Bvdv-вакцина

Bvdv-вакцина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к вирусу BVD (вирусной диареи крупного рогатого скота) и его применениям, к вакцинам и комбинированным вакцинам, содержащим такой вирус, их применениям в качестве лекарственного средства, их применению в лечении вирусной диареи крупного рогатого скота и к способам получения таких вакцин.

Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), член рода Pestivirus в семействе Flaviviridae, является этиологическим фактором вирусной диареи крупного рогатого скота, экономически важного заболевания крупного рогатого скота во всем мире. Пестивирусы могут быть подразделены на два различных биотипа, цитопатогенные (cp) и нецитопатогенные (ncp) вирусы, соответственно. Генетически и структурно близкородственными видами вирусов являются Классический Вирус Свиной лихорадки (CSFV) и овечий Вирус рода Pestivirus (BDV).

Большие экономические потери, вызываемые инфекциями BVDV, обусловлены уменьшенным продуцированием молока, замедлением роста, уменьшенной репродуктивностью и увеличенной встречаемостью других заболеваний, таких как транспортная лихорадка. Уменьшенная репродуктивная способность вызывается i.a. уменьшенной фертильностью, выкидышами и генерированием стойко инфицированных телят, которые могут развивать фатальную "Болезнь слизистых оболочек".

В составе BVDV существуют два основных генотипа, которые классифицируются как различные виды в роде Pestivirus: BVDV Типа 1 и Типа 2. Как Тип 1, так и Тип 2 могут вызывать острую и персистирующую инфекцию, но было описано, что Тип 2 вызывает более тяжелые симптомы у остро инфицированных животных.

Однако, что касается вирулентности, обычно нет большого различия между Типом 1 и Типом 2.

Геном пестивируса состоит из одноцепочечной РНК положительной ориентации. Эта РНК имеет длину приблизительно 12,3 т.п.н. и содержит одну открытую рамку считывания (ORF), которая фланкирована нетранслируемыми районами (NTR) на обоих концах генома. Эта пестивирусная ORF транслируется в один полипротеин, который ко- и посттрансляционно процессируется в 12 зрелых белков вирусными и клеточными протеазами. Первым белком пестивирусной ORF является Npro (N-концевая протеаза). Npro является неструктурной аутопротеазой, которая отщепляется сама от остального ORF-кодируемого полипротеина и тем самым создает ее собственный С-конец, а также правильный N-конец для первого структурного белка в этой ORF, C (кор) белка. За этим белком C в ORF следуют другие структурные белки: E^rns, E1, E2 в этом порядке. Вместе, капсидный (C) белок и три гликозилированных белка оболочки (E^rns, E1, E2) составляют пестивирусный вирион.

E2-белок является иммуно-доминантным белком пестивирусов, содержащим главные нейтрализующие эпитопы. Таким образом, он является мишенью защитной иммунной реакции, вызываемой у хозяина после природной инфекции или последующей иммунизации живыми или убитыми вакцинами. E2-белок, вместе с E^rns-белком и Е1-белком, образует поверхностные белки, выступающие из вирусной оболочки. В данном контексте, гетеродимер E1-E2 является очень важной структурой для сборки и присоединения вируса.

В настоящее время как живые аттенуированные, так и убитые вакцины являются коммерчески доступными. Живые аттенуированные вакцины имеют то преимущество, что они имитируют природную инфекцию и они должны вводиться в большинстве случаев только один раз. Однако они имеют некоторую вирулентность, которая делает их иногда менее подходящими для вакцинации молодых животных и особенно для беременных животных или животных, находящихся в контакте с беременными животными. Убитые вакцины признаются безопасными, но обычно они должны вводиться дважды для получения адекватного уровня защиты. Кроме того, эффективность является во многих случаях уменьшенной и часто ограниченной близкородственными штаммами и типами BVDV.

Живые аттенуированные вакцины являются в настоящее время часто используемыми вакцинами. Для BVDV, доступны живые аттенуированные вакцины для защиты животных против инфекции Типа 1 и Типа 2 BVDV. Ясно, что даже только по коммерческим причинам такие вакцины должны преимущественно вводиться в виде комбинированной вакцины, т.е. в одно и то же время и, даже более удобно, в смеси в одном и том же шприце. Однако было обнаружено, что, в то время как аттенуированные вакцины Типа 1 или 2 BVDV при предоставлении в виде единственной вакцинации обеспечивают превосходную защиту, комбинированная вакцина обеспечивает значительно более низкий уровень защиты. Отдельные живые аттенуированные вакцины обеспечивают так называемый стерильный иммунитет (= без экскреции вируса и без виремии), тогда как комбинированная вакцина не обеспечивает стерильного иммунитета. Даже схема вакцинации, в которой эта вакцинация одним типом и вакцинация другим типом разделены во времени 4 неделями, обнаруживает это неблагоприятное действие. Механизм этого действия является неизвестным.

