Способ амплифицирования локусов в бактериальной клетке

Способ амплифицирования локусов в бактериальной клетке

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки U.S. 61/040456, поданной 28 марта 2008 г.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение предоставляет способы для амплифицирования генного локуса без применения антибиотиков. В частности, изобретение относится к способу амплифицирования in vivo последовательностей ДНК, кодирующих полипептид, представляющий интерес, к клетке, несущей множественные копии указанной амплифицированной ДНК последовательности, и вектору, несущему ДНК конструкт, который применяется в этом способе. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу продуцирования белка, представляющего интерес, например фермента, путем культивирования клеток, как описано выше.

Уровень техники

Экспрессионная и рекомбинантная продукция экзогенных полипептидов является широко используемой методикой. Хорошо известно, что клетки могут быть трансформированы нуклеиновыми кислотами, кодирующими экзогенные полипептиды, представляющие интерес, для экспрессии и продуцирования больших количеств желаемых полипептидов. В некоторых вариантах применения, способы используются для получения очень больших количеств полипептидов по сравнению с тем, что могло бы быть продуцировано естественным путем в первоначальном организме. Действительно, экспрессия экзогенных последовательностей нуклеиновых кислот, также как и сверхэкспрессия эндогенных последовательностей, широко используется в современной биотехнологии.

Несмотря на прогресс в молекулярной биологии и белковой инженерии, остается необходимость в новых способах и композициях, которые увеличивают уровень экспресии полипептидов в клетках-хозяевах.

Сущность изобретения

Здесь представлен способ амплифицирования геномного локуса. В определенных вариантах осуществления, способ может включать: а) приведение популяции бактериальных клеток-хозяев с ингибитором необходимого фермента, где бактериальные клетки-хозяева содержат геномный локус со структурой A₁-P-M-A₂, где А₁ и А₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит кодирующую последовательность для необходимого фермента; и б) отбор клеток, которые являются устойчивыми к действию ингибитора; где клетки, которые являются устойчивыми к действию ингибитора, имеют множественные копии амплификационной единицы. Бактериальная клетка-хозяин может быть клеткой Bacillus sp., хотя и другие бактериальные штаммы, например, Streptomyces sp., предусмотрены. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, представляющий интерес, представляет собой субтилизин, например, субтилизин с последовательностью SEQ ID NO: 8, или его зрелой формой, представленной в SEQ ID NO: 12. В определенных случаях, способ избегает использования антибиотических маркеров и антибиотиков и предоставляет альтернативу системам амплификации, основанным на антибиотиках. В определенных вариантах осуществления, необходимый фермент представляет собой аминокислотную последовательность фермента, например фермента дикого типа, который является эндогенным для клетки. В отдельных вариантах осуществления, бактериальная клетка-хозяин, используемая в способе, может содержать или не содержать инактивированный эндогенный ген, кодирующий необходимый фермент, где инактивированный ген может быть в отличном геномном локусе от геномного локуса со структурой: A₁-P-M-A₂. В определенных случаях, необходимый фермент может быть аланинрацемазой, например, SEQ ID NO: 11, и ингибитор может быть β-хлоро-D-аланин или циклосерин, хотя могут быть использованы и другие комбинации фермент/ингибитор. В некоторых вариантах осуществления, амплификационная единица включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:7.

Амплификационная единица обеспечивает экспрессию необходимого фермента, кодируемого областью М. В определенных вариантах осуществления М может включать кодирующую последовательность для необходимого фермента и промотер, функционально связанный с кодирующей последовательностью, где промотер является нативным для кодирующей области необходимого фермента. В определенных вариантах осуществления, кодирующая последовательность и промотер могут быть эндогенными для клетки-хозяина. Амплификационная единица может также обеспечивать экспрессию белка, представляющего интерес, кодируемого областью Р. В определенных вариантах осуществления, кодирующая последовательность Р может быть функционально связана с эндогенным или не-эндогенным промотером, который представлен в прилегающем прямом повторе (А₁). В других вариантах осуществления, промотер для Р может быть не представлен в прилегающем прямом повторе. Скорее, промотер может быть представлен в области Р.

