Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса эбола (варианты)

Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса эбола (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Эбола.

Предшествующий уровень техники.

Геморрагическая лихорадка Эбола - это острая вирусная высококонтагиозная болезнь, вызываемая вирусом Эбола, летальность от которой доходит до 90%. Вирус передается людям от диких животных и затем распространяется от человека к человеку. Впервые данное заболевание было зарегистрировано в 1976 году. С этого времени наблюдалось более 10 вспышек лихорадки Эбола, самая крупная из которых в 2014 году переросла в эпидемию, охватила крупные города и сельские районы 5 стран Западной и Центральной Африки и унесла жизни более девяти тысяч человек. При этом разрешенных к применению превентивных средств против данного заболевания пока не существует.

Одной из наиболее перспективных разработок в данной области являются вакцины, основанные на вирусных системах доставки, которые содержат гены протективных антигенов вируса Эбола.

Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.

Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены данных вирусов.

Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).

Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV.

Технические решения согласно патентам US 20100047282 А1 и СА 2493142 С как наиболее близкие к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбраны авторами заявляемого изобретения за прототип. В связи с тем что на дату национального приоритета данных заявок 2 августа 2004 года и 26 июля 2002 года ничего не было известно о штамме вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, так как впервые данный возбудитель выделен и охарактеризован в июле 2014 года, нуклеотидная последовательность его генов не могла быть использована для конструирования рекомбинантных вирусов. Соответственно, заявители не имели возможности создать конструкцию с охарактеризованными культурально-морфологическими свойствами, уровнем экспрессии и иммуногенными свойствами. Это является существенным недостатком данных конструкций, так как не позволяет использовать их для получения специфического иммунитета к вирусу Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.

Раскрытие настоящего изобретения.

Задачей каждого из вариантов настоящего изобретения является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.

Указанная задача решается за счет того, что создано иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1).

Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 2).

Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятые в эффективных соотношениях (вариант 3).

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 реализуется путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 2 реализуется путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 3 реализуется путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту 2 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.

Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту 3 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность гена GP1 (SEQ ID NO 1), которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем добавления в последовательность одного аденина (подробное описание модификации приводится в пункте «Реализация изобретения»).

На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность GP2 (SEQ ID NO 2), которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем замены кодонов, которые редко встречаются у человека на более часто встречающиеся (подробное описание модификации приводится в пункте «Реализация изобретения»).

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность GP3 (SEQ ID NO 3), которая представляет собой немодифицированную последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2.

На фиг. 4 представлена немодифицированная нуклеотидная последовательность гена GP (SEQ ID NO 4) вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1.

На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 5), содержащую последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем добавления в последовательность одного аденина.

На фиг. 6 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 6), содержащую последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем замены кодонов, которые редко встречаются у человека на более часто встречающиеся.

На фиг. 7 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP2.

На фиг. 8 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-wt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2.

На фиг. 9 представлены результаты проверки качества разработанного иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-wt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2,

6 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP3.

На фиг. 10 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.

Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:

1. фосфатный буфер (100 мкл)

2. Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь

3. Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь

4. Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь

На фиг. 11 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.

Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:

1. фосфатный буфер (100 мкл)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь

4. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь

На фиг. 12 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.

Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.

Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:

1. фосфатный буфер (100 мкл)

2. VSV-null 10⁷ БОЕ/мышь

3. VSV-GP1 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь

4. VSV-GP1 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь

5. VSV-GP1 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь

6. VSV-GP2 10⁷ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁷ БОЕ/мышь

7. VSV-GP2 10⁶ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁹ БОЕ/мышь

8. VSV-GP2 10⁹ БОЕ/мышь, VSV-GP3 10⁶ БОЕ/мышь

Реализация изобретения.

Гликопротеин GP вируса Эбола является одним из наиболее перспективных вакцинных антигенов, индукция иммунных реакций к которому обеспечивает защиту от лихорадки Эбола. Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы модифицировали нуклеотидную последовательность GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1. Было получено два вида модифицированного гена: GP1 (SEQ ID NO 1) и GP2 (SEQ ID NO 2).