Таким образом, существует необходимость в улучшении комбинированных вакцин BVDV.

Целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных вакцин BVDV, в которых неблагоприятные действия взаимонегативных эффектов, например, Типа 1 и Типа 2 BVDV, наблюдаемые в комбинированной вакцине, являются менее тяжелыми или даже отсутствуют.

В этом отношении, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащему к первому Типу, характеризующемуся тем, что он является химерным BVDV, несущим ген E2 вируса второго Типа.

В настоящее время было неожиданно обнаружено, что, если BVDV определенного Типа используется в вакцине для защиты восприимчивого жвачного животного против BVD, где этот BVDV дополнительно несет ген Е2 второго Типа BVDV, вышеупомянутые взаимонегативные эффекты являются менее тяжелыми или даже отсутствуют.

Таким образом, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вирусу Вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащему к первому Типу, отличающемуся тем, что он является химерным BVDV, несущим дополнительно ген Е2 второго Типа BVDV.

Теперь было также неожиданно обнаружено, что, если вирус BVD определенного первого Типа используется в комбинированной вакцине для защиты восприимчивого жвачного животного против BVDV вместе с химерным BVDV, имеющим структуру того же самого первого Типа, но несущего ген E2 второго Типа BVDV, вместо Е2 первого Типа BVDV, эти взаимонегативные эффекты являются также менее тяжелыми или даже отсутствуют.

Затем такой химерный вирус может быть комбинирован для целей вакцинации с вирусом BVD, имеющим тот же самый скелет молекулы, что и химерный вирус, но несущим исходный Е2, обычно присутствующий в этом вирусе. Только в качестве примера, этот химерный BVDV может быть вирусом Типа 1, ген Е2 которого был заменен геном Е2 вируса Типа 2 и он может быть комбинирован с вирусом Типа 1 с его собственным (= Типа 1) геном Е2.

Скелет молекулы BVDV, часть этого вируса, которая не изменяется, для понимания этого изобретения, в основном образуется аппаратом репликации; неструктурные гены. Однако, только для выяснения концепции скелета, в случаях, когда заменен только ген Е2, можно рассматривать вирусный скелет как являющийся полным вирусным геномом, за исключением Е2. В случаях, когда, например, кроме гена Е2, заменен другой структурный ген, такой как, например, ген Е1, можно рассматривать этот вирусный скелет как являющийся полным вирусным геномом за исключением E2 и E1.

Как указано выше, в принципе можно оставлять оригинальный E2-ген химерного вируса на месте. Затем этот химерный вирус мог бы кодировать, например, как Е2 Типа 1 BVDV, так и Е2 Типа 2 BVDV.

Однако предпочтительной была бы замена оригинального гена Е2 геном Е2, кодирующим другой Тип Е2.

Причиной этого является то, что комбинированная вакцина, содержащая 1) химерный вирус BVD в соответствии с этим изобретением с заменой оригинального гена Е2 геном Е2, кодирующим другой Тип Е2, и 2) вирус BVD, имеющий тот же самый скелет и его оригинальный Тип Е2, могла бы гарантировать, что (при условии введения равных количеств этих вирусов) количество Е2 каждого продуцируемого Типа могло бы быть приблизительно сравнимым.

В случае химерного BVDV, содержащего как оригинальный ген Е2, так и второй ген Е2 другого типа, может быть менее легко гарантировать равные уровни экспрессии обоих генов Е2. Это обусловлено тем, что в таком вирусе один из этих двух Е2-генов мог бы инсертироваться в этом вирусе вне его природного контекста.

Ясно, что при использовании BVDV по этому изобретению в вакцине, этот вирус должен вести себя как ослабленный в сравнении с вирусом дикого типа.

Таким образом, предпочтительно BVDV по данному изобретению является живым аттенуированным вирусом.

Другой вариант этого изобретения, относится к вакцинам для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV, где такие вакцины содержат вирус Вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), принадлежащий к первому Типу, отличающийся тем, что от является химерным BVDV, дополнительно несущим ген Е2 второго Типа, и фармацевтически приемлемый носитель. Затем такой химерный вирус кодирует как Е2 Типа 1, так и Е2 Типа 2, как объяснялось выше.

Как указано выше, BVDV определенного типа, в котором Е2 этого типа заменен другим типом, мог бы быть, по приведенным выше причинам, очень подходящим для использования в комбинированной вакцине.

Таким образом, другой вариант осуществления относится к комбинированной вакцине для защиты восприимчивых жвачных животных против BVDV, где эта вакцина содержит первый BVDV, принадлежащий к первому Типу и несущий ген Е2 BVDV этого первого Типа, второй BVDV, также принадлежащий к первому Типу, но отличающийся тем, что в этом втором BVDV ген Е2 BVDV, принадлежащий к первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащим ко второму Типу, и фармацевтически приемлемый носитель.

Как упоминалось выше, белок E2 образует, вместе с E^rns-белком и Е1-белком, поверхностные белки, выступающие из вирусной оболочки. В этом контексте, гетеродимер E1-E2 является очень важной структурой для сборки и присоединения вируса.

Таким образом, предпочтительной формой комбинированной вакцины является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой, кроме того, в этом втором BVDV ген Е1 BVDV, принадлежащий к указанному первому Типу, заменен геном Е1 BVDV, принадлежащим ко второму Типу.

В принципе, эта система может быть использована для всех родственных пестивирусов, также для атипичных пестивирусов, подобных группе HoBi-вирусов, которую теперь называют будущим Типом BVDV-3.

Однако Тип 1 и Тип 2 BVDV являются обычными вызывающими заболевание типами. Таким образом, предпочтительно скелет этого вируса принадлежит к Типу 1 и ген Е2 принадлежит к Типу 2 или vice versa.

Таким образом, более предпочтительная форма этого варианта относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где скелет первого и второго вируса BVDV принадлежит к Типу 1 и ген Е2 BVDV второго BVD вируса принадлежит в Типу 2.

Равным образом, более предпочтительная форма этого варианта относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где скелет первого и второго вируса BVD принадлежит к Типу 2 и ген Е2 BVDV второго вируса BVD принадлежит к Типу 1.

Первым BVDV, описанным выше как "принадлежащий к первому Типу и несущий ген Е2 BVDV этого первого Типа", мог быть обычно стандартным вирусом BVD Типа 1 или 2 без изменений в E2. Этот первый BVDV мог быть предпочтительно живым аттенуированным вирусом.

Вторым BVDV, описанным выше как "принадлежащий к первому Типу, но отличающийся тем, что этот ген Е2 BVDV этого второго BVDV, принадлежащий к первому Типу, заменен геном Е2 BVDV, принадлежащим ко второму Типу”, мог быть обычно вирусом Типа 1 или 2, теперь, однако, несущим ген Е2 BVDV Типа 2 или 1, соответственно. Этот второй BVDV мог бы быть также предпочтительно живым аттенуированным вирусом.

Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области. Только в качестве примера, таким носителем может быть стерильная вода или буферный раствор, такой как ЗФР.

Только по причинам легкого получения вакцины, было бы практичным, если бы как первый, так и второй BVDV имели идентичный скелет молекулы. Как уже указано выше, с использованием одного и того же скелета для обоих вирусов, можно просто добавлять одно и то же количество обоих вирусов, имеющих высоко сравнимые эффективность репликации и свойства, к этой комбинированной вакцине, и на этом основании предполагать, что оба вируса имеют один и тот же уровень аттенуирования и способности к репликации, что приблизительно одно и то же количество клеток могли бы инфицироваться каждым из этих вирусов и что как Е2-белок Типа 1, так и Е2-белок Типа 2 могли бы экспрессироваться в приблизительно одном и том же количестве белка и реплицировать сравнительное количество РНК-молекул in vitro и in vivo.

Таким образом, предпочтительной формой этого варианта осуществления называют комбинированную вакцину согласно этому изобретению, в которой первый BVDV и второй BVDV имеют один и тот же скелет.

Как упоминалось выше, штаммы BVDV для использования в вакцине должны быть аттенуированы. Несколько таких аттенуированных вакцинных штаммов BVDV были описаны и несколько аттенуированных вакцинных штаммов BVDV являются коммерчески доступными. Наиболее многообещающие вакцинные типы содержат делецию в N^pro-гене и/или в E^rns-гене и являются вакцинами цитопатического биотипа. Пестивирусные вакцины на основе таких делеций были описаны i.a. в PCT-заявке на патент WO 99/64604, Заявке на Патент США 2004/0146854, Европейской Заявке на патент EP 1104676, Европейской Заявке на патент EP 1013757, Европейской Заявке на патент EP 1440149, Европейской Заявке на патент EP 1751276 и Mayer, D., et al, Vaccine 22:317-328 (2004).

Таким образом, более предпочтительная форма этого варианта осуществления относится к комбинированной вакцине по этому изобретению, где этот первый BVDV и/или указанный второй BVDV содержат делецию в N^pro-гене и/или в E^rns-гене.

BVDV является только одним из нескольких агентов, вызывающих заболевание у жвачных животных. На практике, жвачных животных вакцинируют против целого ряда вирусов или микроорганизмов, патогенных в отношении жвачных животных. Таким образом, крайне заманчивым, как для практических, так и для экономических целей, является объединение этой комбинированной вакцины этого изобретения с дополнительным антигеном вируса или микроорганизма, патогенного в отношении жвачных животных, антителом против указанного антитела или генетической информацией, кодирующей иммуногенный полипептид указанного вируса или микроорганизма.

Таким образом, одной даже более предпочтительной формой этого варианта осуществления является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой эта вакцина содержит дополнительный антиген вируса или микроорганизма, патогенный в отношении жвачных животных, антитело против указанного антитела или генетическую информацию, кодирующую иммуногенный полипептид указанного вируса или микроорганизма.

Наиболее обычными патогенными вирусами и микроорганизмами, патогенными для жвачных животных, являются ротавирус крупного рогатого скота, герпесвирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа Типа 3, парамиксовирус крупного рогатого скота, вирус синего языка овец, вирус ящура, Pasteurella haemolytica и респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота.

Таким образом, еще более предпочтительной формой этого изобретения является комбинированная вакцина по этому изобретению, в которой этот вирус или микроорганизм, патогенный в отношении жвачных животных, выбран из группы, состоящей из ротавируса крупного рогатого скота, герпесвируса крупного рогатого скота, вируса парагриппа Типа 3, парамиксовируса крупного рогатого скота, вируса синего языка овец, вируса ящура, Pasteurella haemolytica и респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота.

Дополнительным антигеном вируса или микроорганизма может быть цельный вирус или микроорганизм (в живой аттенуированной форме или в инактивированной форме) или иммуногенный полипептид или другая иммуногенная часть этого вируса или микроорганизма, такая как, например, (липо-)полисахарид, способный индуцировать защитную иммунную реакцию.

Вакцины, содержащие живые аттенуированные вирусы, должны храниться при низкой температуре или они должны находиться в лиофилизированной форме. Лиофилизированные вакцины могут храниться в умеренно-охлаждающих условиях или даже при комнатной температуре. Часто эту вакцину смешивают со стабилизаторами, например, для защиты склонных к деградации белков от деградации, для увеличения срока хранения вакцины или для улучшения эффективности лиофилизации. Подходящими стабилизаторами являются i.a. SPGA, углеводы, например, сорбит, маннит, трегалоза, крахмал, сахароза, декстран или глюкоза, белки, такие как альбумин или казеин или продукты их деградации, и буферы, такие как фосфаты щелочных металлов.

Таким образом, предпочтительно комбинированная вакцина по этому изобретению находится в лиофилизированной форме.

Кроме того, эта вакцина может быть суспендирована в физиологически приемлемом разбавителе. Такими буферами могут быть, например, стерильная вода, буфер и т.п.

Само собой разумеется, что разбавители и соединения для эмульгирования или стабилизации вирусов также воплощены в данном изобретении.

Подходящее количество каждого из BVDV в комбинированной вакцине, в соответствии с этим изобретением, может быть между 10²- и 10⁸-TCID₅₀, в зависимости от уровня аттенуации используемого вируса. Литература, цитируемая выше, и сообщения в данной области могут дать квалифицированному в данной области специалисту обильные рекомендации для определения количества необходимого вируса. В случае использования вакцинных штаммов на основе существующих, коммерчески доступных (ср) штаммов BVDV, содержащих аттенуирующую делецию, такую как делеция N^pro-гена и/или E^rns-гена, инструкции изготовителя могут быть достаточными для определения количества вируса, которое должно быть использовано.

Эмпирически, например, для (cp) BVDV-штаммов, несущих мутацию в N^pro- и/или E^rns-гене, количество 10⁵ TCID₅₀ могло бы быть очень подходящим количеством вируса.

Комбинированные вакцины по этому изобретению могут быть введены посредством известных способов введения. Такие способы предусматривают i.a. интраназальный, внутримышечный, внутривенный, интрадермальный, пероральный и подкожный способы.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к BVDV для применения в качестве лекарственного средства.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к BVDV для применения в лечении вирусной диареи крупного рогатого скота.

Еще один вариант осуществления этого изобретения относится к способам получения вакцины по этому изобретению, включающим стадию смешивания BVDV, принадлежащего к первому Типу, где этот BVDV является химерным BVDV, дополнительно несущим ген Е2 второго Типа BVDV, и фармацевтически приемлемого носителя.

Наконец, другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам получения комбинированной вакцины согласно этому изобретению, включающим стадию смешивания первого BVDV, принадлежащего к первому Типу, второго BVDV, также принадлежащего к первому Типу и несущего ген Е2 BVDV этого первого Типа, и фармацевтически приемлемого носителя.

Краткое описание чертежей

Фигура 1: Схематическое представление генома BVDV и конструирования pBVDV-1b synth ΔN^pro.

Фигура 2: Схематическое представление генома BVDV и констуирования полноразмерного pBVDV-1b_synth.

Фигура 3: Схематическое представление генома BVDV и констуирования химерных конструктов E2/E1E2 на основе pBVDV-1b_synth.

Фигура 4: IF-анализ коровьих клеток (KOP-R), трансфицированных in vitro транскрибированной РНК этих синтетических кДНК-конструктов.

Фигура 5: NS3-блокирующий анализ ELISA BVDV.

Фигура 6: Анализ нейтрализации BVDV.

Ссылки

Meyers, G., Tautz, N., Becher, P., Thiel, H. J., und Kummerer, B. M. (1996). Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhoea viruses from cDNA constructs. J. Virol. 70, 8606-8613.

Geiser, M., Cebe, R., Drewello, D. and Schmitz, R. (2001). Integration of PCR fragments at any specific site within cloning vectors without the use of restriction enzymes and DNA ligase. Biotechniques 31, 88-90, 92.

Wolfmeyer, A., Wolf, G., Beer, M., Strube, W., Hehnen, H.R., Schmeer, N. and Kaaden, O.R. (1997). Genomic (5'UTR) and serological differences among German BVDV field isolates. Arch. Virol. 142, 2049-2057.

Примеры

Пример 1

Конструирование синтетических клонов BVDV

1. Введение

Вирус BVDV типа 1b синтезировали полностью на основе синтетического конструкта. Эта последовательность сходна с опубликованной последовательностью штамма-прототипа BVDV 1b "CP7" и опубликованной полноразмерной последовательностью плазмиды pA/BVDV CP7 (Meyers et al. 1996; Genbank Accession no U63479), однако, были включены существенные изменения и адаптации. Кроме того, два рекомбинантных вируса конструировали на основе этого синтетического клона: Npro делетированный вирус, а также химерный вирус, экспрессирующий Е2 BVDV типа 2 вместо исходного BVDV 1b E2.

Данные для конструирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro

Плазмиды амплифицировали в клетках Escherichia coli DH10B™ (Invitrogen). Плазмидную ДНК очищали с использованием Qiagen Plasmid Mini или Midi Kit. Расщепление рестрикционными ферментами и процедуры клонирования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Секвенирование проводили с использованием Big Dye® Terminator v1.l Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems). Нуклеотидные последовательности считывали с использованием автоматического секвенатора (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems) и анализировали с использованием программы Genetics Computer Group software version 11,1 (Accelrys Inc., San Diego, USA). Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (Stratagene) и Phusion PCR (фьюжн ПЦР) (Geiser et al, 2001), соответственно.

Праймеры для мутагенеза синтезировали с использованием MWG-Biotech и biomers.net GmbH и они перечислены в таблице 1.

а нуклеотиды, отличающиеся от последовательности BVDV-1 СР7 (Accession no. U63479), подчеркнуты;последовательности BVDV-2 CS8644 (неопубликованные) представлены курсивом b положение нуклеотида, соответствующее последовательности BVDV CP7 c положение нуклеотида, соответствующее pBVDV-1b_synth_ΔNpro

pBVDV-1b_synth_N^pro состоял из пяти плазмид, несущих фрагменты синтетической последовательности (1. фрагмент_pGA15, 2. фрагмент_pMA, 3. фрагмент_pMK, 4. фрагмент_pMA, Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ), которые, все, синтезировали in vitro при помощи GENEART AG (Regensburg, Germany). С использованием этих синтетических фрагментов и их уникальных сайтов рестрикции, генерировали один полноразмерный конструкт плазмиды. Расщепления рестриктазами и процедуры клонирования выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Эти синтетические фрагменты последовательностей описаны ниже. Конструирование инфекционного кДНК-клона pBVDV-1b_synth_ΔN^pro показано на фигуре 1. Местоположение сайтов рестрикции и положения нуклеотидов, соответствующие геному BVDV (наиболее сходным штаммом является CP7), указаны стрелками.

1. фрагмент_pGA15 содержит нуклеотиды 1-3357 (сайт Acc65I), соответствующие BVDV1bΔN^pro. При 5'-NTR добавляли последовательность промотора T7 для возможности транскрипции in vitro, а также сайты SnaBI и NheI. Второй сайт Acc65I²⁰⁰⁷ удаляли молчащей мутацией GGTACC в ATATCC.

2. фрагмент_pMA содержит нуклеотиды 3357-6228 (сайт BlpI).

3. фрагмент_pMK содержит нуклеотиды 6288-7956 (сайт BstBI).

4. фрагмент_pMA содержит нуклеотиды 7956-11816 (сайт SmaI). Второй сайт BstBI⁷⁹⁶⁵ удаляли молчащей мутацией TTCGAA в TTCGAG.

Syn_BsaI фрагмент_pMK_RQ содержит нуклеотиды 11244-11816 (сайт SmaI) с 3'-NTR и сайтом SmaI для линеаризации плазмидной ДНК перед транскрипцией in vitro.

Для генерирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro плазмиду-носитель расщепляли SmaI и дефосфорилировали и элюировали после электрофореза в агарозном геле.

1. Фрагмент pMA расщепляли SnaBI и SmaI и этот специфический вирусный фрагмент выделяли. Оба фрагмента лигировали с получением плазмиды pAFr1. После этого, плазмиду pA_FrI линеаризовали с использованием Acc65I и BlpI и фрагмент Acc65I³³⁵⁷-BlpI⁶²²⁸, выделенный из плазмиды. 2._фрагмент_pMA, инсертировали с получением плазмиды pA_Fr1/2. Плазмиду pMA_Fr3/4 генерировали лигированием расщепленной NheI и BstB1⁷⁹⁵⁶ плазмидой 4.фрагмент_pMA и фрагмент BlpI^662S/BstBI1⁷⁹⁵⁶ выделяли из плазмиды 3.фрагмент рМК. Затем эту плазмиду расщепляли BlpI1^662S/SmaI¹¹⁸¹⁶ и полученный фрагмент BlpI^662S/SmaI¹¹⁸¹⁶ лигировали в BlpI^662S/SmaI плазмиду pA_Fr1/2. В полученной плазмиде pAFr1/2/3/4 фрагмент BsaI заменяли фрагментом BsaI, выделенным из плазмиды Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ, с получением полноразмерного кДНК-конструкта pAFr1/2/3/4/5. Для генерирования потомства инфекционного вируса две мутации, G²⁰¹¹T и G⁹⁹⁴⁸T инсертировали сайт-направленным мутагенезом с получением инфекционного полноразмерного кДНК-конструкта pBVDV-1b_synth_ΔN^pro.

Конструирование pBVDV-1b_synth

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth конструировали на основе pBVDV-1b_synth_ΔN^pro инсертированием Acc65I/³¹⁹³ XhoI²⁰⁸-фрагмента плазмиды pBVDV-1b_deltaNS (нуклеотиды 1-4597), в pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (фигура 2). Для этой цели эту плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro расщепляли Acc65I³³⁵¹ и XhoI²³¹ и лигировали c фрагментом Acc65I³¹⁹³ pBVDV-1bdeltaNS.

Конструирование pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2 является химерным конструктом BVDV-1b/BVDV-2, который генерировали заменой геномного района, кодирующего Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотидов 2009-3130), геномным районом, кодирующим Е2 BVDV-2 (изолятом CS8644; Wolfmeyer et al., 1997).

Химерный клон пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е2 конструировали с использованием Phusion PCR (Фигура 3а). В первой стадии генерировали Е2-мегапраймер при помощи ПЦР с использованием праймеров Ph-E2CS_F и Ph_E2CS_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS, которая содержит кодирующий Е1 и Е2 геномный район изолята CS8644 BVDV-2. Во второй ПЦР, Phusion-PCR, E2-CS8644-последовательности вводили в полноразмерную плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro с использованием E2-мегапраймера и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_в качестве матрицы.

Конструирование pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2

Полноразмерный кДНК-клон BVDV pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2 является химерным конструктом BVDV-1b/BVDV-2, который генерировали заменой геномного района, кодирующего Е1 и Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотидов 1424-3130), геномным районом, кодирующим Е1 и Е2 BVDV-2 (изолятом CS8644; Wolfmeyer et al., 1997).

Химерный клон пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_Е1-Е2 конструировали с использованием Phusion PCR (Фигура 3b). В первой стадии генерировали Е1-Е2-мегапраймер при помощи ПЦР с использованием праймеров Ph-E2CS_F и Ph_E2CS_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS. При помощи Phusion-PCR, Е1- и E2-CS8644-последовательности вводили в полноразмерную плазмиду pBVDV-1b_synth_ΔN^pro с использованием Е1-E2-мегапраймера и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_в качестве матрицы.

Фиг. 1: Схематическое представление генома BVDV и конструирования pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV_Е2. Этот вирусный геном синтезировали в пяти фрагментах (Geneart AG), 1.фрагмент_pGA15, 2.фрагмент_pMA, 3.фрагмент_pMK, 4.фрагмент_pMA и Syn_BsaI_фрагмент_pMK_RQ (светло-синие боксы). Плазмида 1.фрагмент_pGA15 несет N^pro делецию (ΔΝ^ρro). В 5'-NTR добавляли T7-промотор для обеспечения возможности транскрипции in vitro. Для линеаризации плазмиды вводили сайт рестрикции SmaI на 3'-NTR. Местоположение сайтов рестрикции и положения нуклеотидов, соответствующих геному BVDV_1bN^pro (наибольшее сходство со штаммом СР7 BVDV), указаны короткими черными стрелками. Полноразмерный кДНК-конструкт pBVDV-1b_synth_ΔN^pro конструировали исключительно из пяти синтезированных фрагментов, показанных серыми стрелками и темно-синими боксами. Для этого конструирования не использовали вирусной РНК или кДНК.

Стадии мутагенеза in vitro во время этого конструирования указаны звездочками. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; С, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2-NS5, неструктурные белки.

Фиг. 2: Схематическое представление генома BVDV и конструирование полноразмерного pBVDV-1b_synth. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; C, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2 - NS5, неструктурные белки. Полноразмерный кДНК-конструкт pBVDV-1b_synth конструировали инсертированием Acc65I/³⁷⁹³ XhoI²⁰⁸-фрагмента плазмиды pBVDV-1bdeltaNS, которая содержит части последовательности BVDV-1b фрагмента (нуклеотиды 1-4597), включающие в себя Npro кодирующий геномный район, в pBVDV-1b_synth_ΔN^pro.

Фиг. 3: Схематическое представление генома BVDV и конструирование химерных конструктов E2/E1E2 на основе pBVDV-1b_synth. Затененные боксы представляют район структурного белка BVDV. Линии на левом и правом концах указывают нетранслируемые районы. N^pro, аутопротеаза; C, капсидный белок; E^rns, E1, E2, белки оболочки; p7, NS2-NS5, неструктурные белки. Химерные клоны пестивируса pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_E2 (a) и pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV-2_E1E2 (b) конструировали с использованием полноразмерного кДНК-клона pBVDV-1b_synth_ΔN^pro. Геномный район, кодирующий Е2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотиды 2009-3130) и E1 и E2 pBVDV-1b_synth_ΔN^pro (нуклеотиды 1424-3130), соответственно, заменяли соответствующим геномным районом изолята BVDV-2 CS8644 (Wolfmeyer et al., 1997) при помощи Phusion PCR с использованием праймеров Ph_E1_F и Ph_E2_R. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pGEM_E1E2_CS, которая содержит кодирующий E1 и E2 геномный район изолята CS8644 BVDV-2.

Фиг. 4: IF-анализ коровьих клеток (KOP-R), трансфицированных in vitro-транскрибированной РНК этих синтетических кДНК-конструкций. Для детектирования белков BVDV использовали белки моноклональных антител C16 (анти-NS3, Institute for Virology, TiHo Hannover), WB215 (анти-E2 BVDV-1, CVL, Weybridge), BA-2 (VMRD) и WB210 (анти-E^rns, CVL, Weybridge).

Культура клеток и размножение вируса

Клетки и вирусы выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% не содержащей BVDV эмбриональной коровьей сывороткой, при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО₂. pBVDV-1b_synth_ΔN^pro_BVDV_Е2 размножали на исходных клетках MDBK или интерферон-некомпетентных клетках MDBK (Rie728; CCLV), обеспечиваемых Gunther Keil, FLI, Insel Riems. Титры вируса определяли по конечным точкам титрований. Клетки, засеянные в микротитрационных планшетах, инфицировали 10-кратными серийными разведениями осветвленных супернатантов. Титры, выраженные в TCID₅₀ на миллилитр, получали иммунофлуоресцентным окрашиванием этих культур с моноклональным антителом (mAb) C16, направленным против пестивирусного белка NS3 (любезно предоставленного Institute of Virology, TiHo, Hannover, Germany), и Alexa Fluor^®488-конъюгированного фрагмента F(ab')₂ козьего антимышиного IgG (Molecular Probes, Leiden, The Netherlands). Препараты вируса тестировали на отсутствие N^pro и микоплазмы.

In vitro транскрипция и РНК-трансфекция

In vitro транскрипцию синтетических полноразмерных кДНК-конструктов выполняли с использованием системы широкомасштабного получения РНК T7 RiboMax Large-Scale (Promega) в соответствии с инструкциями изготовителя после линеаризации этой плазмиды SmaI. Количество РНК определяли окрашиванием этидийбромидом после электрофореза в агарозном геле. Для трансфекции РНК коровьи клетки отделяли с использованием раствора трипсина, промывали дважды забуференным фосфатным буфером солевым раствором без Ca++/Mg++ (ЗФР-) и смешивали с 1-5 мкг in vitro синтезированной РНК. Электропорацию выполняли с использованием ячейки трансфекции GenePulser (Biorad) (два импульса при 850 В, 25 мкФ и 156 ω).

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Культуры клеток фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) и делали проницаемыми окрашиванием 0,01% дигитонином (IF окрашиванием NS3) или фиксировали/делали проницаемыми 80% ацетоном (E^rns, E2) и инкубировали с подходящим рабочим разведением соответствующих антител в течение 30 минут. После одной стадии промывки ЗФР клетки инкубировали с Alexa⁴⁸⁸-конъюгированным вторым антителом в течение 30 минут и в конце концов промывали. IF анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus).

Пример 2

Испытание вакцинации-заражения CP7 ΔN^pro

Схема СР ΔN^pro экспериментального дизайна испытания 1 животных

Не имеющих BVDV телят (n=4 на группу) вакцинировали или псевдовакцинировали и спустя 52 дня выполняли инфицирование штаммом SE5508 BVDV типа 1b (Wolfineyer et al., 1997).

Вакцинация: единственное применение 6,7 log₁₀ TCID₅₀ BVDV CP7 ΔN^pro i.m. (5 мл)

Псевдовакцинация: супернатант культуры неинфицированных клеток i.m. (5 мл)

Провокационное инфицирование: 6,5 log₁₀ TCID₅₀ BVDV SE5508 (Ib) i.n., распылитель, 2 мл

Результаты

Лейкоциты очищали из ЭДТА-крови после щелочного лизиса эритроцитов.

100 мкл жидкости мазка или 3×10⁶ лейкоцитов инокулировали на коровьи клетки в 4 повторностях. Спустя 5-6 дней сокультивирования репликацию вируса проверяли непрямым иммунофлуоресцентным тестированием (IIFT). Выполняли один дополнительный слепой пассаж этих супернатантов (6 д → IIFT).

В 1 из 4 телят детектировали клеточно-связанную виремию. Низкие количества CP7 ΔΝ^ρro могли быть изолированы в день 4 после вакцинации после первого пассажа культуры клеток. Не была зарегистрирована назальная экскреция вакцинного вируса.

После провокационного инфицирования, не детектировали выделения из носа BVDV SE5508 у вакцинированных животных. Все вакцинированные животные были полностью защищены против виремии, и ни один провокационный вирус не был повторно выделен из очищенных лейкоцитов ("стерильный иммунитет").

В противоположность этому, все контрольные телята обнаруживали назальную экскрецию BVDV в течение 6-8 дней, а также клеточно-связанную виремию во время 6-8 дней.

После вакцинации все животные, иммунизированные CP7 ΔΝ^ρro, обнаруживали умеренное снижение количества лейкоцитов с возвращением до величин перед вакцинацией до 7 дней после инокуляции.

После провокационного инфицирования не наблюдали значимого уменьшения лейкоцитов у иммунизированных телят. Среднее количество клеток крови оставалось в пределах физиологического диапазона. У контрольных животных наблюдали заметную лейкопению с появлением при 3 днях после провокации. Средние количества лейкоцитов оставались низкими в течение более 2 недель.

В сравнении с температурами перед вакцинацией, регистрировали только слабое повышение ректальной температуры тела.

После провокационного инфицирования, иммунизированные животные не обнаруживали изменений температурных кривых. Что касается температурной реакции, эти животные явно были защищены от клинической BVD.

У всех контрольных телят появлялось умеренное повышение температур при 3 днях после инокуляции. После периода, большего, чем одна неделя, температуры тела возвращались к уровням перед провокационным введением.

Всех животных подвергали мониторингу на измененные общие состояния и респираторные или желудочно-кишечные симптомы, типичные для BVDV.

На протяжении всего дня периода наблюдения (4 недели перед иммунизацией до 12 недель после этого), в этих вакцинированных животных наблюдали чередующиеся мягкие респираторные симптомы, такие как выделения из носа и спорадический кашель. После вакцинации не наблюдали вредных клинических реакций. У этих вакцинированных животных не наблюдали обострения в баллах в сравнении с оценками перед вакцинированием.

После провокационного инфицирования, эти иммунизированные животные не обнаруживали клинических симптомов. У контрольных телят регистрировали слабые респираторные симптомы, и прием пищи уменьшался в течение 1-2 дней. Эти животные не обнаруживали ни желудочно-кишечных нарушений, ни повреждений слизистой оболочки.

Серологические реакции этих животных подвергали мониторингу с использованием BVDV ELISA (NS3-блокирование; Фигура 5), а также специфического в отношении BVDV типа I и типа II анализа нейтрализации (Фигура 6).

Все животные, инокулированные CP7 ΔΝ^ρro, сероконвертировались в отношении BVDV NS3-специфических антител до 3 недель после вакцинации, как тестировали при помощи Ceditest BVDV ELISA (Cedi diagnostics). Контрольные телята оставались отрицательными до 2-3 недель после провокационного инфицирования (Фигура 5).

После вакцинации, все животные развивали нейтрализующие антитела против BVDV типа I при умеренных титрах (Фигура 6). После провокационного инфицирования (с), эти иммунизированные животные не обнаруживали усиленного бустер-эффек