В некоторых вариантах осуществления, изобретение предоставляет бактериальную клетку-хозяина, содержащую геномный локус, включающий амплификационную единицу со структурой: A₁-P-M-A₂, где А₁ и А₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит также предоставленную кодирующую последовательность для необходимого фермента. В этом варианте осуществления, амплификационная единица обеспечивает значительную экспрессию необходимого фермента. Бактериальная клетка-хозяин может быть клеткой Bacillus sp., хотя и другие бактериальные штаммы, например, Streptomyces sp., предусмотрены. В некоторых вариантах осуществления, полипептид, представляющий интерес, представляет собой субтилизином, например, субтилизин с последовательностью SEQ ID NO: 8, или его зрелой формой, представленной в SEQ ID NO: 12. В определенных случаях, способ избегает использования антибиотических маркеров и антибиотиков и предоставляет альтернативу системам амплификации, основанным на антибиотиках. В определенных вариантах осуществления, необходимый фермент представляет собой аминокислотную последовательность фермента, например, фермента дикого типа, который является эндогенным для клетки. В отдельных вариантах осуществления, бактериальная клетка-хозяин, используемая в способе, может содержать или не содержать инактивированный эндогенный ген, кодирующий необходимый фермент, где инактивированный ген может быть в отличном геномном локусе от геномного локуса со структурой: A₁-P-M-A₂. В определенных случаях, необходимый фермент может быть аланинрацемазой, например, SEQ ID NO: 11, и ингибитором может быть β-хлоро-D-аланин или циклосерин, хотя могут быть использованы и другие комбинации фермент/ингибитор. В некоторых вариантах осуществления, амплификационная единица включает последовательность, представленную в SEQ ID NO:7.

В других вариантах осуществления, бактериальная клетка-хозяин по изобретению содержит геномный локус, включающий множественные копии амплификационной единицы со структурой: A₁-P-M-A_2, где A₁ и A₂ являются прямыми повторами, Р содержит первую кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит вторую кодирующую последовательность, кодирующую последовательность для необходимого фермента. В некоторых вариантах осуществления, амплификационная единица включает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7. В некоторых вариантах осуществления, первая кодирующая последовательность функционально связана с промотером, который представлен в прямом повторе A₁. В определенных вариантах осуществления, бактериальная клетка-хозяин содержит геномный локус, включающий множественные копии амплификационной единицы, описываемой формулой: (A₁-P-M)_n-A_2, где n равно по крайней мере 2, A₁ и A₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М кодирует необходимый фермент, где кодирующая последовательность М функционально связана в эндогенным или не-эндогенным промотером. В одном варианте осуществления, кодирующая последовательность М и промотер могут быть эндогенными для клеток-хозяев. В других вариантах осуществления, бактериальные клетки-хозяева содержат геномный локус, включающий множественные копии, например, по крайней мере 2 копии, амплификационной единицы с последовательностью SEQ ID NO:7. Амплификационная единица обеспечивает экспрессию как белка, представляющего интерес, например, субтилизина, так и необходимого фермента. В некоторых вариантах осуществления, экспрессируемый полипептид, представляющий интерес, представляет собой субтилизин FNA, представленный в SEQ ID NO: 8, или его зрелой формой, представленной в SEQ ID NO: 12, и необходимый фермент представляет собой аланин-рацемазу, представленной в SEQ ID NO: 11. В определенных вариантах осуществления, промотер, функционально связанный с кодирующей последовательностью Р, может быть частью прилегающего прямого повтора (A₁). В другом варианте осуществления, промотер, функционально связаный с кодирующей последовательностью области Р, находится в области Р, а не в прилегающем прямом повторе.

