Получение тонких слоев текучей среды, содержащей клетки для анализа

Получение тонких слоев текучей среды, содержащей клетки для анализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к устройству и способам получения тонких слоев текучей среды для анализа и к системам и способам для анализа таких тонких слоев, в особенности к способам и устройству для автоматизированного анализа образцов в картридже. Настоящее изобретение относится к устройству и способам получения тонких слоев, главным образом монослоев из клеток, таких как красные кровяные тельца, например не имеющие перекрывания красные кровяные тельца, для анализа, и к системам и способам для анализа таких тонких слоев или монослоев из клеток, главным образом к способам и устройству для автоматизированного анализа образцов в картридже.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Анализ на клеточной основе может быть проведен путем окрашивания клеток специфическим реагентом и обследованием клеточной популяции под микроскопом. Для клеточной диагностики на основе изображений, например, с использованием микроскопа, фотокамеры и программного обеспечения, используемого для анализа изображений и диагноза, важно создавать монослой из отдельных клеток во избежание неверных интерпретаций вследствие наложения клеток. Один такой способ был известен в течение многих лет и включает выскабливание объема соответствующей текучей среды, например крови, по предметному стеклу вручную (размазывание). Для цельного замкнутого картриджа этот способ не может быть использован. Вместо этого может быть применено капиллярное заполнение узких каналов.

Из Патента США 6599475 В1 известно применение пластиковой оптической кюветы для создания тонкого монослоя из красных кровяных телец для микроскопического анализа. Предусмотрен ряд отсеков, соединенных в серию и обособленных разделительными стенками. Каждая из этих стенок позволяет протекать только некоторым из красных кровяных телец для достижения разбавления красных кровяных телец так, чтобы в последнем из отсеков получался монослой из изолированных красных кровяных телец. Для достижения постоянной толщины по всей кювете разделительные стенки имеют приваренные детали, и к верхней части приварена прозрачная крышка. Отсек может иметь размеры 600×600×3 микрометров.

Для таких вариантов применения, как анализ образцов крови на наличие малярийного плазмодия, нужно анализировать большой объем крови для достижения требуемого предела обнаружения. При толщинах слоев порядка размеров красных кровяных телец (5 мкм) это значит, что необходимо обследовать большие площади поверхности (квадратные сантиметры).

Патент США 6165739 А1 описывает предметное стекло из стекла или пластика для лазерной цитометрии, имеющее несколько камер с капиллярным просветом. Образец текучей среды может одновременно поступать во все камеры из резервуара. В каждой камере предусмотрен особый реактант, чтобы обеспечить возможность одновременного протекания многочисленных реакций.

Патентный документ US 2002/0106786 А1 представляет способы и устройство для выполнения микроаналитических анализов и методик, в особенности миниатюризированные тесты на клеточной основе. Устройство пригодно для получения слоев текучей среды, содержащей клетки для анализа, причем устройство имеет двумерную матрицу из аналитических камер и разветвленную конфигурацию входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, для обеспечения заполнения аналитических камер в параллельном режиме, причем каждая аналитическая камера имеет по существу планарную форму.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Цель изобретения состоит в создании альтернативных устройства и способов для получения тонких слоев текучей среды для анализа и/или систем и способов для анализа таких тонких слоев, в особенности устройства для автоматизированного анализа образцов в картридже. Отдельная цель настоящего изобретения заключается в представлении устройства и способов получения для анализа слоев из текучих сред, содержащих клетки, в которых слои имеют монослои из клеток, таких как красные кровяные тельца, например, не имеющие перекрывающихся клеток, таких как красные кровяные тельца, и систем и способов для анализа таких монослоев из клеток, главным образом способов и устройства для автоматизированного анализа в картридже.

