Трансгенное животное, отличное от человека, и его применения

Трансгенное животное, отличное от человека, и его применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в целом к трансгенным конструкциям, трансгенным животным, отличным от человека, содержащим трансгенные конструкции, способам создания и способам применения трансгенных животных, отличных от человека, содержащих трансгенные конструкции. Вариант осуществления данного изобретения относится к способам количественного анализа GPCR лигандов неинвазивно в интактных животных, тканевых срезах или в нативных клетках, используя трансгенную модель, содержащую систему биолюминесцентного трансгена-репортера, которая является чувствительной к модуляции путей после связывания лиганда с рецепторами GPCR.

Предпосылки создания изобретения

В разработке лекарственных средств коэффициенты отсева являются высокими, и только одно из пяти соединений проходит от разработки до утверждения в Управлении по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) (DiMasi, J.A., et al, J Health Econ 22,151-185, 2003). Более того, несмотря на резко возросший объем инвестирования, уровень внедрения новых лекарственных средств остается относительно постоянным в течение последних 30 лет со всего лишь двумя-тремя продвижениями в классах новых лекарственных средств в год, в конечном итоге доходящих до рынка (Lindsay M.A., Nature Rev. Drug Discovery, 2, 831-838, 2003).

Молекулярная и функциональная визуализация, применяемая на начальных стадиях разработки лекарственного средства, может предоставить данные о биологической активности и подтвердить, что предполагаемое лекарственное средство оказывает влияние на предназначенную для него мишень. Таким образом, существуют большие ожидания, что инвестирование в технологию молекулярной визуализации увеличит разработку лекарственных средств (Rudin M., Progress in Drug Res., vol. 62). Преимущества методов молекулярной визуализации над более традиционными считываниями состоят в том, что они могут быть выполнены в интактном организме с достаточным пространственным и временным разрешением для изучения биологических процессов in vivo. Кроме того, такие методы позволяют проведение повторяющегося, неинвазивного, единообразного и относительно автоматизированного исследования одной и той же биологической модели в разные моменты времени, таким образом, повышая статистическую мощность длительных исследований и, кроме того, уменьшая количество требуемых животных, снижая, таким образом, стоимость разработки лекарственного средства.

Молекулярная визуализация

Молекулярная визуализация относится к сближению подходов из различных дисциплин (клеточной и молекулярной биологии, химии, медицины, фармакологии, физики, биоинформатики и инженерии) для использования и интеграции методов визуализации в оценке конкретных молекулярных процессов на клеточном и субклеточном уровнях в живом организме. (Massoud T.F., Genes Dev. 17:545-580, 2003).

Появление генной инженерии привело к значительным изменениям в прикладной науке, включая, например, процесс разработки при поиске новых лекарственных средств. Таким же образом, разработка и использование методик визуализации на животных предоставляют новые средства для доклинических исследований (Maggie A. and Ciana P., Nat.Rev.Drug Discov. 4, 249-255, 2005). Животные модели традиционно были трудоемкими из-за трудности с количественной оценкой физиологических событий в режиме реального времени. С годами были разработаны новые способы визуализации для преодоления этой трудности, такие как магнитно-резонансная томография (MRI) и позитронно-эмиссионная томография (PET). Совсем недавно для неинвазивного обнаружения была использована биолюминесцентная визуализация на основе in vivo экспрессии люциферазы, светоизлучающего фермента светлячка.

Молекулярная визуализация: биолюминесценция

Биолюминесцентная визуализация (BLI) in vivo является чувствительным инструментом, который основан на регистрации светового излучения от клеток и тканей. Полезность технологии генов-репортеров позволяет анализировать конкретные клеточные и биологические процессы в живом животном посредством способов визуализации in vivo. Биолюминесценция, ферментативное генерирование видимого света живым организмом, является естественным явлением у многих не млекопитающих видов. (Contag, C.H., et al, Mol. Microbiol. 18:593-603, 1995). Люциферазы представляют собой ферменты, которые катализируют окисление субстрата для выделения фотона света (Greer L.F., III, Luminescence 17:43-74, 2002). Биолюминесценция североамериканского светлячка является наиболее широко изученной. Экспрессия гена люциферазы светлячка (luc) производит фермент люциферазу, который преобразует субстрат D-люциферин в неактивный оксилюциферин, давая в результате излучение зеленого света при 562 нм. Поскольку ткани млекопитающих естественно не испускают биолюминесценцию, in vivo BLI имеет большую привлекательность, поскольку изображения могут быть генерированы с очень небольшим фоновым сигналом.