В другом варианте осуществления, изобретение охватывает культуру бактериальных клеток, которая содержит среду для выращивания и популяцию бактериальных клеток-хозяев, содержащих по крайней мере один, по крайней мере две или более копий амплификационной единицы со структурой A₁-P-M-A_2, где A₁ и A₂ являются прямыми повторами, Р содержит первую кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит вторую кодирующую последовательность для необходимого фермента. Как описано выше, амплификационная единица обеспечивает экспрессию как белка, представляющего интерес, например, субтилизина, так и необходимого фермента. В некоторых вариантах осуществления, экспрессируемый полипептид, представляющий интерес, представляет собой субтилизин FNA, представленный в SEQ ID NO: 8, или его зрелой формой, представленной в SEQ ID NO: 12, и необходимый фермент представляет собой аланин рацемазу, представленную в SEQ ID NO: 11. В еще одном варианте осуществления, культура бактериальной клетки может быть использована в способе продуцирования белка, который включает: содержание культуры соответствующих клеток при условиях, подходящих для продуцирования белка, представляющего интерес, кодируемого кодирующей последовательностью. В определенных вариантах осуществления, этот способ может дополнительно включать выделение белка, представляющего интерес, из культуральной среды.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 схематически иллюстрирует некоторые особенности вариантов осуществления, описанных здесь.

Фиг. 2 представляет карту плазмиды pBSFNAalr (SEQ ID NO:2).

Фиг. 3 показывает кПЦР калибровочную кривую.

Фиг. 4 является графиком, показывающим уровень экспрессии субтилизина FNA в различных штаммах-хозяевах.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Если здесь не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то значение, которое обычно понятно обычному специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным здесь могут быть применены на практике или при тестировании настоящего изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы.

Все патенты или публикации, включая все последовательности, раскрытые в таких патентах или публикациях, упоминаемые здесь, являются однозначно включенными посредством ссылки.

Области числовых значений включают числовые значения, определяющие область. Если не указано иначе, нуклеиновые кислоты написаны слева направо в 5'-3' ориентации; аминокислотные последовательности написаны слева направо в ориентации от амина к карбоксилу, соответственно.

Заголовки, представленные здесь, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления изобретения. Соответственно, термины, определенные сразу ниже, являются более полно определенными в ссылках ко всей спецификации.

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2d ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) предоставляют специалисту общие значения множества терминов, использованных здесь. Хотя определенные термины определены ниже для ясности и легкости ссылок.

Термин «рекомбинантный» относится к полинуклеотиду или полипептиду, который не представлен в природных условиях в клетке-хозяине. Рекомбинантная молекула может содержать две или более встречающихся в природе последовательности, которые связаны вместе путем, который не встречается в природе. Рекомбинантная клетка содержит рекомбинантный полинуклеотид или полипептид.

Термин «гетерологичный» относится к элементам, которые в норме не связаны друг с другом. Например, если клетка-хозяин продуцирует гетерологичный белок, этот белок в норме не продуцируется этой клеткой-хозяином. Таким же образом, промотер, который функционально связан с гетерологичной кодирующей последовательностью, является промотером, который функционально связан с кодирующей последовательностью, которая обычно не является функционально связанной в клетке-хозяине дикого типа. Термин «гомологичный», по отношению к полинуклеотиду или белку, относится к полинуклеотиду или белку, которые встречаются в природных условиях в клетке-хозяине.

Термины «белок» или «полипептид» здесь применяются взаимозаменяемо.

«Сигнальная последовательность» представляет собой последовательность аминокислот, представленную в N-концевой части белка, которая обеспечивает секрецию зрелой формы белка из клетки. Определение сигнальной последовательности является функциональным. Зрелая форма внеклеточного белка не имеет сигнальной последовательности, которая отрезается в процессе секреции.

Термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК, РНК, их одноцепочечные или двухцепочечные формы или их химические модификации. Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» здесь используются взаимозаменяемо.

«Вектор» относится к полинуклеотиду, предназначенному для введения нуклеиновых кислот в одну или более клеток-хозяев. В определенных вариантах осуществления, вектор может автономно реплицироваться в различных клетках-хозяевах и включает: векторы для клонирования, экспрессионные векторы, «челночные» векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и тому подобное. В других вариантах осуществления, вектор может интегрировать в геном клетки-хозяина.