GP1 (SEQ ID NO 1) был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», которые отличаются на один нуклеотид (аденин). Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой. L-полимераза вируса Эбола в отличие от полимеразы эукариотических клеток в этом месте вставляет дополнительный нуклеотид, что сдвигает рамку считывания и изменяет аминокислотную последовательность белка. Следовательно, для того, чтобы получить полный вариант белка GP в эукариотических клетках, необходимо добавить один нуклеотид в указанную последовательность.

GP2 (SEQ ID NO 2) был получен также, как и GP1 - путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», и затем дополнительно оптимизирован для экспрессии в клетках человека. Оптимизация нуклеотидной последовательности - это процесс, при котором редко встречающиеся у человека кодоны заменяют на часто встречающиеся. Чем чаще встречается кодон, тем больше в клетках количество соответствующей ему тРНК и тем быстрее будут транспортироваться аминокислоты к месту синтеза белка. Поэтому оптимизация последовательности обеспечивает более высокую скорость синтеза белка.

Далее авторами было разработано несколько конструкций на основе аденовируса человека пятого серотипа и вируса везикулярного стоматита для эффективной доставки модифицированных генов GP в клетки млекопитающих.

Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

Данный вирусный вектор является одним из наиболее безопасных для человека и вместе с тем эффективных векторов (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, №23 (8), c. 1029-1036). Рекомбинантные аденовирусы обладают следующими преимуществами: не способны размножаться в клетках человека, способны проникать как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, индуцируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена.

Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.

В данном изобретении в геноме рекомбинантного вируса везикулярного стоматита (VSV) ген собственного гликопротеина заменили на ген гликопротеина вируса Эбола. При сборке вируса VSV гликопротеин вируса Эбола включается в состав оболочки вирусной частицы и экспонируется на ее поверхности, а следовательно, эффективно распознается иммунной системой. Кроме того, при попадании вируса в клетку происходит экспрессия данного белка на ее мембране. Такие клетки воспринимаются иммунной системой как зараженные, и против белка GP развивается иммунный ответ.

В целом, можно сказать, что идеального вирусного вектора не существует и использование того или иного вектора зависит в первую очередь от целевой группы населения. Возможно проведение перед иммунизацией дополнительных тестов для определения титра антител к тому или иному вирусному вектору.

Изобретение по варианту 3 также основано на вирусе везикулярного стоматита и включает два вектора, один из которых содержит ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, а другой - модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятых в эффективных соотношениях.

Таким образом, данное иммунобиологическое средство обеспечивает одновременную экспрессию в организме млекопитающего сразу двух видов гликопротеина, полученного от разных штаммов вируса Эбола. Следовательно, оно является более универсальным и индуцирует развитие иммунных реакций против двух наиболее опасных штаммов вируса Эбола.

Авторами разработано несколько способов использования данных иммунобиологических средств. Способы использования представлены далее в формуле изобретения по пп. 4-6 и предусматривают введение вышеописанных иммунобиологических средств по каждому из 3-х вариантов в организм млекопитающих по отдельности в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола. Данный способ подходит для индукции иммунного ответа у широких масс населения.

Однако есть категории населения (работники сферы здравоохранения, люди, живущие в очаге эпидемии), для которых угроза заражения вирусом Эбола повышена. Для данной категории были разработаны способы по пп. 7, 8, которые включают последовательную иммунизацию (с интервалом более 1 недели) иммунобиологическими средствами по варианту 1 и варианту 2 (по пп. 1 и 2 формулы) или по варианту 1 и варианту 3 (по пп. 1 и 3 формулы). Данные способы является очень эффективными, поскольку при иммунизации различными вирусными векторами индуцируется мощный иммунный ответ. Однако, в свою очередь, использование данного способа может быть экономически нецелесообразно для иммунизации широких слоев населения.

Примеры

Пример 1. Получение различных нуклеотидных последовательностей гликопротеина вируса Эбола

GP является самым иммуногенным белком вируса Эбола и наиболее перспективным вакцинным антигеном. Авторами разработаны варианты иммунобиологического средства, которые включают модифицированную последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранную из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), или немодифицированную последовательность /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 SEQ ID NO 3 (GP3).