BLI требует генной инженерии клеток или тканей с кассетой экспрессии, состоящей из биолюминесцентного гена-репортера под контролем выбранного промотора гена, конститутивно управляющего световым репортером (фиг.3). Для того чтобы индуцировать производство света, субстраты, такие как люциферин, вводят посредством интрацеребровентрикулярной (icv), внутривенной (iv), внутрибрюшинной (ip) или подкожной (sq) инъекции.

Свет, излучаемый люциферазой, может проникать на глубину от нескольких миллиметров до сантиметров; однако интенсивность фотонов снижается в 10 раз на каждый сантиметр глубины ткани (Contag C.H., et al, Mol. Microbiol. 18:593-603, 1995). Для обнаружения биолюминесценции in vivo должны использоваться чувствительные свето-детекторные инструменты. Детекторы измеряют количество фотонов, испускаемых на единицу площади. Низкие уровни света с длиной волны от 400 до 1000 нм могут быть обнаружены с помощью камер с полупроводниковой светочувствительной матрицей, которые конвертируют световые фотоны, попадающие на кремниевые пластины, в электроны (Spibey C.P. et al electrophoresis 22:829-836, 2001). Программное обеспечение способно конвертировать электронные сигналы в двухмерное изображение. Программное обеспечение также способно количественно оценивать интенсивность испускаемого света (количество испускаемых фотонов, попадающих на детекторы) и конвертировать эти числовые значения в псевдоцветное графическое или полутоновое изображение (фиг.2A и 2B). Фактические данные измеряются в фотонах, но псевдоцветная графика делает возможным быструю визуальную интерпретацию. Количественные измерения в представляющей интерес области могут быть необходимы для обнаружения более тонких различий. Применение охлажденных камер с полупроводниковой светочувствительной матрицей (CCD) снижает тепловой шум, а светонепроницаемый бокс позволяет оптимально визуализировать и количественно оценить производимый люциферазой свет (Contag C.H. and Bachmann, M.H., Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260, 2002).

Полезно, когда люциферазное изображение накладывается на изображение другого типа, такое как автограф или рентгенограмма, для анатомического расположения испускаемого сигнала (фиг.2B). Программное обеспечение накладывает изображения для визуализации и интерпретации.

Посредством объединения животной инженерии с методами молекулярной визуализации стало возможным проведение динамических исследований конкретных молекулярных процессов в живых животных. Этот подход способен потенциально повлиять на доклинические протоколы, таким образом, значительно изменяя все аспекты медицины (Maggie A. Trends Pharmacolo. Sci 25, 337-342, 2004).

Рецепторы, сопряженные с G-белком (GPCR) - GPCR в качестве мишени для лекарственных средств

GPCR составляют большое суперсемейство рецепторов клеточной поверхности, которые классифицируются на более чем 100 подсемейств на основе их общей топологической структуры; GPCR также называют семь трансмембранных (7TM) рецепторов. К GPCR наиболее часто обращаются как к мишеням для лекарственных средств в фармацевтической промышленности. Приблизительно 30% из всех продаваемых по рецепту лекарственных средств нацелены на GPCR, что делает это белковое семейство фармацевтически наиболее успешным классом мишеней (Jacoby, E; Chem. Med. Chem., 1: 761-782, 2006).