Согласно первому аспекту, изобретение представляет:

устройство для получения тонких слоев образца текучей среды или для получения слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, главным образом красных кровяных телец для анализа, причем устройство имеет двумерную матрицу из аналитических камер, и с каждой из аналитических камер в матрице соединены входные каналы с разветвленной конфигурацией, чтобы аналитические камеры можно было заполнять в параллельном режиме, причем каждая из аналитических камер имеет по существу планарную форму, имеющую высоту, меньшую, чем высота входных каналов, чтобы образовывать тонкие слои образца текучей среды или формировать слои из текучей среды, содержащей клетки, главным образом красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, когда камеры заполняют образцом текучей среды.

При создании двумерной матрицы из аналитических камер и конфигурации входных каналов для параллельного соединения камер, между камерами в данной области может быть сформировано большее число разделительных перегородок таким образом, чтобы можно было сократить вариации высоты камер, в то же время по-прежнему обеспечивая быстрое заполнение камер.

Варианты исполнения могут иметь любые дополнительные признаки, и некоторые такие дополнительные признаки более подробно описаны ниже.

Устройство согласно изобретению, кроме того, предпочтительно включает дополнительную зону (55) между входными каналами (25) и аналитическими камерами (45), причем высота этой зоны является меньшей, чем высота входных каналов (25), и большей, чем аналитических камер (45). В более предпочтительном варианте исполнения, высота дополнительной зоны (55) составляет менее 6 микрон (мкм). Преимущество этой дополнительной зоны (55) состоит в том, что в этой области будут накапливаться красные кровяные тельца с созревшим плазмодием. Это будет препятствовать сосредоточению белых кровяных телец на краю области сканирования, которое мешало бы правильному проведению анализа. В предпочтительном варианте осуществления, устройство дополнительно включает жидкостные пробки для остановки течения жидкости через выходные каналы, но позволяющие проходить газу.

Камеры и/или каналы могут иметь размеры, подходящие для капиллярного заполнения образцом заданной текучей среды, например, текучей средой, содержащей клетки, главным образом крови. В вариантах осуществления настоящего изобретения размеры, пригодные для капиллярного заполнения, могут быть определены путем капиллярного заполнения с использованием стандартного водного раствора, например, такого как PBS или чистая вода. Это значит, что каналы, которые пригодны для капиллярного заполнения и способны к нему в соответствии с настоящим изобретением, заполняются под действием капиллярных сил при использовании PBS (натрий-фосфатного солевого буфера) в качестве стандарта, например, при стандартных температуре и давлении, или, необязательно, например, чистой воды при стандартных температуре и давлении.

Устройства согласно настоящему изобретению предпочтительно имеют несколько камер, объединенных с использованием гребнеобразных или фрактальных заливных и вентиляционных каналов. В предпочтительном варианте исполнения общая поверхность будет составлять 20 мм², а поле зрения 0,2×0,2=0,04 мм², что означает 500 реакционных камер. Число камер для каждого из вариантов осуществления настоящего изобретения может варьировать между 1 и 1000 камер. Общая площадь каждой из аналитических камер составляет между 100 и 2000 мм², и/или высота аналитических камер варьирует между 1 и 10 мкм.

Устройство имеет конфигурацию выходных каналов с одним или более выходными каналами, соединенными с каждой из аналитических камер. Каждая конфигурация входных и выходных каналов может включать гребенчатую компоновку, причем выступы гребенчатых компоновок имеют встречно-гребенчатую конструкцию, и при этом аналитические камеры размещены между встречно перемежающимися выступами гребенчатых компоновок. Еще один аспект настоящего изобретения представляет создание пробок из текучей среды в выходных каналах или вентиляционных отверстиях или рядом с ними. Созданием резких переходов в стенке канала таким образом, чтобы изменить ширину канала во всех направлениях, линия контакта жидкости и стенки становится нарушенной, поскольку нельзя резко обогнуть угол. Это ведет к приостановке текучей среды с последующим так называемым пиннингом контактной линии. Мениск становится замороженным на поверхности. Если канал является квадратным и имеет 4 стенки, то уширение делают на всех 4 стенках, и пиннинг может быть очень стабильным в одном и том же месте. Переходы стенок предпочтительно увеличивают число углов, то есть они предпочтительно могут представлять собой ступенчатые расширения. При текучих средах типа крови испарение воды может вести к постоянному пиннингу вследствие витрификации жидкости при мениске.

Устройство может иметь единичное отверстие для образца, пригодное для приема образца текучей среды, такого как образец текучей среды, содержащей клетки, например, крови, причем отверстие для образца сообщается по текучей среде с разветвленной конфигурацией входных каналов таким образом, что они заполняются под действием капиллярных сил. Предпочтительная минимальная высота входных каналов составляет 17 микрометров, так как этим предотвращается засорение крупными белыми кровяными тельцами, моноцитами.

Каналы, включая входные, но исключая выходные каналы, и/или камеры предпочтительно имеют гидрофильную поверхность. Эта гидрофильная поверхность может быть свойственна самому материалу, из которого они изготовлены, или же может быть создана другими средствами, например с помощью коронного разряда, плазменной обработкой или нанесением гидрофильного покрытия. Вентиляционные каналы предпочтительно предназначены для задерживания текучей среды для жидкостей, в то же время позволяя проходить газу, например, когда их делают имеющими гидрофобные поверхности, или при изменении ширины вентиляционных каналов в одном месте для стопорения жидкости в точке изменения ширины. По меньшей мере одна из поверхностей выше или ниже камер предпочтительно является прозрачной или оптически чистой, чтобы обеспечить возможность оптического обследования и измерения. Двумерная матрица из аналитических камер и необязательно разветвленная конфигурация входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, для возможности заполнения аналитических камер в параллельном режиме предпочтительно сделаны из полимерного материала, в особенности пластического материала. В предпочтительных вариантах исполнения аналитических камер каждая из них имеет по существу планарную форму, имеет высоту, определяемую нижней частью, в которой камеры были сформированы, и покровной частью, которая образует верхнюю часть камер. Покровная часть предпочтительно является более гибкой, чем нижняя часть, чтобы присоединение покровной части к нижней части, например, приклеиванием, привариванием, в особенности ультразвуковой сваркой, сцеплением с помощью растворителя, сплавлением и т.д., не изменяло бы размеров, в особенности плоскостности дна камер, сформированных в нижней части.

Размер индивидуальных аналитических камер может варьировать между 0,02 и 500 мм². Высота аналитических камер может составлять между 1 и 10 мкм. Высота аналитической камеры зависит от того, какие клетки или паразиты должны быть проанализированы. Для красных кровяных телец предпочтительная высота составляет между 2 и 4 микрометрами, и более предпочтительно 3 микрометра. Меньшая высота просвета будет удалять все нормальные кровяные клетки и дает чистую плазму крови. Увеличенная высота просвета будет вести к образованию смесей красных кровяных телец и, например, паразитов.

Входные каналы имеют глубину 10-200 мкм и ширину 50-1000 мкм, и выходные каналы могут иметь глубину 10-200 мкм и ширину 50-1000 мкм.

Еще один аспект изобретения представляет способ получения тонких слоев образца текучей среды или получения слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, главным образом красных кровяных телец, для анализа с использованием устройства, имеющего двумерную матрицу из аналитических камер и разветвленную конфигурацию входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, чтобы обеспечивать возможность заполнять аналитические камеры в параллельном режиме, причем каждая из аналитических камер имеет по существу планарную форму, имеющую высоту, меньшую, чем высота входных каналов, чтобы создавать тонкие слои или слои текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, в особенности красных кровяных телец, когда камеры заполняют образцом текучей среды, причем способ включает стадии, в которых создают образец текучей среды, и подают его в систему входных каналов, чтобы обеспечить заполнение аналитических камер образцом текучей среды. Заполнение предпочтительно происходит под действием капиллярных сил. В вариантах осуществления настоящего изобретения заполнение под действием капиллярных сил может быть определено капиллярным заполнением стандартным водным раствором, таким как PBS, или необязательно чистой водой. Это значит, что заполнение под действием капиллярных сил в соответствии с настоящим изобретением предполагает заполнение под действием капиллярных сил с использованием PBS (натрий-фосфатного солевого буфера) в качестве стандарта (или необязательно чистой воды), например, при стандартных температуре и давлении. PBS представляет собой солевой буферный раствор, содержащий хлорид натрия, фосфат натрия и (в некоторых составах) хлорид калия и фосфат калия. Осмотические характеристики и концентрации ионов раствора обычно согласуются с таковыми для человеческого организма. Один способ получения PBS включает растворение 800 г NaCl, 20 г KCl, 144 г Na₂HPO₄·12H₂O и 24 г KH₂PO₄ в 8 л дистиллированной воды и разбавление до объема 10 л. Величина рН составляет около 6,8, но когда разбавляют до 1х PBS, она должна измениться до 7,4. При разбавлении полученный буфер 1х PBS должен иметь конечную концентрацию 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата, 2,7 мМ KCl и значение рН 7,4. Еще один путь получения описан авторами Sambrook, Fritsch и Maniatis, (1989) в публикации Molecular Cloning: A Laboratory Manual («Молекулярное клонирование: Методическое руководство»), 2-е издание, издательство Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, том 3, приложение В.12: в 800 мл дистиллированной воды растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄·12H₂O и 0,24 г KH₂PO₄. Значение рН доводят до 7,4 с помощью HCl и добавляют Н₂О до объема 1 л.

Капиллярное действие согласно некоторым способам настоящего изобретения проявляется при применении камер и/или каналов, имеющих размеры, обеспечивающие возможность заполнения любым из вышеупомянутых составов PBS, например, при стандартных температуре и давлении, или, необязательно, чистой водой при стандартных температуре и давлении.

В способах согласно настоящему изобретению предпочтительно используют большое число камер, объединенных с использованием гребенчатых или фрактальных заливных и вентиляционных каналов. Устройства согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут иметь большое число камер. В предпочтительном варианте исполнения общая поверхность будет составлять 20 мм², а поле зрения 0,2×0,2=0,04 мм², что означает 500 реакционных камер. Число камер для любого из вариантов осуществления настоящего изобретения может варьировать между 100 и 1000 камер.

Способы согласно настоящему изобретению могут быть применены с устройством, которое имеет конфигурацию выходных каналов с одним или более выходными каналами, соединенными с каждой из аналитических камер. Каждая конфигурация входных и выходных каналов может включать гребенчатую компоновку, причем выступы гребенчатых компоновок имеют встречно-гребенчатую конструкцию, и при этом аналитические камеры размещены между встречно перемежающимися выступами гребенчатых компоновок. Еще один аспект настоящего изобретения представляет технологическую стадию затормаживания образца текучей среды в выходных каналах или вентиляционных отверстиях или рядом с ними. Созданием резких переходов в стенке канала таким образом, чтобы изменить ширину канала во всех направлениях, линия контакта жидкости и стенки становится нарушенной, поскольку нельзя резко обогнуть угол. Это ведет к приостановке текучей среды с последующим так называемым пиннингом контактной линии. Мениск становится замороженным на поверхности. Если канал является квадратным и имеет 4 стенки, то уширение делают на всех 4 стенках, и пиннинг может быть очень стабильным в одном и том же месте. Переходы стенок предпочтительно увеличивают число углов, то есть они предпочтительно могут представлять собой ступенчатые расширения. При текучих средах типа крови испарение воды может вести к постоянному пиннингу вследствие витрификации жидкости при мениске.

Еще один аспект изобретения представляет соответствующий способ изготовления такого устройства. В этом аспекте изобретение предпочтительно предоставляет собой способ изготовления устройства для получения слоев текучей среды, содержащей клетки, причем каждый слой имеет монослой из клеток, для анализа, причем способ включает стадии, в которых формируют двумерную матрицу из аналитических камер, и формируют разветвленную конфигурацию входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, для обеспечения заполнения аналитических камер в параллельном режиме, причем аналитические камеры формируют так, чтобы они имели по существу планарную форму, имеющую высоту, меньшую, чем высота входных каналов, причем общая площадь каждой из аналитических камер варьирует между 100 и 2000 мм², и/или высота аналитических камер составляет между 1 и 10 мкм, и причем входные каналы имеют глубину 10-200 мкм и ширину 50-1000 мкм.

Еще один аспект изобретения представляет аналитическую систему, включающую оптический детектор для анализа тонких слоев образца текучей среды, или для анализа слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, и устройство для получения тонких слоев образца текучей среды или слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, причем устройство имеет двумерную матрицу из аналитических камер, и разветвленную конфигурацию входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, чтобы обеспечить возможность заполнения аналитических камер в параллельном режиме, причем каждая аналитическая камера имеет по существу планарную форму, имеющую высоту, меньшую, чем высота входных каналов, чтобы создавать тонкие слои или слои текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, когда камеры заполняют образцом текучей среды.

Еще один аспект изобретения представляет способ анализа тонких слоев образца текучей среды или анализа слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, полученный с использованием устройства, имеющего двумерную матрицу из аналитических камер, и разветвленную конфигурацию входных каналов, соединенных с каждой из аналитических камер в матрице, чтобы обеспечить возможность заполнения аналитических камер в параллельном режиме, причем каждая из аналитических камер имеет по существу планарную форму, имеющую высоту, меньшую, чем высота входных каналов, чтобы создавать тонкие слои или слои текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, когда камеры заполняют образцом текучей среды, причем способ включает стадии, в которых готовят оптический детектор и применяют оптический детектор для анализа тонких слоев или слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток, в аналитических камерах.

Другие преимущества будут очевидны квалифицированным специалистам в этой области технологии, в особенности сравнительно с прототипом. Например, в настоящем изобретении не применяют единичную камеру, но матрицу из камер, соединенных параллельно. Матрица может представлять собой двумерную матрицу, которая тем самым позволяет создать компактную конструкцию. Камеры в двумерной матрице сообщаются по текучей среде для обеспечения возможности заполнения их в параллельном режиме. В частности, устройства согласно настоящему изобретению имеют многочисленные аналитические камеры, причем камеры имеют высоту, меньшую, например, значительно меньшую, чем высота входных каналов.

Многочисленные вариации и модификации могут быть сделаны без выхода за пределы области пунктов формулы настоящего изобретения. Поэтому должно быть, безусловно, понятно, что форма настоящего изобретения является только иллюстративной и не предполагается ограничивающей область настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Как настоящее изобретение может быть осуществлено, теперь будет описано на примере с привлечением сопроводительных чертежей, в которых:

ФИГ.1 представляет вид сверху фрагмента картриджа, показывающий матрицу из аналитических зон и повторяющуюся встречно-гребенчатую структуру каналов.

ФИГ.2 представляет вид поперечного сечения картриджа.

ФИГ.3 представляет увеличенный вид в перспективе перехода между аналитической зоной и вентиляционным каналом согласно одному варианту осуществления изобретения.

ФИГ.4 схематически показывает вид аналитической системы, включающей картридж.

ФИГ.5 показывает вид сверху фрагмента картриджа согласно изобретению, показывающий включение дополнительных аналитических зон для красных кровяных телец, зараженных созревшими паразитами.

ФИГ.6 представляет вид поперечного сечения картриджа согласно фиг.5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет описано в отношении конкретных вариантов осуществления и с привлечением определенных чертежей, но изобретение не ограничивается этим, а только пунктами патентной формулы. Описанные чертежи являются только схематическими и неограничивающими. В чертежах размер некоторых элементов может быть преувеличенным и не вычерченным в масштабе для целей иллюстративности. Там, где в настоящем описании и в патентной формуле используют термин «включающий», это не исключает других элементов или стадий. Там, где применяют неопределенный или определенный артикль, когда ссылаются на существительное в единственном числе, например “a” или “an”, “the”, сюда входит множественное число такого существительного, если специально не оговорено нечто иное.

Термин «включающий», используемый в пунктах патентной формулы, не следует интерпретировать как ограниченный перечисленными после него объектами; он не исключает других элементов или стадий. Таким образом, область выражения «устройство, включающее объекты А и В» не должна быть ограниченной устройствами, состоящими только из компонентов А и В. Это значит, что в смысле настоящего изобретения А и В представляют собой только компоненты, имеющие отношение к устройству.

Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» и тому подобные, в описании и в пунктах патентной формулы используются для различения между сходными элементами и необязательно для описания последовательности или хронологического порядка. Должно быть понятно, что термины, применяемые таким образом, являются равноценными в надлежащих обстоятельствах, и что описываемые здесь варианты осуществления изобретения могут действовать в других последовательностях, нежели описанные или иллюстрированные здесь.

Более того, термины «верх», «низ», «над», «под» и тому подобные в описании и в пунктах патентной формулы используются для описательных целей и не обязательно для описания относительных положений. Должно быть понятно, что используемые таким образом термины являются равнозначными при надлежащих обстоятельствах и что описываемые здесь варианты осуществления изобретения могут быть действительными в других ориентациях, нежели описанные или иллюстрированные здесь.

Настоящее изобретение относится к устройству и способам автоматизированного анализа образцов, например, в картридже. Для автоматизированного анализа образцов в картридже может быть важным точное регулирование толщины слоя образца текучей среды. По меньшей мере некоторые из вариантов исполнения включают приготовление тонкого мазка из клеток, и конструкция нового картриджа выполнена из пластика. Приготовление мазка из клеток предпочтительно означает формирование слоев текучей среды, содержащей клетки, в особенности красные кровяные тельца, причем каждый слой имеет монослой из клеток. Клетки предпочтительно не перекрываются. Клетки предпочтительно представляют собой красные кровяные тельца. Это может быть преимущественно применено для аналитических систем в медицинской диагностике, связанных с заболеваниями крови, такими как паразитарные инфекции, или такие, как, например, представляет микроскопическая диагностика малярии. Поскольку красные кровяные тельца не содержат ДНК, присутствие чужеродных клеток в крови может быть определено любым методом, например, любым оптическим методом, например, любым методом окрашивания, который демонстрирует присутствие ДНК. Преимущество настоящего изобретения, например, может состоять в меньшей стоимости, и/или более быстрой работе для данной производительности, и/или создании увеличенных областей для анализа.

Недорогие компоненты, такие как детали из отформованного пластика, обычно не имеют плоскостности, необходимой для достижения постоянной высоты каналов на протяжении больших областей. Как более подробно будет описано ниже, микроструктура, которая может быть изготовлена с малыми затратами из пластика, может обеспечивать более высокую точность толщины слоев в микрометрическом режиме при незначительной чувствительности к влиянию пользователя. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрицу из областей с узкими просветами создают соединенной каналами с более широкими просветами. Величину области и соотношение геометрических размеров в некоторых случаях подстраивают к требованиям анализа изображений. Индивидуальные области являются по большей части меньшими, чем общая анализируемая площадь. Этим путем может быть обеспечена возможность быстрого и хорошо контролируемого создания монослоев из клеток.

В порядке введения к вариантам исполнения, будут вкратце описаны некоторые проблемы и недостатки, разрешаемые некоторыми вариантами осуществления изобретения:

Для создания тонкого мазка крови (например, монослоя из клеток, в особенности монослоя из красных кровяных телец, главным образом слоя из неперекрывающихся красных кровяных телец) необходимо размазать образец по большой площади поверхности. Однако в этом контексте конструирование закрытого картриджа, и, более того, картриджа из пластика (для сокращения расходов), создает различные технические проблемы. Картридж может представлять собой одноразовый картридж. Картридж представляет собой устройство, которое может быть вставлено, например вдвинуто, в щель измерительного устройства для возможности проведения анализа содержимого картриджа. Например, гидравлическое сопротивление, имеющее место в узком просвете (расстояние от дна до верха в картридже порядка малой толщины мазка) затрудняет быстрое заполнение аналитической зоны образцом текучей среды с распространением по большой площади. Кроме того, могут иметь место значительные вариации производственного процесса, вызывающие изменение величины просвета, при изготовлении такого тонкого просвета в пластиковом изделии при большой площади поверхности, что будет разъяснено более подробно далее.

Капиллярное заполнение больших областей с узкими просветами ограничивается гидравлическим сопротивлением текучей среды внутри канала (Δp _ν=12ηLV/h ²), где Δp _ν представляет падение давления, L представляет длину канала, V представляет среднюю скорость течения, h представляет высоту канала. При высоте канала h порядка толщины клеток клетки создают сильное сопротивление течению. Это значит, что расстояния, которые могут быть преодолены, являются ограниченными.

Скорость течения и расстояние, которое может быть заполнено, зависит от вязкости текучей среды η, которая в случае крови может варьировать в широких пределах, главным образом в зависимости от показателя гематокрита (концентрации красных кровяных телец).

Капиллярная сила нарастает обратно пропорционально высоте просвета (Δp _c=2σ cosΘ/h), где Δp _c представляет капиллярную силу, поверхностное натяжение обозначено σ, краевой угол текучей среды на подложке обозначен Θ, высота просвета представлена h.

Малые вариации толщины ведут к сильным колебаниям скорости течения и, следовательно, к непредсказуемым картинам заполнения, неполному заполнению и воздушным включениям.

Для недорогих картриджей подложка и крышка должны быть сделаны из пластика, который обрабатывают либо экструзией (пленка), либо инжекционным формованием под давлением (более толстые детали и рамка). Инжекционное формование под давлением ведет к отклонениям от формы вследствие неравномерного охлаждения, изначально присущего процессу. Это ведет к отклонениям от плоскостности на величины порядка десятков микрон (мкм) локально и в гораздо большей степени в целом. Пленки могут быть обработаны с малыми допусками по толщине и плоскостности, однако жесткость на изгиб является очень малой (пропорционально l/d³), так что можно ожидать больших вариаций просвета, что ведет к неоднородному и невоспроизводимому заполнению и может обусловливать слишком большие просветы, которые вызывают наслоение клеток и затрудняют анализ изображений. Это является очень важным, поскольку вариации эффективной оптической толщины окрашенного объекта ведут к вариациям в анализе изображений (пороговым значениям и т.д.) и тем самым к неправильным негативам или позитивам.

По всем этим причинам затруднительно получать недорогие картриджи для приготовления тонких мазков из образцов текучей среды, такой как кровь, с желательной точностью толщины слоя, для применения, например, в диагностике малярии, основанной на получении изображений.

Фиг.1 - вид сверху картриджа согласно первому варианту исполнения

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения имеют аналитические зоны в форме матрицы из микрофлюидных камер. Этим можно обеспечить большее количество разделительных перегородок для данной общей площади и тем самым способствовать поддержанию заданной высоты. Эти камеры могут быть соединены в параллельном режиме входными каналами, чтобы способствовать быстрому заполнению. Единичное отверстие для образца может быть размещено сообщающимся по текучей среде с входными каналами для обеспечения легкого поступления образца текучей среды. Также предусмотрены вентиляционные каналы. Каналы могут быть скомпонованы во встречно-гребенчатой конфигурации, чтобы обеспечивать возможность более быстрого заполнения многочисленных камер в параллельном режиме. В некоторых случаях предусмотрен комплект встречно-гребенчатых выступов для капиллярного течения образца в сторону матрицы из аналитических зон. Заполнение предпочтительно происходит под действием капиллярных сил. В вариантах осуществления настоящего изобретения заполнение под действием капиллярных сил может быть определено капиллярным заполнением стандартным водным раствором, таким как PBS, например, при стандартных температуре и давлении, или необязательно чистой водой при стандартных температуре и давлении. PBS представляет собой солевой буферный раствор, содержащий хлорид натрия, фосфат натрия и (в некоторых составах) хлорид калия и фосфат калия. Осмотические характеристики и концентрации ионов раствора обычно соответствуют таковым для человеческого организма. Один способ получения PBS включает растворение 800 г NaCl, 20 г KCl, 144 г Na₂HPO₄·12H₂O и 24 г KH₂PO₄ в 8 л дистиллированной воды и разбавление до объема 10 л. Величина рН составляет около 6,8, но когда разбавляют до буфера 1х PBS, она должна измениться до 7,4. При разбавлении полученный буфер 1х PBS должен иметь конечную концентрацию 137 мМ NaCl, 10 мМ фосфата, 2,7 мМ KCl и значение рН 7,4. Еще один путь получения описан авторами Sambrook, Fritsch и Maniatis, (1989) в публикации Molecular Cloning: A Laboratory Manual («Молекулярное клонирование: Методическое руководство»), 2-е издание, издательство Cold Spring Harbor Laboratory Press, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, том 3, приложение В.12: в 800 мл дистиллированной воды растворяют 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄·12H₂O и 0,24 г KH₂PO₄. Значение рН доводят до 7,4 с помощью HCl и добавляют Н₂О до объема 1 л.

Капиллярное действие может быть определено заполнением под действием капиллярных сил, когда используют любой из вышеуказанных растворов PBS, например, при стандартных температуре и давлении, или, необязательно, чистую воду при стандартных температуре и давлении.

Для создания автоматически считываемого монослоя красных кровяных телец из определенного количества цельной крови весьма важными являются формат и конфигурация входных каналов и аналитических камер. Входные каналы и вход в аналитические камеры легко засоряются крупными белыми кровяными тельцами. Общая ширина входа во все аналитические камеры должна быть такой большой, чтобы свести это к минимуму. Для анализа одного микролитра цельной крови минимальная общая ширина входа в аналитическую камеру составляет по меньшей мере 110 мм (число белых кровяных телец в одном микролитре, умноженное на диаметр = 1,1·10⁴×10·10^-6 м=110 мм).

Внутренние поверхности входных каналов и камер предпочтительно являются гидрофильными. Это может быть достигнуто выбором материалов, из которых сделано устройство, или обработками, такими как обработка плазмой, или коронным разрядом, или нанесением гидрофильного покрытия.

Может быть предусмотрен еще один комплект встречно-гребенчатых полых выступов для вентиляционных каналов. Вентиляционные каналы предпочтительно компонуют так, чтобы они формировали жидкостные пробки, но позволяли газу протекать через них, не препятствуя течению жидкости или по меньшей мере не вызывая его задержки. Например, поверхность вентиляционных каналов может быть гидрофобной, или же ширина вентиляционных каналов может резко изменяться на более широкую, чтобы фиксировать образец текучей среды. Аналитические зоны могут быть размещены между вышеупомянутыми выступами. Аналитические зоны могут быть скомпонованы так, чтобы иметь размеры, сопоставимые с полем зрения микроскопа аналитической системы.

На ФИГ.1 показан вид сверху примерного устройства в форме картриджа, и на ФИГ.2 представлен вид поперечного сечения того же примера. А именно, общая аналитическая зона, как показано на ФИГ.1, подразделена на маленькие элементарные аналитические зоны так, что пластиковый картридж имеет матрицу из малых аналитических зон, каждая из которых имеет высоту (просвет), по существу равную желательной высоте тонкого мазка (порядка микрометров). В некоторых случаях малая аналитическая зона соответствует полю зрения оптического детектора, такого как микроскоп, используемого в системе. Такое подр