Модификация последовательности была произведена, как описано в пункте «Реализация изобретения». Все нуклеотидные последовательности были получены методом синтеза.

Пример 2. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1)

Для получения рекомбинантного аденовируса методами генной инженерии было сконструировано 2 плазмидных конструкции, которые включают различные варианты модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1: pShuttle-GP1 (содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг. 1)), pShuttle-GP2 (содержит последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная конструкция, которая содержит контрольную исходную немодифицированную последовательность pShuttle-GPwt (SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).

Далее вышеописанные плазмидные конструкции были обработаны эндонуклеазами рестрикции PacI и BstII07l для извлечения экспрессионных кассет. Космида cAd5-EGFP также была обработана эндонуклеазами PacI и BstII07l. Продукты гидролиза лигировали. Полученную ДНК, содержащуюся в лигазной смеси, упаковывали в фаговые головки. Далее компетентные клетки DH5α трансдуцировали фаговыми головками. Трансформированные клетки отбирали по их росту на твердой среде LB с селективным антибиотиком. Из выросших клеток выделяли плазмидную ДНК. Таким образом, было получено 3 космиды. cAd5-GP1 содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой (SEQ ID NO 5 (фиг. 5)), в состав которой входит модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 1 (фиг. 1). cAd5-GP2 содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой (SEQ ID NO 6 (фиг. 6), в состав которой входит модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 2 (фиг. 2). cAd5-GPwt содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой, в состав которой входит немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.

На следующем этапе был проведен гидролиз полученных космид эндонуклеазами рестрикции PacI и SwaI для удаления плазмидной части и трансфекция в эукариотические клетки линии HEK293. Через 5 дней после трансфекции проводили слепые пассажи материала для размножения рекомбинантных аденовирусов. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования) клетки с культуральной средой трехкратно перемораживают для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено 3 рекомбинантных аденовируса: Ad-GP1, Ad-GP2, Ad-GPwt.

Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 2)

Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована плазмида VSV-deltaG-GFP, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами генной инженерии из данной плазмиды было получено 2 плазмидных вектора, включающих последовательности модифицированного гена GP: pVSV-deltaG-GP1 (содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг. 1)), pVSV-deltaG-GP2 (содержит последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная конструкция, которая содержит контрольную исходную немодифицированную последовательность: pVSV-deltaG-GPwt (содержит последовательность SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).

Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была проведена трансфекция клеток CV-1 четырьмя плазмидами: pVSV-N (содержит гены белков нуклеокапсида), VSV-P (содержит ген фосфопротеина), VSV-L (содержит ген большой субъединицы полимеразы) и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-GP1, pVSV-deltaG-GP2, pVSV-deltaG-GPwt. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя.

Таким образом, было получено три препарата рекомбинантного вируса везикулярного стоматита: VSV-GP1, VSV-GP2, VSV-GPwt.

Пример 4. Получение иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 3)

Для данного иммунобиологического средства были получены рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, содержащие кассеты со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2), и вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (VSV-deltaG-GP3). В качестве контроля был получен вирус, содержащий немодифицированную последовательность вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GPwt). Все вирусы были получены по методике, описанной в примере 2. Для получения иммунобиологического средства смешивали:

рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2, в соотношениях 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1.

В результате проведенной работы были получены различные варианты иммунобиологического средства по п. 3.

Пример 5. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (Ad-GP1, Ad-GP2) и контрольные препараты (Ad-null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, Ad-GPwt - рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 100 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга. Для этого был произведен отбор среды с клеток, клетки были промыты стерильным фосфатно-солевым буфером, а затем лизированы с помощью RIPA буфера (Pierce) по протоколу фирмы-производителя.

После лизиса клеток производили измерение концентрации тотального белка в пробах с помощью реактива Bradford (Sigma) согласно инструкции производителя. Аликвоту выровненных по содержанию белка образцов смешивали с Laemmli Sample Buffer (Sigma) и инкубировали в течение 5 минут при 95°С.

