep AAV выбран из rep78 или rep68. Более предпочтительно белком rep является rep78.

Согласно другому аспекту предлагается способ получения лентивирусных векторов, включающий в себя:

i) культивирование полустабильной линии пакующих лентивирусы клеток, состоящей из клеток, стабильно экспрессирующих лентивирусные gag, pol и rev, отличающихся тем, что такие клетки содержат стабильно интегрированную в их геном, по меньшей мере, одну копию кассеты интеграции, фланкированной ITR AAV, содержащей две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер;

ii) встраивание в полустабильную линию пакующих клеток гена env;

iii) встраивание в полустабильную линию пакующих клеток вектора переноса.

Предпочтительно две кассеты экспрессии находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A; предпочтительно промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV, более предпочтительно конститутивным промотором является промотор CMV IE.

Предпочтительно селектируемый маркер выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину, зеомицину; более предпочтительно селектируемым маркером является ген резистентности к гигромицину. Более предпочтительно селектируемый маркер клонируют ниже IRES.

Белок оболочки может быть встроен в клетки-хозяева с использованием вектора AAV, ретровирусного вектора, стабильной интеграции плазмиды или гомологичной рекомбинации. Предпочтительно ген env встраивают посредством временной трансфекции с использованием плазмиды.

Предпочтительно ген env выбран из env VSV-G, env MLV 4070, env D114, химерного белка оболочки RD114-TR, химерного белка оболочки RD114pro, бакуловирусного env GP64, или env GALV, или их производных, более предпочтительно геном env является ген, кодирующий RD114-TR.

Предпочтительно вектор для переноса встраивают с лентивирусным SIN-вектором.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Подробное описание предпочтительных признаков и вариантов осуществления изобретения будет приведено с использованием неограничивающих примеров.

Изобретение может быть применено на практике специалистом в данной области, который будет использовать, если не указано иное, обычные методики химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии. Все указанные методики раскрыты и подробно описаны в общедоступной литературе. Смотри, например, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); Current Protocols in Immunology, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press and D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Все указанные публикации включены в виде ссылки.

Гибридная бакуло-AAV-система

Настоящее изобретение относится к новой методике создания, основанной на ВИЧ-1 линии пакующих клеток. Оптимизация системы продуцирования LV является одной из важнейших проблем, которую необходимо решить для разработки генной терапии на основе LV-методики. Несмотря на растущее количество клинических испытаний, в которых используют такую методику, LV в таких испытаниях все еще получают, используя протоколы временной трансфекции. Таким образом, получение LV все еще является очень дорогостоящим и неподходящим для большего количества пациентов. По этой причине было предпринято множество попыток разработать стабильные линии пакующих клеток для LV. Одной из важных проблем при разработке стабильной линии пакующих лентивирусы клеток является выбор правильного носителя для конструирования клеток-хозяев. Во многих случаях клетки-хозяева конструировали, используя плазмиды, но в таких случаях также наблюдали нестабильность генома и явление сайленсинга генов. В двух других случаях использовали ретровирусные векторы, чтобы стабильно интегрировать гены gag/pol и rev. Не одну из разработанных до настоящего времени стабильных линий пакующих клеток не использовали в клинике.

Методика согласно настоящему изобретению основана на использовании системы стабильной экспрессии лентивирусных структурных и регуляторных белков ВИЧ, состоящей из гибридного вектора, содержащего бакуловирусный остов, который содержит кассету интеграции, фланкированную ITR AAV, включающую в себя две кассеты экспрессии, при этом первая кассета экспрессии кодирует лентивирусные гены gag и pol, а вторая кассета экспрессии кодирует лентивирусный rev и селектируемый маркер вместе с экспрессирующей плазмидой, содержащей ORF rep AAV под контролем промотора. Присутствие бакуловирусного остова позволяет хозяину принимать большую и сложную кассету интеграции, содержащую две кассеты экспрессии, кодирующие несколько разных белков. Полученный пакующий вектор бакуло-AAV позволяет конструировать клетки-хозяева с вирусными белками, которые необходимы для стабильной и эффективной продукции LV посредством только одного события инфекции.

Геномную интеграцию пакующего вектора бакуло-AAV получали в результате временной экспрессии белка rep AAV. Такая система позволила осуществлять интеграцию векторов AAV в некодирующую межгенную транскрипционно активную область, тем самым исключая активацию опасных генов, мРНК которых может быть включена в LV и в конечном итоге в клетки-хозяева, являющиеся мишенями.