«Промотер» представляет собой регуляторную последовательность, которая инициирует транскрипцию нижележащей по направлению 5'-3' нуклеиновой кислоты.

Термин «функционально связанный» относится к организации элементов, которая позволяет им быть связанными функционально. Например, промотер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он контролирует транскрипцию этой последовательности.

Термин «селективный маркер» относится к белку, допускающему экспрессию в клетках-хозяевах, который предусматривает легкость селекции тех клеток-хозяев, которые содержат введенную нуклеиновую кислоту или вектор. Примеры селективных маркеров включают, но не ограничиваются, антибактериальные препараты (например, гигромицин, блеомицин или хлорамфеникол) и/или гены, которые придают метаболическое преимущество, такое как трофическое преимущество для клетки-хозяина.

Термины «выделен», «изолирован» или «очищен из», как они используются здесь, относятся к белку, клетке, нуклеиновой кислоте или аминокислоте, которые отделены от по крайней мере одного другого компонента, с которым они являются обычно ассоциированы.

Как используется здесь, термин «трансформированный», «стабильно трансформированный» и «трансгенный», использованные по отношению к клетке, означают, что клетка несет неприродную (например, гетерологичную) последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в ее геном или в качестве эписомальной плазмиды, которая сохраняется во многих поколениях.

Как используется здесь, термин «экспрессия» относится к процессу, в котором полипептид продуцируется на основе нуклеотидной последовательности гена. Процесс включает как транскрипцию, так и трансляцию.

Термин «введенный» в контексте помещения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, обозначает «трансфекция», или «трансформация» или «трансдукция» и содержит ссылку на включение последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где последовательность нуклеиновой кислоты может быть включена в геном клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), конвертирована в автономный репликон, или временно экспрессирована (например, трансфецированная мРНК).

Термин «гибридизация» относится к процессу, в котором цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью путем спаривания оснований, как известно в области техники. Нуклеиновая кислота считается «селективно гибридизуемой» по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты, если две последовательности специфически гибридизуются друг с другом при условиях средней и высокой жесткости гибридизации и отмывок. Условия средней и высокой жесткости гибридизации и отмывок хорошо известны (см., например, Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons 1995 and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001 Cold Spring Harbor, N.Y.). Один пример условий высокой жесткости включает гибридизацию при примерно 42°С в 50%-ном растворе формамида, 5X SSC, 5X раствор Denhardt, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК-носителя, с последующей отмывкой два раза в 2X SSC и 0,5% SDS при комнатной температуре и два дополнительных раза в 0,1X SSC и 0,5% SDS при 42°C.

«Кодирующая последовательность» представляет собой часть ДНК, которая кодирует полипептид.

«Экспрессионная кассета», как используется здесь, означает ДНК конструкцию, содержащую область, кодирующую белок, которая функционально связана с подходящей контрольной последовательностью, которая делает возможной эффективную экспрессию белка в соответствующей клетке-хозяине. Такие контрольные последовательности могут включать промотер для эффективной транскрипции, опциональную последовательность оператора для контроля транскрипции для получения мРНК, последовательность, кодирующую соответствующие участки связывания рибосомы на мРНК, и энхансеры или другие последовательности, которые контролируют терминирование транскрипции и трансляции.

Полипепид или полинуклеиотид, который является «нативным для клетки-хозяина», имеет аминокислотную или нуклеиотидную последовательность, которая является такой же, как и представленная в неизмененной клетке-хозяине. В отдельных случаях, клетка может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид (например, кодирующую последовательность), который является нативным для клетки. В этих случаях, клетка содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, которая также присутствует в неизмененной версии клетки-хозяина (например, клетка-хозяин, которая не содержит какого-либо генного нокаута), в другом локусе. В отдельных случаях, клетка может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, который является нативным для клетки. В этих случаях, клетка содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую полипептид с аминокислотной последовательностью, которая является такой же, как и полипептид, найденный в неизмененной версии клеток-хозяев (например, клетка-хозяин, которая не содержит какого-либо генного нокаута). Термин «эндогенный» является синонимом термину «нативный».