Далее проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 10% SDS-полиакриламидном геле SPRINT NEXT GEL® 10% (Amresco) в NEXT GEL® Running Buffer, 20X (Amresco) с помощью системы Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad) в течение 20 минут при 250 V. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (Bio-Rad) в буфере Tris-CAPS (Bio-Rad) с помощью системы для переноса Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad) в течение 15 минут при 25 V. Затем проводили блокирование неспецифического сигнала. Для этого мембрану инкубировали в растворе 3% обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин 20 (ТФСБ) в течение часа при комнатной температуре. После этого мембрану инкубировали 16 часов при 4°С с антителами к белку GP в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ. Далее проводили отмывку мембраны раствором ТФСБ и обрабатывали мембрану раствором вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена, в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ при 37°С на шейкере в течение 1 часа. Затем мембрану тщательно отмывали раствором ТФСБ. Дальнейшую детекцию проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL Substrate (Bio-Rad) и проявляли на пленку Hyperfilm® ECL™ (Amersham). По такому же протоколу проводили детекцию белка сравнения GAPDH с помощью антител Anti-GAPDH.

Результаты представлена на фиг. 7:

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP2.

Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами, содержащими как модифицированные, так и немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, наблюдалась экспрессия целевого белка GP. При этом в клетках, к которым добавляли рекомбинантные аденовирусы, которые содержат модифицированные гены GP (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2), наблюдались более высокие уровни экспрессии, чем в клетках, трансдуцированных аденовирусом, экспрессирующим немодифицированный ген GP (SEQ ID NO 4).

Пример 6. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита (VSV-GP1, VSV-GP2) и контрольные препараты (VSV-null - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, не содержащий вставок, VSV-GPwt - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере 4.

Результаты представлены на фиг. 8:

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GPwt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2.

Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими как модифицированные, так и немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, наблюдалась экспрессия GP. При этом в тех клетках, к которым добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, которые содержат модифицированные гены GP, наблюдались более высокие уровни экспрессии.

Пример 7. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2

Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO₂. Клетки помещали на 35 мм² культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита, которые входят в состав разработанного иммунобиологического средства (VSV-GP1, VSV-deltaG-GP2, VSV-deltaG-GP3, VSV-deltaG-GP4, VSV-deltaG-GP5), и контрольные препараты (VSV-deltaG-null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, VSV-deltaG-GPwt - рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере 4.

Результаты представлены на фиг. 9:

1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,

2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GPwt,

4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,

5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2,

6 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP3.

Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими ген GP, наблюдалась экспрессия гликопротеина вируса Эбола. Максимальная экспрессия была обнаружена в группах №4 и №5, где добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного стоматита, несущие модифицированные гены GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2).

Пример 8. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола

Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина вируса Эбола.

Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина вируса Эбола, после двукратной (с интервалом в 1 неделю) подкожной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный аденовирус, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из GP1 (SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2).

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г. Все животные были разделены на 13 групп по 3 животных, которым внутримышечно вводили:

1) Ad-GP1 10⁷ БОЕ/мышь

2) Ad-GP1 10⁸ БОЕ/мышь

3) Ad-GP1 10⁹ БОЕ/мышь

4) Ad-GP1 10¹⁰ БОЕ/мышь

5) Ad-GP2 10⁷ БОЕ/мышь

6) Ad-GP2 10⁸ БОЕ/мышь

7) Ad-GP2 10⁹ БОЕ/мышь

8) Ad-GP2 10¹⁰ БОЕ/мышь

9) Ad-null 10⁷ БОЕ/мышь

10) Ad-null 10⁸ БОЕ/мышь

11) Ad-null 10⁹ БОЕ/мышь

12) Ad-null 10¹⁰ БОЕ/мышь

13) фосфатно-солевой буфер

Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по следующему протоколу.

1) Белок (GP) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4°С.

2) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 8 разведений каждого образца.

3) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.

4) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

5) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

6) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с биотином.

7) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.

8) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

9) Затем в каждую лунку добавили конъюгат стрептовидина и пероксидазы хрена.

10) Далее проводили инкубацию в течение 30 минут при 37°С.

11) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.

12) Затем добавили раствор ТМВ, который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.

Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство по п. 1, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.

Пример 9. Способ использования иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола

Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутри