Лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний

Лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для эффективного лечения и профилактики различных инфекционных вирусных заболеваний, включая профилактику инфицирования ВИЧ, профилактику и лечение заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, лечение острых и хронических вирусных инфекционных заболеваний, таких как острый вирусный гепатит A, B, C и другие вирусные гепатиты, герпесвирусная инфекция, грипп различных типов и острые респираторные вирусные инфекции, а также для эффективного лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных различными возбудителями, например, псевдотуберкулеза, коклюша, иерсиниоза, пневмонии различной этиологии и т.д.

Из уровня техники известно лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний, в том числе вирусной этиологии, на основе активированной формы сверхмалых доз антител к интерферону (RU 2192888 C1, A61K 39/395, 20.11.2002). Однако данное лекарственное средство имеет ограниченные терапевтические возможности и малопригодно для лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ, острых и хронических вирусных инфекций, включая вирусные гепатиты различных типов и герпесвирусные инфекции, а также для лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных различными возбудителями, например псевдотуберкулеза, коклюша, иерсиниоза, пневмонии различной этиологии

Изобретение направлено на создание лекарственного средства для эффективного лечения и профилактики широкого спектра различных вирусных инфекционных заболеваний, в том профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, лечения острых и хронические вирусных инфекций, включая острый вирусный гепатит A, B, C и другие вирусные гепатиты, герпесвирусную инфекцию, а также для эффективного лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных различными возбудителями, например псевдотуберкулеза, коклюша, иерсиниоза, пневмонии различной этиологии.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний, согласно изобретению, содержит активированную потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека в сочетании с активированной потенцированной формой антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов.

При этом активированную потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов используют в виде гомеопатически активированного потенцированного водного или водно-спиртового раствора, активность которого обусловлена процессом многократного разведения матричного раствора соответствующих антител в водном или водно-спиртовом растворителе в сочетании с внешним механическим воздействием каждого разведения.

Кроме того, лекарственное средство может быть выполнено в твердой лекарственной форме и содержать эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного активированной потенцированной формой антител к гамма-интерферону человека и активированной потенцированной формой антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов, и фармацевтически приемлемые добавки.

При этом водные или водно-спиртовые растворы гомеопатически активированных потенцированных форм антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов получены путем многократного последовательного разведения и промежуточного внешнего воздействия из соответствующих матричных аффинно очищенных антител с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.

Причем каждый из компонентов используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, гомеопатических разведений.

При выполнении лекарственного средства в твердой лекарственной форме фармацевтически приемлемые добавки включают лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Лекарственное средство, содержащее активированную потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов используют для лечения вирусных инфекционных заболеваний, в том числе для профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа; для лечения различных вирусных гепатитов; для лечения хронического вирусного гепатита С; для лечения герпесвирусной инфекции; для лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа; для лечения острых респираторных вирусных инфекций.

Кроме того, лекарственное средство, содержащее активированную потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов используют для лечения бактериальных инфекционных заболеваний, вызванных различными возбудителями, в том числе для лечения псевдотуберкулеза, коклюша, иерсиниоза, пневмонии различной этиологии.

Заявленное лекарственное средство является комплексным и может содержать действующие компоненты в равном объемном соотношении, при этом каждый компонент может быть приготовлен в виде смеси из трех соответствующих матричных растворов, разведенных, соответственно, в 100¹², 100³⁰, и 100⁵⁰ (или 100²⁰⁰) раз, что эквивалентно сотенным разведениям C12, C30, C50 (или C200), приготовленным по гомеопатической технологии.

Заявленное лекарственное средство рекомендуется принимать, предпочтительно, по 1-3 таблетке 2-6 раз в день (предпочтительно 2-4 раза в день).

Предложенное сочетание активированных потенцированных форм антител к гамма-интерферону человека и антител к CD4 рецептору Т-лимфоцитов обеспечивает получение неожиданного синергетического терапевтического эффекта, экспериментально подтвержденного на адекватных моделях, который заключается в повышении эффективности терапевтического воздействия и снижение вирусной нагрузки как при профилактике инфицирования ВИЧ, так и при профилактике и лечении заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа, а также и при лечения острых и хронических вирусных заболеваний, включая герпес, острый вирусный гепатит A, B, C и другие вирусные гепатиты, грипп различных типов и острые респираторные вирусные инфекции, а также при лечении и профилактики бактериальных инфекций, вызванных различными возбудителями, например, псевдотуберкулеза, коклюша, иерсиниоза, пневмонии различной этиологии. При этом заявленное лекарственное средство расширяет арсенал средств, предназначенных для дл эффективного лечения и профилактики широкого спектра различных вирусных инфекционных заболеваний, а также для эффективного лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных различными возбудителями,

Возможно применение заявленного лекарственного средства в комплексной терапии в сочетании с другими противовирусными препаратами, противобактериальными препаратами и симптоматическими средствами.

Заявленное лекарственное средство готовят, преимущественно, следующим образом.

Для приготовления активированной потенцированной формы действующих компонентов используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с. 9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol. 14. - N 1-2. P. 33-55.

Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном или конъюгированным антигеном, например, гамма-интерфероном человека, CD4 рецептором. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.

Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридомных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного средства является использование поликлональных антител, которые в качестве матричного (исходного) раствора с концентрацией, предпочтительно, 0,5÷5,0 мг/мл, применяют для последующего приготовления активированной потенцированной формы.

Предпочтительной для приготовления каждого компонента является использование смеси трех водных или водно-спиртовых разведений первичного матричного раствора антител, разведенных, соответственно, в 100¹², 100³⁰ и 100⁵⁰ (или 100²⁰⁰) раз, что эквивалентно сотенным разведениям C12, C30 и C50 (или C200), приготовленным по гомеопатической технологии.

При приготовлении заявленного лекарственного средства в твердой лекарственной форме на нейтральный носитель наносится смесь указанных компонентов.

Для получения поликлональных антител к гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов используют адъювант и, например, цельную молекулу гамма-интерферона человека следующей последовательности:

1 MKYTSYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA GHSDVADNGT LFLGILKNWK

61 EESDRKIMQS QIVSFYFKLF KNF KDDQSIQ KS VETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN

121 YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAAKTG KRKRSQMLFR GRRASQ.

Возможно для получения поликлональных антител к гамма-интерферону человека в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов использование адъюванта и, например, одного полипептидного фрагмента гамма-интерферона человека, выбранного из следующих последовательностей:

7-55:

ILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLKKYFNA GHSDV;

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQIVSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKAIHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGR RASQ;

24-166:

QDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKAIHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGR RASQ;

69-123:

QS QIVSFYFKLF KNFKDDQSIQ KSVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSV;

100-145:

M NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR KAIHELIQVM AELSP;

92-130:

SVETIKEDM NVKFFNSNKK KRDDFEKLTN YSVTDLNVQR;

123-147:

VTDLNVQR KAIHELIQVM AELSPAA;

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKA IHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFQGR RASQ;

5-45:

SYILAF QLCIVLGSLG CYCQDPYVKE AENLK;

94-114:

ETIKEDM NVKFFNSNKK KRDD;

24-166:

MQDPYVKEAE NLKKYFNAGH SDVADNGTLF LGILKNWKEE SDRKIMQSQI VSFYFKLFKN FKDDQSIQKS VETIKEDMNV KFFNSNKKKR DDFEKLTNYS VTDLNVQRKAIHELIQVMAE LSPAAKTGKR KRSQMLFRGR RASQ.

Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°C) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000 g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Можно добавлять к антисыворотке 20% NaN₃ до конечной концентрации 0,02% и хранить до использования в замороженном состоянии при температуре -20°C (или без добавления NaN₃ - при температуре -70°).

Выделение из антисыворотки антител к гамма-интерферону возможно следующим образом:

1) 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 M NaCl добавляют 6,26 г Na₂SO₄, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;

2) выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;

3) после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;

4) фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.

Очистку антител производят методом аффинной хроматографии на колонке с антигеном, путем связывания антител к гамма-интерферону с антигеном (гамма-интерферон), прикрепленным к нерастворимому матриксу колонки, с последующим элюированием антител концентрированными растворами соли.

Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к гамма-интерферону человека, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (исходного) раствора для последующего приготовления активированной потенцированной формы.

Поликлональные антитела к CD4 рецептору получают по вышеуказанному способу, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и молекулу CD4 рецептора следующей аминокислотной последовательности:

26-458:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGDTVELT CTASQKKSIQ FHWKNSNQIK ILGNQGSFLT KGPSKLNDRA DSRRSLWDQG NFPLIIKNLK IEDSDTYICE VEDQKEEVQL LVFGLTANSD THLLQGQSLT LTLESPPGSS PSVQCRSPRG KNIQGGKTLS VSQLELQDSG TWTCTVLQNQ KKVEFKIDIV VLAFQKASSI VYKKEGEQVE FSFPLAFTVE KLTGSGELWW QAERASSSKS WITFDLKNKE VSVKRVTQDP KLQMGKKLPL HLTLPQALPQ YAGSGNLTLA LEAKTGKLHQ EVNLWMRAT QLQKNLTCEV WGPTSPKLML SLKLENKEAK VSKREKAVWV LNPEAGMWQC LLSDSGQVLL ESNIKVLPTW STPVQPMALI VLGGVAGLLL FIGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI.

Возможно для получения поликлональных антител к CD4 рецептору в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов использование адъюванта и, например, одного полипептидного фрагмента CD4 рецептора, выбранного из следующих последовательностей:

412-458:

IGLGIFFCV RCRHRRRQAE RMSQIKRLLS EKKTCQCPHR FQKTCSPI;

26-60:

MNRGVPFRHL LLVLQLALLP AATQGKKVVL GKKGD;

105-119:

A DSRRSLWDQG NFPL;

115-139:

G NFPLIIKNLKIEDSDTYICE VEDQ.

Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного средства является использование буферных растворов поликлональных антител к гамма-интерферону человека и к CD4 рецептору Т-лимфоцитов с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, которые в качестве матричного (первичного) раствора используют для последующего приготовления активированной потенцированной формы.

Активированную потенцированную форму каждого компонента готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части каждого подвергаемого разведению раствора, начиная с упомянутого матричного раствора, в 9 частях (для десятичного разведения D) или в 99 частях (для сотенного разведения C) или в 999 частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя в сочетании с многократным вертикальным встряхиванием (потенцированием, или "динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции-кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с. 14-29).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Например, для приготовления 12-го сотенного разведения C12 одну часть матричного (исходного) раствора антител, например, к гамма-интерферону человека, с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают потенцируют, получая 1-е сотенное C1 разведение. Из 1-го сотенного C1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение C2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение C12. Таким образом, 12-е сотенное разведение C12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно 12 раз в разных емкостях 1-ой части исходного матричного раствора антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, полученный разведением матричного раствора в 100¹² раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений C30 и C50 или C200.

При использовании, например, активированной потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека в виде смеси различных, преимущественно сотенных, разведений каждое разведение (например, C12, C30, C50) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до разведения на 3 разведения меньше, чем конечное (соответственно, до получения C9, C27, C47), и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). Далее полученную смесь последовательно дважды разводят в соотношении 1 к 100, потенцируя полученный раствор после каждого разведения. При этом получают активированную потенцированную форму антител, например, к гамма-интерферону человека в сверхмалой дозе, полученной разведением матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных разведений C12, C30, C50.

Возможно использование каждого компонента в виде смеси других различных, разведений, например, десятичных и или сотенных, (D20, C30, C100 или C12, C30, C200 и т.д.), приготовленных по гомеопатической технологии, эффективность которых определяют экспериментально.

Для получения лекарственного средства водные или водно-спиртовые растворы смешивают, преимущественно, в равном объемном соотношении и используют в жидкой лекарственной форме.

Заявленное лекарственное средство может быть использовано и в твердой лекарственной форме в виде фармацевтической композиции, которая содержит технологически необходимое (эффективное) количество нейтрального носителя - например, лактозы - насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью, приготовленных по вышеуказанной технологии, водных или водно-спиртовых растворов активированных потенцированных форм антител, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие, преимущественно, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.

Получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Hüttlin Pilotlab» производства компании Hüttlin GmbH) путем орошения до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 50÷500 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором активированной потенцированной формы антител компонентов, преимущественно, в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5-1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°C. Расчетное количество 10÷34 масс частей высушенных гранул, насыщенных активированной потенцированной формой антител, загружают в смеситель и смешивают с 25÷85 масс. частей от общей массы загрузки «ненасыщенной» чистой лактозы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия). Затем в эту смесь добавляют стеарат магния в количестве 0,1÷1 масс. частей от общей массы загрузки и микрокристаллическую целлюлозу в количестве 3÷10 масс. частей от общей массы загрузки, с формированием круглых таблеток массой 150÷500 мг, преимущественно массой 300 мг, пропитанных водно-спиртовым раствором (3,0-6,0 мг/табл.) активированной потенцированной формы в сверхмалой дозе каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100¹², в 100³⁰ в 100⁵⁰ (или 100²⁰⁰) раз, что эквивалентно смеси сотенных разведений C12, C30 и C50 (или C200), приготовленных по гомеопатической технологии.

Для проведения экспериментальных исследований были использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной биотехнологической фирмой.

Пример 1

Оценка антиретровирусной активности заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹⁰, 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 и активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону-гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 в соотношении 1:1 (СМД AT к CD4 + ИФН-γ), а также лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100, 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД AT к CD4) и лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5, мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД AT к ИФН-γ), проводилась с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-LAI. В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (Sigma - AZ169-100 mg, лот 107K1578).

Мононуклеары периферической крови человека были выделены из крови здорового серонегативного донора при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Клетки активировали в течение 3 дней с использованием 1 мкг/мл фитогемагглютина P, и 5 МЕ/мл рекомбинантного интердейкина-2 человека в среде RPMI1640 (DIFCO) с 10% фетальной телячьей сывороткой (комплемент был удален нагреванием в течение 45 минут при температуре 56°C), 1% раствором антибиотиков (PSN Gibco, содержащего 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина).

Клетки заражали штаммом ВИЧ-1-LAI, внося 50 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-LAI, что соответствует дозе 100 TCID50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунки через 15-30 минут после заражения клеток штаммом ВИЧ-1-LAI. На 7 сутки после инфицирования клеток был собран супернатант, использованный для оценки влияния препаратов на ингибирование репликации ВИЧ.

Перед внесением в лунки, содержащие 150 мкл клеточной культуры, препараты разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 50 мкл. Препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 8 раз (степень разведения 1/8), а препарат СМД AT к CD4 + ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 4 раза (степень разведения 1/4). Таким образом, количество компонентов препарата СМД AT к CD4 + ИФН-γ, вносимых в экспериментальную лунку при тестировании, идентично количеству компонентов препарата СМД AT к CD4 и компонентов препарата СМД AT к ИФН-γ а тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности препарата СМД AT к CD4 + ИФН-γ с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Препарат сравнения азидотимидин развели средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения концентрации 8 нМ.

Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которую оценивали по ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ в супернатантах мононуклеаров периферической крови человека с использованием FIV RT RetroSys набора производства INNOVAGEN (лот 10-059C). Для вычисления % ингибирования репликации ВИЧ в качестве контроля использовали супернатант клеток, к которым не вносили тестируемые препараты или азидотимидин (Таблица 1).

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4 + ИФН-γ превосходит антиретровирусную активность препарата СМД AT к CD4 и препарата ИФН-γ.

Пример 2

Оценка антиретровирусной активности заявленного комплексного лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 и активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону-гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 в соотношении 1:1 (СМД AT к CD4 + ИФН-γ), а также лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к CD4 рецептору в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД AT к CD4) и лекарственного средства, содержащего активированные потенцированные формы водных разведений поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к интерферону гамма в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора (концентрацией 2,5 мг/мл) в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД AT к ИФН-γ), проводилась с использованием макрофагов, полученных из мононуклеаров периферической крови человека, и зараженных in vitro штаммом ВИЧ-1-Ba-L. В качестве препарата сравнения использовали азидотимидин (Sigma - AZ169-100 mg, лот 107K1578).

Макрофаги периферической крови человека были получены из мононуклеарных клеток периферической крови человека, которые были выделены из крови двух здоровых серонегативных доноров при помощи центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипака. Мононуклеарные клетки периферической крови человека выращивали 3 суток в среде RPMI1640 (DIFCO), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (комплемент был удален нагреванием в течение 45 минут при температуре 56°C), 1% раствором антибиотиков (PSN Gibco, содержащего 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина), 15 нг/мл ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Затем клетки помещали культуральные планшеты (150000 клеток/лунка в 48-луночном планшете), выращивали в течение 7 суток совместно с 1 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл М-КСФ (макрофагальный колониестимулирующий фактор) для того, чтобы клетки смоги полностью дифференцироваться в макрофаги.

Клетки заражали штаммом ВИЧ-1-Ba-L, внося 100 мкл инокулята штамма ВИЧ-1-Ba-L, что соответствует дозе 1000 TCID50 (доза, инфицирующая 50% клеток культуры ткани).

Для оценки антиретровирусной активности препараты вносили в лунки за 24 ч до заражения клеток штаммом ВИЧ-1-Ba-L, а также на 3, 7, 10, 14, 17 день после заражения. На 3, 7, 10, 14, 17 сутки после инфицирования клеток был собран супернатант, использованный для оценки влияния препаратов на ингибирование репликации ВИЧ.

Перед внесением в лунки, содержащие 750 мкл клеточной культуры, препараты разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения конечного объема в 250 мкл. Препарат СМД AT к CD4 и препарат СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 8 раз (степень разведения 1/8), а препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ разводили в среде RPMI1640 (DIFCO) в 4 раза (степень разведения 1/4). Таким образом, количество компонентов каждого компонента в составе препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, вносимого в экспериментальную лунку при тестировании, идентично количеству компонентов в составе препарата СМД AT к CD4 и компонентов в составе препарата СМД AT к ИФН-γ, тестируемых в качестве монопрепаратов, что позволяет провести сравнение эффективности препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ с его отдельными компонентами, входящими в его состав. Препарат сравнения азидотимидин разводили средой RPMI1640 (DIFCO) до достижения концентрации 8 нМ.

Эффективность препаратов определяли по ингибированию репликации ВИЧ, которую оценивали по ферментативной активности обратной транскриптазы ВИЧ в супернатантах макрофагов периферической крови человека с использованием FHV RT RetroSys набора производства INNOVAGEN (лот 10-059C). Для вычисления % ингибирования репликации ВИЧ в качестве контроля использовали супернатант клеток, к которым не вносили тестируемые препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, препарат СМД AT к CD4, препарат СМД AT к ИФН-γ и препарат сравнения азидотимидин (Таблицы 2 и 3).

Таким образом, в условиях данной экспериментальной модели показано, что антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ превосходит антиретровирусную активность препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4; антиретровирусная активность препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ сохраняется на протяжении всего эксперимента, в отличие от антиретровирусной активности препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4; препарат СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ оказывает антиретровирусную активность на модели in vitro зараженных макрофагов периферической крови человека, полученных от разных серонегативных доноров, что свидетельствует о более выраженном антиретровирусном эффекте препарата СМД AT к CD4 + СМД AT к ИФН-γ, в отличие от препарата СМД AT к ИФН-γ и препарата СМД AT к CD4, антиретровирусная активность которых была выявлена на модели in vitro зараженных макрофагов периферической крови человека, полученных только от одного серонегативного донора.

Пример 3

Для исследования свойств заявленных лекарственных средств для лечения пациентов группы активного препарата №1 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT к ИФН-γ) и CD4 рецептору (AT к CD4) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C200 (СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4); для лечения пациентов группы активного препарата №2 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к гамма интерферону человека (AT к ИФН-γ), CD4 рецептору (AT к CD4) и гистамину (AT к H) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹²,100³⁰, 100²⁰⁰ раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C200 (СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4 + AT к H); для лечения пациентов группы активного препарата №3 были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3 мг/табл.) активированной потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к гамма интерферону человека, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе, полученной сверхразведением исходного матричного раствора в 100¹², 100³⁰, 100⁵⁰ раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений C12, C30, C50 (СМД AT к ИФН-γ).

Оценку эффективности трех препаратов, содержащих СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4, СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к H и СМД AT к ИФН-γ, в лечении хронического вирусного гепатита C (ХГС) проводили в ходе сравнительного исследования в параллельных группах с участием 18 больных (14 мужчин и 4 женщины) в возрасте от 27 до 52 лет. Диагноз ХГС подтверждали на основании профиля сывороточных маркеров - AT к HCV и HCV RNA. Все пациенты, включенные в исследование, имели 2 или 3 генотип HCV, малосимптомное медленно прогрессирующее течение ХГС с низкой активностью (менее 3-кратного повышения уровня сывороточных аминотрансфераз, или <100 ЕД/л), ни один из пациентов ранее не получал противовирусной терапии. В исследование не включались пациенты с положительным результатом серологического анализа на HIV, RW, анти-НСА, HBsAg или HBcor Ab, с циррозом печени, тяжелыми сопутствующими заболеваниями в стадии обострения, талассемией или другой гемоглобинопатией, алкогольной и/или лекарственной/наркотической зависимостью, после трансплантации органов, постоянно принимающие иммуносупрессивные препараты, беременные и кормящие ребенка грудью женщины. Пациентам первых трех групп была назначена терапия каким-либо исследуемым препаратом в дозе 1 таблетка 3 раза в день в течение 24 недель: пациентам 1 группы (n=5) - композиция СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4; 2 группы (n=4) - композиция СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к Н; 3 группы (n=4) - СМД AT к ИФН-γ Контрольную группу (№4) составили 5 пациентов с персистирующей виремией и стойко нормальными уровнями аминотрансфераз (<20 ЕД/л), которым не назначалась какая-либо терапия. В ходе исследования проводились врачебные осмотры, контроль вирусной нагрузки и лабораторных показателей, регистрировалась сопутствующая терапия, возможные нежелательные явления. В качестве критериев эффективности лечения на 24-й неделе оценивались вирусная нагрузка HCV RNA и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ).

Данные по вирусной нагрузке (числу копий HCV RNA), представленные в Таблице 4 в виде значений медианы (Me), первого и третьего квартилей (Q1, Q3), свидетельствуют о положительной ее динамике, полученной у пациентов 1-3 групп к концу 24-недельной терапии. Прием препарата СМД AT к ИФН-γ + AT к CD4 приводил к уменьшению числа копий HCV RNA у 4 из 5 человек 1 группы, при этом среднее снижение вирусной нагрузки составило 75%. Сходные показатели были получены у пациентов, которые принимали препарат СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к H в течение 24 недель: противовирусная активность регистрировалась у всех пациентов (у 4 из 4 человек группы 2), среднее снижение вирусной нагрузки составило 70%. При этом у 2 пациентов (по одному из группы 1 и группы 2) был получен полный вирусологический ответ по окончании терапии. Противовирусная активность монокомпонентного препарата СМД AT к ИФН-γ была несколько ниже, поскольку снижение числа копий HCV RNA отмечено у 3 из 4 пациентов 3 группы, среднее снижение вирусной нагрузки составило 55%. Среди участников исследования контрольной группы положительной динамики вирусной нагрузки не выявлено.

Противовирусная активность исследуемых препаратов сочеталась с положительной динамикой уровня АЛТ, которую зарегистрировали у пациентов 1-3 групп к концу 24 недель лечения. Нормализация уровня АЛТ была отмечена у 2 пациентов группы СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4, у 1 пациента группы СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к H и также у 1 пациента группы СМД AT к ИФН-γ. У 1 пациента контрольной группы на фоне увеличения вирусной нагрузки через 24 недели наблюдения показатель АЛТ превысил верхнюю границу нормы (>20 ЕД/л).

В ходе наблюдения не было выявлено каких-либо нежелательных явлений, связанных с приемом исследуемых препаратов, что свидетельствовало о хорошей их переносимости. Отсутствие патологических отклонений со стороны анализов крови и мочи, а также биохимических показателей, включая почечные и печеночные маркеры, подтверждало безопасность лечения.

Таким образом, в результате исследования были получены данные об эффективности и безопасности препаратов СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4, СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к H и СМД AT к ИФН-γ, в лечении больных с ХГС. Наиболее отчетливый противовирусный эффект отмечен у препарата СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 и СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4 + AT к Н, что подтверждалось положительной динамикой вирусной нагрузки, а также зарегистрированным у 2 пациентов полным вирусологическим ответом к концу 24 недель терапии. Противовирусная эффективность препаратов, содержащих СМД AT к ИФН-γ + АТ к CD4, С