«Нативный промотер», по отношению к кодирующей последовательности, которая функционально связана со своим нативным промотером, относится к промотеру дикого типа клетки-хозяина, который функционально связан с кодирующей последовательностью в этой клетке.

Термин «прямые повторы» относится к по крайней мере двум элементам последовательности, которые представлены в одинаковой ориентации и которые могут подвергаться гомологичной рекомбинации в клетке. Прямые повторы имеют идентичные или почти идентичные нуклеотидные последовательности (например, по крайней мере 98% или 99% идетичность последовательности) на протяжении по крайней мере 50 нуклеотидов, например, по крайней мере 100, по крайней мере 200 или по крайней мере 500 или более нуклеотидов.

Термин «ингибитор» относится к соединению, которое обратимо ингибирует фермент, как посредством конкурентного ингибирования, так и неконкурентного ингибирования (например, аллостерически).

Термин «необходимый фермент» является ферментом, который является необходимым для роста клеток.

Термин «экспрессионная кассета, которая обеспечивает значительную экспрессию необходимого фермента» относится к экспрессионной кассете, которая обеспечивает экспрессию необходимого фермента на уровне более чем 50% (например, по крайней мере 70%, по крайней мере 90% или по крайней мере 100%, до 1000%) от уровня эндогенного необходимого фермента, если ген эндогенного необходимого фермента является геном дикого типа (т.е. не-инактивированным) в клетке.

Термин «аланин рацемаза» относится к ферменту, который катализирует взаимопревращение L-аланина в D-аланин. Аланин рацемаза имеет активность, описанную в EC 5.1.1.1, в соответствии с IUBMB номенклатурой ферментов. Ген, кодирующий аланин рацемазу, может быть обозначен как "air", "alrA" или "dal" ген.

Другие определения терминов могут возникнуть на всем протяжении спецификации.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Как приведено выше, описан способ амплификации геномного локуса. Несколько основных особенностей этого способа проиллюстрированы на Фиг. 1. Со ссылкой на Фиг. 1, бактериальные клетки-хозяева, используемые в способе, могут содержать геномный локус, включающий амплификационную единицу со структурой A₁-P-M-A_2, где A₁ и A₂ являются прямыми повторами, Р содержит кодирующую последовательность для белка, представляющего интерес, и М содержит кодирующую последовательность для фермента, который является необходимым для клетки. Подразумевается, что формула A₁-P-M-A₂ охватывает геномный локус, который содержит прямые повторы, которые ориентированы в любом направлении по отношению к Р и М.

Амплификационная единица обеспечивает экспрессию в клетке белка, представляющего интерес, и необходимого фермента. В определенных случаях, область Р и область М могут независимо включать экспрессионную кассету (а именно, кодирующую последовательность, функционально связанную с промотером) для белка, представляющего интерес, и необходимого фермента, соответственно. В некоторых вариантах осуществления, амплификационная единица включает первую экспрессионную кассету для экспрессии белка, представляющего интерес, и вторую кассету для экспрессии необходимого фермента. В других вариантах осуществления, кодирующая последовательность области Р может быть функционально связана с промотером, который находится в прилегающем прямом повторе. В этом варианте осуществления и, как будет обсуждаться в более подробных деталях ниже, комбинированная нуклеотидная последовательность прямого повтора и кодирующая последовательность для необходимого фермента могут быть эндогенными для клетки, а именно присутствующей в геноме клетки-хозяине. В определенных вариантах осуществления, промотер, функционально связанный с кодирующей последовательностью области М, может быть эндогенным или не-эндогенным для такой кодирующей последовательности. В определенных вариантах осуществления, кодирующая последовательность области М может управляться промотером, функционально связанным с кодирующей последовательностью в Р.

Как является очевидным, ориентация Р и М в любой нуклеиновой кислоте, описанной здесь, может быть обратной ориентацией (а именно, A₁-M-P-A₂). При этой обратной ориентации и в определенных вариантах осуществления, кодирующая последовательность области М может быть функционально связана с промотером в прямом повторе A₁. Альтернативно, кодирующая последовательность области М может быть функционально связана с промотером, который находится в области М.

Популяция таких клеток подвергается воздействию ингибитора необходимого фермента, и отбираются клетки, которые являются устойчивыми к действию ингибитора (то есть, клетки, которые могут расти и делиться в присутствии ингибитора до образования колоний). Как показано ни Фиг. 1, отобранные клетки имеют геномный локус, содержащий множественные копии амплификационной единицы, этот геномный локус может быть описан формулой (A₁-P-M)_n-A_2, где A₁ и A₂ являются прямыми повторами, n равно по крайней мере 2 и n может быть, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или по крайней мере 10, например, в пределах от 10 до 50, или от 50 до 100, или более. Отобранные клетки не имеют мутаций в кодирующей последовательности необходимого фермента (например, в сайте связывания ингибитора) или в промотере, связанном с кодирующей последовательностью, по сравнению с неотобранными клетками. Точнее, отобранные клетки имеют увеличенное количество копий амплификационной единицы, что позволяет клеткам расти в присутствии ингибитора. В определенных случаях, популяция клеток может быть подвергнута нескольким раундам селекции, с использованием в каждом раунде селекции последовательно увеличивающейся концентрации ингибитора (а именно, с последовательным удваиванием концентрации ингибитора). В некоторых вариантах осуществления, амплификационная единица A₁-Р-М-A₂ содержит полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7

где повторяющиеся единицы A₁ и A₂ подчеркнуты, полинуклеотидная последовательность, кодирующая белок, представляющий интерес, а именно субтилизин FNA, выделена полужирным шрифтом, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая необходимый фермент, например, аланин рацемазу, выделена курсивом. Последовательности промотеров показаны заглавными полужирными буквами.

Поскольку клетки-хозяева, полученные этим способом, содержат больше копий первой экспрессионной кассеты, клетки могут продуцировать больше белка, представляющего интерес, кодируемого первой экспрессионной кассетой, чем клетки-хозяева, которые имеют единственную копию амплификационной единицы A₁-Р-М-A₂. В конкретных вариантах осуществления, результирующие клетки-хозяева могут продуцировать по крайней мере на 20%, по крайней мере на 40%, по крайней мере на 60%, по крайней мере на 80%, по крайней мере на 100%, по крайней мере в два раза, по крайней мере в три раза, по крайней мере в пять раз или по крайней мере в десять раз, до примерно в 100 раз больше белка по сравнению с во всем остальном идентичными клетками-хозяевами, которые имеют единственную копию амплификационной единицы A₁-Р-М-A₂.

Концентрация ингибитора, используемая в тематическом способе, может изменяться в зависимости от используемого необходимого фермента и эффективности ингибитора. В определенных вариантах осуществления, ингибитор может быть в концентрации в пределах от 1 мкМ до 100 мМ, например, в пределах от 5 мкМ до 10 мМ, от 20 мкм до 1 мМ, хотя концентрации ингибитора вне этих пределов также представимы. Ингибитор может быть добавлен в жидкую культуру или может быть представлен в твердой среде (например, среда с агаром) в зависимости от того, на какой среде растут бактерии. Как замечено выше, популяция клеток может быть подвергнута нескольким раундам селекции, при использовании в каждом раунде селекции последовательно увеличивающейся концентрации ингибитора (а именно, с последовательным удваиванием концентрации ингибитора).

В определенных вариантах осуществления, амплификационная единица не содержит маркера устойчивости к антибиотику, и отбор клеток может проводиться в среде без антибиотика.

Первая и вторая экспрессионные кассеты и клетки-хозяева описаны более подробно ниже.

Экспрессионные кассеты

Как замечено выше, амплификационная единица обеспечивает экспрессию полипептида, представляющего интерес, и необходимого фермента. Собственно, амплификационная единица обычно содержит по крайней мере две экспрессионные кассеты: первая экспрессионная кассета для экспрессии полипептида, представляющего интерес, и вторая экспрессионная кассета для экспрессии необходимого гена. Каждая экспрессионная кассета содержит, в функциональной связи: промотер, кодирующую последовательность, и терминатор. В определенных случаях, область Р амплификационной единицы может содержать первую экспрессионную кассету, и область М амплификационной единицы может содержать вторую экспрессионную кассету. В других случаях, как отмечено выше, прямой повтор, прилегающий к области Р, может содержать промотер, функционально связанный с кодирующей последовательностью области Р. В определенных случаях, непрерывная последовательность области Р и прямой повтор, прилегающий к области Р, могут быть эндогенными для клетки-хозяина (то есть, содержаться в геноме клетки-хозяина). В конкретном варианте осуществления кодирующая последовательность области М может быть функционально связана с промотером области Р.

Каждая экспрессионная кассета, рассмотренная здесь, может содержать следующие элементы в функциональной связи: промотер, кодирующую последовательность и последовательность терминатора, где экспрессионная кассета является достаточной для продуцирования белка в клетке-хозяине. Как будет рассмотрено более подробно ниже, кодирующая последовательность первой экспрессионной кассеты может кодировать рекомбинантный белок, например терапевтический белок или так называемый «индустриальный фермент». В конкретных вариантах осуществления, эта кодирующая последовательность может кодировать белок, имеющий сигнальную последовательность, которая обеспечивает секрецию белка из клетки. Как указано выше и как будет описано более подробно ниже, вторая экспрессионная кассета обеспечивает экспрессию необходимого фермента.

Выбор промотеров, терминаторов и сигнальных последовательностей, если таковые используются, значительно зависит от используемых клеток-хозяев. Клетки-хозяева включают клетку-хозяина Bacillus sp., клетки-хозяева Streptomyces sp., E. Coli и другие бактериальные клетки-хозяева. Как указано выше, в примерах осуществления, могут быть использованы клетки-хозяева Streptomyces, в которых сигнальная последовательность, если используется, может быть celA сигнальной последовательностью. В определенных случаях, celA сигнальная последовательность может быть сигнальной последовательностью, кодируемой геном целлюлазы А S. Lividans, CelA, как описано Kluepfel et al. (Nature Biotechnol. 1996 14:756-759). В других примерах осуществления, в которых используется клетка-хозяин Bacillus, сигнальная последовательность может быть последовательностью аминокислот, которая способна направлять гибридный белок в секреторные пути клетки-хозяина Bacillus. В определенных случаях, сигнальная последовательность, которая может быть использована, содержит сигнальную последовательность белков, которые секретируются Bacillus клетками-хозяевами дикого типа. Такие сигнальные последовательности включают сигнальные последовательности, кодируемые генами α-амилазы, протеазы, например aprE или субтилизин Е, или β-лактамазы. Типичные сигнальные последовательности включают, но не ограничиваются, сигнальные последовательности, кодируемые геном α-амилазы, геном субтилизина, геном β-лактамазы, геном нейтральной протеазы (например, nprT, nprS, nprM), или геном prsA из любого подходящего вида Bacillus, включая, но не ограничиваясь, B. stearothermophilus, B. licheniformis, B. clausii, B. subtilis и B. amyloliquefaciens. В одном варианте осуществления, сигнальная последовательность кодируется геном aprE из B. subtilis (как описано в Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003 62:369-73). Дополнительные сигнальные пептиды описаны в Simonen and Palva (Microbiological Reviews 1993 57: 109-137) и в других ссылках.

Подходящие промотеры и терминаторы для использования в Bacillus и Streptomyces клетках-хозяевах известны и включают: промотеры и терминаторы генов apr (алкалиновая протеаза), npr (нейтральная протеаза), amy (α-амилаза) и β-лактамазы, также как и ген левансукразы B. subtilis (sacB), ген альфа-амилазы B. licheniformis (amyh), ген мальтогенной амилазы B. stearothermophilus (amyM), ген альфа-амилазы B. amyloliquefaciens (amyQ), ген пенициллиназы B. licheniformis (penV), B. subtilis xylA и xylB гены, промотеры и терминаторы, описанные в WO 93/10249, WO 98/07846, и WO 99/43835. Экспрессионные кассеты для использования в Streptomyces клетках-хозяевах могут быть сконструированы с использованием промотеров и терминаторов, описанных в Hopwood et al (Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratories, 1985), Hopwood et al (Regulation of Gene Expression in Antibiotic-producing Streptomyces. In Booth, I. and Higgins, C. (Eds) Symposium of the Society for General Microbiology, Regulation of Gene Expression, Cambridge University Press, 1986 pgs. 251-276), Fornwald et al (Proc. Natl. Acad. Sci. 1987 84: 2130-2134), Pulido et al (Gene. 1987 56:277-82); Dehottay et al (Eur. J. Biochem. 1987 166:345-50), Taguchi (Gene. 1989 84:279-86), Schmitt-John et al (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992 36:493-8), Motamedi (Gene 1995 160:25-31) и Binnie (Protein Expr. Purif. 1997 11:271-8), например. В одном варианте осуществления, промотер А4 может быть применен, который описан в WO 06/054997, который является включенным в эту заявку посредством ссылки.

В определенных вариантах осуществления, любая из последовательностей может быть кодон-оптимизированной для экспрессии полипептида, представляющего интерес, в использованных клетках-хозяевах. Поскольку таблицы использования кодонов, перечисляющие использование каждого кодона во многих клетках, известны в области техники (см., например, Nakamura et al, Nucl. Acids Res. 2000 28: 292) или легко выводимы, такие нуклеиновые кислоты могут быть легко получены, дающие аминокислотную последовательность белков, которые будут экспрессированы.

Системы для экспрессии рекомбинантных белков в клетках-хозяевах Streptomyces и Bacillus хорошо известны в области техники и не нуждаются в более детальном обсуждении, чем представлено выше.

Первая экспрессионная кассета

Первая экспрессионная кассета может содержать промотер и полинуклеотид, кодирующий белок, представляющий интерес (то есть, кодирующую последовательность), где промотер и полинуклеотид функционально связаны таким образом, что выделенная нуклеиновая кислота обуславливает транскрипцию полинуклеотида и продукцию белка, представляющего интерес.

Кодируемый белок, представляющий интерес, может быть так называемый «индустриальный фермент», терапевтический белок, репортерный белок, пищевая добавка или продукт питания и тому подобное.

В одном варианте осуществления белок, представляющий интерес, может быть ферментом, таким как карбогидраза, такая как разжижающая и осахаривающая α-амилаза, алкалиновая α-амилаза, β-амилаза, целлюлаза, декстраназа, α-глюкозидаза, α-галактозидаза, глюкоамилаза, хемицеллюлаза, пентозаназа, ксиланаза, инвертаза, лактаза, наринганаза, пектиназа или пуллуланаза; протеаза, такая как кислая протеаза, щелочная протеаза, бромелаин, фицин, нейтральная протеаза, папаин, пепсин, пептидаза, реннет, реннин, химозин, субтилизин, термолизин, аспарагиновая протеаза, или трипсин; липаза или эстераза, такая как триглицеридаза, фосфолипаза, преджелудочная эстераза, фосфатаза, фитаза, амидаза, иминоацилаза, глутаминаза, лизоцим, или пенициллин ацилаза; изомераза, такая как глюкоза изомераза; оксидоредуктаза, например, аминокислотная оксидаза, каталаза, хлоропероксидаза, глюкоза оксидаза, гидроксистероидная дегидрогеназа или пероксидаза; лиаза, такая как ацетолактат декарбоксилаза, аспарагиновая β-декарбоксилаза, фумараза или гистадаза; трансфераза, такая как циклодекстрин гликозилтрансфераза; или лигаза, например. В конкретных вариантах осуществления, белок может быть аминопептидазой, карбоксипептидазой, хитиназой, кутиназой, дезоксирибон