Предложенная система представляет собой новый и обладающий преимуществами путь стабильного и эффективного конструирования клетки-хозяина со структурными и регуляторными лентивирусными белками.

В предпочтительном варианте две кассеты экспрессии, включенные в пакующую конструкцию бакуло-AAV, находятся в ориентации хвост-к-хвосту и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A, предпочтительно промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV, более предпочтительно промотором является промотор CMV IE. Согласно предпочтительному аспекту изобретения селектируемый маркер, включенный в пакующий AAV-вектор, выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину, зеомицину; предпочтительно маркером является ген резистентности к гигромицину; более предпочтительно селектируемый маркер клонирован ниже IRES.

Геномную интеграцию пакующего вектора бакуло-AAV получали в результате временной экспрессии белка rep AAV для ITR-опосредованной интеграции AAV-вектора. В предпочтительном варианте белок rep выбран из rep78 и rep68, более предпочтительно белком является rep78.

С использованием указанной системы можно получать клетки, сконструированные для стабильной экспрессии белков ВИЧ-1 gag/pol и rev, такие клетки названы полустабильной линией пакующих клеток. В частности, в настоящем изобретении раскрыты и заявлены такие сконструированные клетки и их применение для полустабильной продукции LV.

Полустабильная линия пакующих клеток

Полустабильная линия пакующих клеток согласно настоящему изобретению состоит из клеток-хозяев, несущих, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной пакующей конструкции бакуло-AAV, экспрессирующей гены ВИЧ-1 gag-pol и rev. Геномную интеграцию пакующего вектора бакуло-AAV получили в результате временной экспрессии белка rep AAV, чтобы получить ITR-опосредованную интеграцию AAV-вектора. Предпочтительно две кассеты экспрессии находятся в ориентации хвост-к-хвосту, и каждая кассета экспрессии управляется конститутивным промотором и поли-A, предпочтительно промотор выбран из CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV и RSV. Более предпочтительно конститутивным промотором является промотор CMV IE.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения селектируемый маркер выбран из гена резистентности к гигромицину, канамицину, неомицину, зеомицину; предпочтительно селектируемым маркером является ген резистентности к гигромицину, более предпочтительно селектируемый маркер клонируют ниже IRES.

Предпочтительно белок rep AAV выбран из rep78 и rep68. Более предпочтительно белком rep является rep78. Линии клеток-хозяев, которые могут быть сконструированы для получения полустабильной линии пакующих клеток, представляют собой линии клеток, выбранные из HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 или HeLa, более предпочтительно линией клеток является HEK293-T.

Такая полустабильная линия пакующих клеток подходит для получения большого разнообразия LV с разными env и разными векторами для переноса в полустабильной системе продуцирования. Поэтому она дает большое преимущество с точки зрения более эффективной продукции LV, так как позволяет снизить затраты, она не требует использования плазмидной ДНК со степенью чистоты, соответствующей стандарту GMP, кодирующей gag-pol и rev, и при этом снижен риск образования RCL на фоне событий рекомбинации между плазмидами в ходе временной трансфекции. Полустабильная линия пакующих клеток является универсальным средством, которое является безопасным и экономически более выгодным, чем другие средства, используемые в настоящее время в клинических испытаниях для получения LV.

Показано, что полустабильная линия пакующих клеток согласно настоящему изобретению обладает неожиданной генетической стабильностью в течение 1 года культивирования, что свидетельствует о непрерывной продукции функционального LV после временной трансфекции оставшихся генетических элементов. Кроме того, по сути не наблюдается явление сайленсинга и титр и инфекционность LV, получаемых с использованием такого промежуточного продукта, сохраняются неизменными спустя 1 год. Такие данные были подтверждены как в присутствии, так и в отсутствие давления отбора. Следует отметить, что сопоставимые данные в отношении стабильности интеграции кассеты, опосредованной ITR AAV, в литературе отсутствуют. Единственная соответствующая информация относится к тому, что полученная из костного мозга человека линия подобных фибробластам клеток (клетки Раддла Детройт 6), инфицированных AAV дикого типа серотипа 2 (AVV-2), сохраняла вирусные последовательности в латентном состоянии в течение, по меньшей мере, 47 и 118 пассажей. Как показано в примерах, полустабильная линия пакующих клеток согласно настоящему изобретению сохранялась в течение, по меньшей мере, 102 пассажей.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения LV, включающему в себя:

i) культивирование полустабильной линии пакующих клеток, которая описана выше;

ii) встраивание в полустабильную линию пакующих клеток гена env;

iii) встраивание в полустабильную линию пакующих клеток вектора переноса.

Белок оболочки может быть встроен в клетки-хозяева с использованием вектора AAV, ретровирусного вектора, стабильной интеграции плазмиды или гомологичной рекомбинации. Предпочтительно ген env встраивают посредством временной трансфекции с использованием плазмиды.

Предпочтительно ген env выбран из env VSV-G, env MLV 4070, env D114, химерного белка оболочки RD114-TR, химерного белка оболочки RD114pro, бакуловирусного env GP64 или env GALV или их производных. Более предпочтительно в настоящем изобретении используют химерный белок оболочки RD114-TR env, в котором цитоплазматический хвост RD114 был заменен цитоплазматическим хвостом оболочки MLV. Предпочтительно вектор переноса встраивают с SIN-LV.

Полустабильная линия пакующих клеток согласно настоящему изобретению способна продуцировать LV, которые в отношении инфекционности «качественно» равны LV, продуцируемым при временной трансфекции. Очень важная проблема, которую необходимо учитывать в случае применения полустабильной продукции LV, заключается в том, что полустабильная линия пакующих клеток не утрачивала способность легко подвергаться трансфекции. Действительно, клетки PK-7 подвергались трансфекции на том же уровне, что и родительская линия клеток HEK293T. Указанный признак довольно часто утрачивается после генетической модификации и клонирования клеток HEK293 с пакующей конструкцией. Напротив, система экспрессии, используемая в настоящем изобретении для стабильной интеграции gag/pol и rev, не создает никаких проблем в отношении способности к трансфекции полустабильной линии пакующих клеток.

Кроме того, полустабильная линия пакующих клеток и ее применение в способе получения LV имеют важные преимущества в отношении затрат на получение. В частности, только три дополнительных конструкции, например плазмиды (каждая из которых кодирует tat, env и вектор переноса), необходимы для получения LV 2-го поколения или две конструкции (кодирующих env и вектор переноса) для получения LV 3-го поколения. Напротив, способы GMP, используемые в настоящее время в клинических испытаниях, требуют использования двух дополнительных конструкций, кодирующих gag/pol и rev соответственно, в дополнение к конструкциям, используемым в случае полустабильной линии пакующих клеток согласно настоящему изобретению.

Кроме того, уменьшенное количество конструкций, трансфицируемых способами и средствами согласно настоящему изобретению, также обеспечивает дополнительное преимущество в отношении безопасности LV, как описано выше.

Кроме того, также примечательно, что было обнаружено, что в случае применения полустабильного получения согласно настоящему изобретению только одна треть общего количества ДНК, используемой для продуцирования при временной трансфекции, достаточна для получения лентивирусов, имеющих титр, сравнимый с титром временно продуцируемых лентивирусов. Таким образом, система экспрессии, полустабильная линия пакующих клеток и способ получения согласно настоящему изобретению обеспечивают большие преимущества по сравнению со средствами и способами, применяемыми в настоящее время в клинике.

Описание фигур

Фигура 1. Схемы разработки RD-MolPack. (a) Схематичное представление ДНК-плазмид, используемых в данном исследовании. pPolh, промотор полиэдрина; attB1, присоединение B1; ITR, инвертированный концевой повтор; CMV, промотор цитомегаловируса; In, интрон; RRE, элемент ответа на rev; A, поли-A-последовательность; IRES, участок внутренней посадки рибосомы; SD, донор сплайсинга; SA, акцептор сплайсинга; ψ, сигнал упаковки; WPRE, элемент посттраскрипционной регуляции вируса гепатита сурков; cPPT, центральный полипуриновый тракт; hPGK, промотор фосфоглицераткиназы человека; (b) Графическое изображение Rep78-опосредованной геномной интеграции вектора AAV-GPR. Rep 78 AAV стимулирует эксцизию ITR-фланкированной кассеты AAV-GPR и способствует ее интеграции в хромосомы человека; (c) Схема продуцирования полустабильной линией пакующих клеток. GOI, представляющий интерес ген.

Фигура 2. Характеристика клонов PK. (a) Саузерн-блот-анализ интеграции вектора AAV-GPR. Чтобы установить количество копий и целостность кассеты, геномную ДНК (10 мкг), полученную из клонов PK, расщепляли двумя разными ферментами рестрикции, BamHI и SnaBI соответственно; (b) Вестерн-блот-анализ вирусных белков, продуцируемых с кассеты GPR. Левая панель, клеточные экстракты (50 мкг/дорожку), полученные из клонов PK, гибридизовали с антисывороткой человека против ВИЧ, узнающей белки ВИЧ-1. Затем мембрану гибридизовали со специфичными анти-rev-Ат. Правая панель, 30 нг p24gag-эквивалента вирусоподобных частиц (VLP), полученных из клонов PK, обрабатывали идентично обработке клеточных экстрактов; (c) Схематичное картирование интеграции GPR-кассеты способом ОЛ-ПЦР (опосредованной лигированием ПЦР), которое выявляет точку разрыва ДНК в длинном плече хромосомы 2 в положении 2q32.1. (d) Совместная локализация кассеты AAV-GPR и гена Hox4 человека в хромосоме 2. Гибридизацию in situ метафазных хромосом PK-7 осуществляли, используя gag-специфичный (красный) и Hox4-специфичный (зеленый) зонды соответственно, (e) Схематичное представление перестройки двух интегрированных кассет GPR в клоне PK-7 и их ориентация хвост-к-хвосту.

Фигура 3. Контрольные эксперименты в отношении возможной интеграции бакуло-AAV-GPR и Rep78. (a) Саузерн-блот-анализ рекомбинантной ДНК бакуловирус-AAV. ДНК экстрагировали из бакуловирусных частиц, расщепляли в течение ночи ферментом рестрикции MluI и после кипячения исследовали, используя специфичный для кассеты GPR зонд длиной 11 т.п.н. Пустую плазмиду GPR (1 пг) и бакуловирусную пустую ДНК (100 нг) загружали в качестве позитивного и негативного контроля соответственно; (b) Выявление предполагаемой интеграции остаточной плазмидной ДНК rep78 в клетки PK-7 клетки. Rep78-специфичную ПЦР осуществляли, используя геномную ДНК PK-7 в качестве матрицы образца и плазмиду CMV-rep78 (1 пг) в качестве позитивного контроля.

Примеры

Пример I: Общие способы

Плазмиды

Гены ВИЧ-1 дикого типа gag, pol и rev вырезали при расщеплении MluI/NarI и MluI/NotI из плазмид pCG719-pKLgagpol (далее называемой CMV-GPR для простоты) (фигура 1a, схема 9) и pCG720-pKrev (CMV-Rev) (фигура 1a, схема 5) соответственно²⁵. Вирусные гены встраивали в челночный вектор Gateway® pENTR™4 (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) в двух отдельных кассетах экспрессии, расположенных в ориентации хвост-к-хвосту, при этом каждая кассета управляется промотором CMV IE и несет поли-A-последовательность. Первая кассета экспрессирует гены gag и pol, тогда как вторая кассета экспрессирует ген rev и селектируемый маркерный ген резистентности к гигромицину (hygro); hygro клонировали ниже IRES, чтобы обеспечить возможность бицистронной трансляции. Две единицы экспрессии вводили в сайт XbaI рекомбинантной плазмиды pSUB201, несущей инфекционный геном AAV¹⁷. Затем полученную кассету 5'ITR-CMV-gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-rev-CMV-ITR3' вырезали и встраивали в челночный вектор Gateway® pENTR™4 (Invitrogen, Co., Carlsbad, CA). Рекомбинантный гибридный пакующий вектор бакуло-AAV (бакуло-AAV-GPR) (фигура 1a, схема 1) получали с помощью сайт-специфичной системы рекомбинации бактериофага лямбда между исходным челночным вектором pENTR^TM4, содержащим две кассеты, и линейной ДНК BaculoDirect (системы бакуловирусной экспрессии BaculoDirect^TM, Invitrogen, Co.). При этом в ходе гомологичной рекомбинации ген полиэдрина бакуловирусной ДНК заменяли двойной кассетой GPR. Экспрессирующую плазмиду pABCMV-rep78 (CMV-AAV-rep78) получали клонированием ORF AAV-rep78 под контролем промотора CMV IE экспрессирующего вектора pABS.43, как описано Recchia с соавторами, 2004¹⁸ (фигура 1a, схема 4). Плазмида pMD.G (CMV-VSV-G)¹⁹ кодирует гликопротеид оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G) (фигура 1a, схема 6). Вектор переноса 3-го поколения pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp (SIN-eGFP)²⁰ экспрессирует ген eGFP под контролем конститутивного промотора hPGK (фигура 1a, схема 2). Вектор переноса PΔN-Chim3 2-го поколения, экспрессирующий трансген Chim3 против ВИЧ-1, описан Porcellini с соавторами, 2009 и 2010^21,22 (фигура 1a, схема 3). Плазмида pCMV-RD114-TR (CMV-RD114-TR) (фигура 1a, схема 7) кодирует химерный белок оболочки RD114-TR, образованный из внеклеточного и трансмембранного доменов белка RD114 оболочки эндогенного ретровируса кошачьих и цитоплазматического хвоста (TR) A-MLVenv 4070A²³. Пакующая конструкция pCMV-ΔR8.74 (CMV-GPRT) 2-го поколения (фигура 1a, схема 8) кодирует гены gag, pol, rev и tat ВИЧ-1¹⁹.

Клетки

Клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9) (Invitrogen, Co.) выращивали в суспензии в среде TC-100 (Invitrogen, Co.) с добавлением 10% FCS (EuroClone Ltd., UK) и в сочетания пенициллина-стрептомицина и глутамина (PSG) при 27°C в отсутствие CO₂. Клетки эмбриональной почки человека 293T (HEK293T) и производный от них клон (PK-7) размножали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% FCS и PSG. T-лимфобластоидные клетки CEM A3.01 и SupT1 выращивали в RPMI 1640 с добавлением 10% FCS и PSG. Гемопоэтические стволовые клетки (HSC) CD34⁺ и неонатальные лейкоциты очищали из пуповинной крови (UCB) центрифугированием в градиенте плотности фикола-гипака (Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway). После разделения в градиенте HSC CD34⁺ выделяли из собранного кольца мононуклеарных клеток UCB в результате позитивной селекции с использованием набора микрошариков CD34 и колонок для сепаратора MiniMACS (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA). Чистоту клеток CD34⁺ (>92%) устанавливали в анализе FACS (FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA) и с помощью компьютерной программы FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR), используя анти-CD34-PE-Ат (BD Pharmingen^TM, San Diego, CA). Клетки CD34⁺ предварительно стимулировали в течение 24 часов в среде Дульбекко, модифицированной по способу Искова (IMDM), с 20% сыворотки, содержащей фактор стволовых клеток человека (h-SCF) 100 нг/мл (R&D Systems, Minneapolis, MN), h-Flt3L 100 нг/мл (Peprotech, Rocky Hill, NJ), h-IL-6 20 нг/мл (R&D Systems) и тромбопоэтин человека (h-Tpo) 20 нг/мл (Peprotech), и поддерживали в такой среде во время трансдукции. Неонатальные лейкоциты стимулировали в течение 48 часов растворимым антителом против CD3 человека (30 нг/мл) (Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK) и рекомбинантным IL-2 человека (rhIL-2) 50 единиц/мл (Chiron, Emeryville, CA) в RPMI и затем хранили в RPMI с добавлением 10% FCS, PSG и rhIL-2.

Получение бакловирусов и инфекция бакуло-GPR клеток HEK293T

Бакуловирус, несущий рекомбинантный гибридный ДНК-геном бакуло-AAV-GPR, получали, следуя способу BaculoDirect, с использованием адаптированной для бакуловирусной ДНК системы Gateway® (Invitrogen, Co.). Титр рекомбинантного бакуловируса оценивали в анализе бляшек, и титр соответствовал 1×10¹¹ БОЕ/мл после трех пассажей для амплификации вирусов в клетках Sf9. Клон PK-7 получали трансфекцией 1,5×10⁶ клеток HEK293T с использованием 4 мкг экспрессирующей плазмиды AAV-rep78 и через 24 часа инфицировали рекомбинантным бакуло-AAV-GPR при MOI 1000. Клетки поддерживали без гигромицина в течение 4 дней и затем высевали 5×10⁵ клеток на 22 чашки диаметром 10 см в присутствии гигромицина (100 мкг/мл) в серийно разведенных концентрациях. 22 чашки подвергали скринингу в ELISA в отношении продуцирования p24gag. Только в одной чашке, в которой высевали 3,7×10⁴ клеток/чашку, высвобождалось достаточное количество p24gag в надосадок. Чашка содержала 40 колоний, которые все собирали и подвергали скринингу. Три из них, которые были оценены позитивно в отношении продукции p