Взаимодействие между GPCR и их внеклеточными лигандами оказалось привлекательным моментом для вмешательства терапевтических средств. По этой причине фармацевтическая промышленность разработала биохимические количественные анализы для поиска новых лекарственных средств, чтобы исследовать эти взаимодействия лиганд-GPCR. Взаимодействие активированного GPCR с гетеротримерным G-белком катализирует обмен гуанозиндифосфата (GDP) на гуанозинтрифосфат (GTP), позволяя взаимодействие с несколькими нижележащими эффекторами (Cabrera-Vera T.M., Endocr. Rev. 24:765-781, 2003). Нижележащая передача сигнала зависит от G-альфа изоформы, которая предпочитается представляющим интерес GPCR. Белки семейства G-альфа_q/11 стимулируют фосфолипазу С (PLC), в то время как представители семейств G-альфа_i/0 и G-альфа_s главным образом модулируют активность аденилатциклазы (AC). Если представляющий интерес GPCR передает сигнал через PLC, тогда наиболее широко применяемым методом на основе репортера для измерения активации GPCR является анализ высвобождения кальция (Ca⁺²), либо измеренный во флуоресцентном формате, при использовании Ca⁺²-чувствительных флуорофор (Sullivan E, Methods Mol. Biol. 114:125-133, 1999), либо в люминесцентном формате, при использовании экворина и хемилюминесцентного субстрата (Dupriez V.J., Receptors Channels 8: 319-330, 2002). Если представляющий интерес GPCR передает сигнал через AC, тогда цитозольное содержание циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) может быть определено с использованием различных технологий обнаружения (Gabriel D. Assay Drug Dev. Technol. 1:291-303, 2003).

Количественные анализы на основе GPCR-репортера обширно используются в современных программах поиска новых лекарственных средств. Как правило, GPCR-репортеры вводят в клеточные системы для обеспечения in vitro высокопроизводительного скрининга (HTS) крупных фармацевтических библиотек для идентификации лигандов или соединений, которые активируют или модулируют конкретный GPCR. Вторичные и последующие клеточные анализы подтверждают и уточняют любые «хиты», идентифицированные в HTS в отношении конкретного GPCR; но опять же, эти анализы полагаются на способы рекомбинантного ДНК для введения клонированного GPCR в трансформированный тип клеток. В то время как трансформированные типы клеток обладают отличной пролиферативной способностью для поддержания крупных скрининговых программ, они часто демонстрируют аберрантные генетические и функциональные характеристики и, следовательно, при использовании этой парадигмы встречается значительный отсев предполагаемых «хитов» из HTS.

В течение нескольких лет для измерения функциональной активности GPCR использовались основанные на биолюминесценции анализы генов-репортеров (Hill, S.J. Curr.Opin.Pharmacol.1: 526-532, 2001). Этот формат анализов является очень чувствительным из-за низкого фонового сигнала биолюминесцентного считывания и этапов усиления сигнала между активацией GPCR и совокупной экспрессией гена-репортера.

Ответный элемент цАМФ (CRE) в промоторе гена-репортера делает возможным специфический мониторинг G-белок-зависимой передачи сигнала. Когда лиганд связывается с GPCR, это вызывает конформационное изменение в GPCR, которое позволяет ему активировать связанный G-белок. Фермент аденилатциклаза представляет собой клеточный белок, который может регулироваться G-белками. Активность аденилатциклазы активируется или ингибируется, когда она связывается с субъединицей активированного G-белка. Сигнальная трансдукция зависит от типа G-белка. Аденилатциклаза влияет на увеличение или уменьшение производства цАМФ в клетке. Произведенный цАМФ является вторичным мессенджером в клеточном метаболизме и аллостерическим активатором протеинкиназы А (PKA). Когда цАМФ отсутствует, комплекс PKA является неактивным. Когда цАМФ связывается с регуляторной субъединицей PKA, ее конформация меняется, вызывая диссоциацию регуляторных субъединиц, которые активируют протеинкиназу А и позволяют дальнейшие биологические эффекты. PKA затем фосфорилирует и активирует транскрипционный фактор CREB. CREB связывается с определенными последовательностями ДНК, называемыми чувствительными элементами цАМФ (CRE), и, тем самым, увеличивает или уменьшает транскрипцию, и, таким образом, и экспрессию, определенных генов, таких как ген-репортер люциферазы.

Трансген CreLuc предназначен для анализа активации всех трех главных GPCR либо непосредственно через цАМФ внутриклеточный путь передачи сигнала, либо опосредованно с помощью передачи сигнала посредством PLC. Поскольку любой из типов клеток содержит множество различных типов GPCR на клеточной поверхности (таким образом, любая клетка будет иметь передачу сигнала GPCR через G-альфа_q/11, G-альфа_i/0 и G-альфа_s, происходящую одновременно внутри клетки), общепринятым взглядом будет предположение, что маловероятно, что такой трансген, как CreLuc, будет достаточно специфичен для различения любого конкретного лиганда GPCR. Однако авторы показывают в данном случае, что трансген CreLuc способен различать лиганды GPCR. Авторы прогнозируют, что биолюминесцентный сигнал для люциферазного репортера в клетках, тканевых срезах или интактном животном будет увеличен с форсколином и модулирован лигандами для Gs, Gq или Gi рецепторов. В таблице 1 показан ожидаемый эффект, который активация/ингибирование GPCR будет иметь на системе CreLuc репортера при связывании с лигандом GPCR. Кроме того, авторы показывают данные, что их новая система CreLuc репортера может различать различные классы лигандов GPCR и что такая система репортера применима для выявления новых лигандов GPCR при использовании в клетках, тканевых срезах и интактном животном.

Таблица 1 Прогнозируемые изменения биолюминесцентного сигнала от репортера CreLuc при связывании лиганда с определенными GPCR
Тип рецептора	Агонист	Антагонист; обратный агонист
Gs; Gq	Увеличение	Уменьшение
Gi	Уменьшение	Увеличение

Трансгенная модель репортера GPCR биовизуализации

Значительный отсев потенциальных лекарств-кандидатов в существующей парадигме поиска новых лекарственных средств встречается на фазе перехода от анализов клеточного репортера к моделям in vivo. Доступны многочисленные in vivo модели, которые повторяют полностью или частично отдельное заболевание человека. Демонстрация активности ведущих соединений в этих моделях является значительной вехой в продвижении новых химических GPCR лекарственных средств. Животные модели заболевания, как правило, требуют большого числа животных и количества времени, позволяющего развитие их фенотипа и точный анализ влияния кандидатных соединений на изменение исхода заболевания. После испытания in vitro следующим уровнем испытания лекарства-кандидата в комплексной системе является использование испытаний in vivo или моделей in vivo болезненных состояний на механистической основе. Неудачи в изменении исходов индуцированных заболеваний плохо понятны, но все еще приводят к большому уровню отсева соединений-кандидатов в процессе разработки лекарственного средства.

Трансгенная модель, содержащая анализ репортера связывания и активации лиганда GPCR, станет значительным улучшением существующей парадигмы поиска новых лекарственных средств для GPCR. Например, вариант осуществления данного изобретения описывает содержащий трансген цАМФ-репортерный анализ, основанный на люциферазном репортере (CreLuc), который объединен с молекулярным визуализированием в интактных животных, тканях или клетках, который смог бы значительно ускорить поиск нового лекарственного средства - лиганда GPCR (Bhaumik, S. and Gambhir, S.S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:377-382 2002; Hasan M.T., et al., Genesis 29:116-122, 2001). Как описано в настоящем описании, варианты осуществления трансгенного животного, отличного от человека, данного изобретения предлагают следующие не ограничивающие преимущества:

1. Анализы на основе тканей или клеток имеют ту же репортерную систему, что и анализ трансгенной in vivo модели, таким образом, уменьшая число неизвестных в комплексных интактных биологических системах.

2. Неинвазивная визуализация позволяет количественный анализ активности лиганда или соединения в анализе временной зависимости у одного и того же животного.

3. Неинвазивная визуализация снижает количество животных в исследовании и приводит к большей статистической мощности на каждое животное, являющееся своим собственным контролем, где контролем будет проанализированное животное в нулевой момент времени.

4. Трансгенное животное будет источником клеток и тканей для обеспечения параллельных анализов, проводимых in vitro или ex vivo.

5. Анализ трансгенного животного обеспечит анализ активности лиганда в нативных типах клеток, что приводит к более реалистичному профилю взаимодействия лиганд:рецептор.

6. Трансгенное животное позволяет одновременную оценку фармакодинамики и фармакокинетики лигандов GPCR.

7. Трансгенное животное позволяет одновременную идентификацию тканевой и клеточной специфичности на уровне органа или интактного животного.

8. Трансгенное животное позволяет скрещивание с другими генетически измененными моделями для выявления новых сигнальных путей и их ответа на конкретные лиганды.

Многие трансгенные животные, сконструированные с различными репортерами, применяются в исследовании молекулярных процессов, таких как метаболизм лекарственных средств (Zhang W., et al., Drug Metab. Dispos. 31:1054-1064, 2003), генотоксичность (Gossen J.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7971-7975, 1989) и эффекты токсических соединений (Sacco M.G. et al., Nat. Biotechnol. 15:1392-1397, 1997). Для достижения своих целей проектирования, животное-GPCR-репортер, подходящее для исследований молекулярной визуализации, должно включать несколько элементов, приспособленных, чтобы позволить одновременно высокие уровни экспрессии репортера для обеспечения большого окна биолюминесцентного обнаружения, а также экспрессию в каждом типе клеток для обеспечения обширных тонких анализов in vivo биораспределения лиганда или исследуемого соединения.

Сложность и разнообразие механизмов, вовлеченных в экспрессию генов, никогда не позволят исследователям сконструировать гены, способные во всех случаях экспрессироваться в трансгенных животных полностью предсказуемым образом (Pinkert, C. A. (ed.) 1994. Transgenic animal technology: A laboratory handbook. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Monastersky G. M. and Robl, J. M. (ed.) (1995) Strategies in Transgenic Animal Science. ASM Press. Washington D.C.). Только через обширные пробы и ошибки можно достичь уникальных комбинаций трансгенных структур для выполнения целей проектирования модели, требуемых для биовизуализации GPCR репортеров.

Полезность трансгенного GPCR репортера по сравнению с рекомбинантными клеточными анализами

По мере того, как скрининговая технология приближается к моменту понимания поведения отдельных GPCR, ясно, что скорее, чем быть выключателем, эти рецепторы действуют больше как микропроцессоры информации. Это ввело феномен функциональной селективности, при котором определенные лиганды инициируют только часть сигнального механизма, опосредованного данным рецептором, что открыло новые горизонты для поиска новых лекарственных средств. Необходимость в раскрытии взаимоотношений новых лигандов GPCR и количественной оценки эффекта лекарственного средства на эту комплексную систему для направления медицинской химии ставит значительно более высокие требования к любому фармакологическому репортерному анализу. Эта концепция ведет к возвращению к полным системным анализам от редукционистских рекомбинантных клеточных скрининговых систем. Профилирование лигандной активности с конкретным GPCR или набором GPCR в нативном клеточном окружении, как ожидается, улучшит успешность выявления новых лекарственных средств против ключевого класса фармацевтически важных рецепторов (Kenakin TP, Nat. Rev. Drug Discov. 8,617-625, 2009). Животная модель, содержащая биолюминесцентный GPCR репортерный трансген, является весьма желательной стратегией молекулярной визуализации для определения активности лиганда GPCR в интактной биологической комплексной системе с целью улучшения поиска новых лекарственных средств для борьбы с заболеваниями человека.

Поскольку активация CRE/CREB затрагивает множество различных биологических процессов, существует значительный интерес в исследовании активации CRE с использованием репортерной экспрессирующей системы CRE/CREB. Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторичным мессенджером во внутриклеточной сигнальной трансдукции после активации рецептора и последующей активации протеинкиназы и, таким образом, вовлечен в регуляцию многих биологических процессов. CREB (белок, связывающий чувствительный элемент цАМФ), фосфорилированный киназой, активированной цАМФ, связывается с чувствительным элементом цАМФ (CRE) в промоторной области многих генов и активирует транскрипцию (Shaywitz and Greenberg, Annul. Rev. Biochem., 68:821-861, 1999). Трансгенных мышей, несущих шесть тандемов CRE с минимальным промотором вируса простого герпеса (HSV), управляющим экспрессией бета-галактозидазы, использовали для исследования CRE-опосредованной экспрессии генов в срезах мозга в ответ на хроническую обработку антидепрессантом (Thome J., et al., J. Neurosci. 20:4030-4036, 2000). Аналогичным образом, трансгенные мыши, несущие четыре копии промотора CRE гена крысиного соматостатина, соединенного с промотором тимидинкиназы и геном люциферазы, были использованы для исследования активации CRE в гистологических срезах мозга или гомогенатах (Boer et al., PloS One, May 9; 2(5):e431, 2007). Однако исследования до сих пор затруднены необходимостью сортировки большого количества трансгенных линий для обнаружения подходящей животной модели. Кроме того, после обнаружения подходящей линии относительно низкие уровни экспрессии репортера требуют эвтаназии трансгенного животного для измерения гена-репортера, что требует большого количества животных для использования в одной экспериментальной парадигме.

Вариантом осуществления данного изобретения является разработка трансгена, содержащего инсуляторные элементы, ответные элементы, промоторные элементы, гены-репортеры и функциональные элементы. Трансген может быть быстро введен в животных, не относящихся к человеку, благодаря высокой скорости интеграции и высокого уровня экспрессии гена-репортера, таким образом, трансгенные животные могут быть легко созданы в качестве моделей для исследования активации регуляторного элемента in vivo (т.е. в живом животном), in situ (например, срезы мозга, интактные цельные органы) или in vitro (например, первичные культуры клеток из трансгенного животного, гомогенаты тканей).

Вариантом осуществления данного изобретения является трансген, содержащий CRE Luc репортерную систему, используемую в трансгенных животных, не относящихся к человеку, в качестве моделей для количественной оценки активностей лигандов GPCR через регуляцию уровней внутриклеточного цАМФ in vivo. В качестве неограничивающего примера авторы продемонстрировали изменения в люциферазном репортере с помощью биолюминесценции в выделенных первичных клетках и в интактных животных, используя общепринятые регуляторы цАМФ. В другом варианте осуществления активация репортера количественно проанализирована и подтверждена в тканевых экстрактах при использовании люциферазных количественных анализов ex vivo. Ответ трансгена CRE Luc задокументирован во множестве мышиных линий и показывает одиночные или множественные тканевые активационные профили. Более того, в качестве неограничивающих примеров авторы показывают, что конкретные лиганды GPCR активировали трансген CRE Luc в интактных животных, тканевых срезах и первичных клетках.

Краткое описание изобретения

В целом, данное изобретение предоставляет трансгенные конструкции, трансгенных животных, отличных от человека, содержащих трансгенные конструкции, способы создания и способы применения трансгенных животных, отличных от человека, содержащих трансгенные конструкции. Вариант осуществления данного изобретения предоставляет трансгенную конструкцию, содержащую CRE Luc репортерную систему. Вариантом осуществления данного изобретения является введение трансгенной конструкции, содержащей CRE Luc репортерную систему, в животное, отличное от человека.

Поскольку модуляция цАМФ является одним из ключевых активационных путей для GPCR, данное изобретение служит платформой для количественного определения в интактных животных, тканевых срезах или клетках, причем активация GPCR лигандом или соединением через активацию гена-репортера, где ген-репортер обеспечивает измеряемый биолюминесцентный сигнал, например метаболизм люциферина с помощью люциферазы. Данное изобретение представляет инструменты для улучшения перехода объектов открытия новых лекарственных средств, таких как лиганды или соединения, от клеточных количественных анализов к интактным животным. В варианте осуществления данного изобретения применяют такую же репортерную систему в нативных клетках, которая снижает скорость отсева новых лигандов GPCR, одновременно предоставляя данные биодоступности.

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, имеющее геном, содержащий трансген, который содержит первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент.

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где первый инсуляторный элемент выбран из группы, состоящей из участков прикрепления к ядерному матриксу (MAR), ДНКаза I-гиперчувствительного сайта (HS4) и инвертированных концевых повторов (ITR). Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где второй инсуляторный элемент выбран из группы, состоящей из элемента прикрепления к ядерному матриксу (MAR), HS4 и ITR. Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где первый инсуляторный элемент является таким же, как второй инсуляторный элемент.

Вариант осуществления данного изобретения охватывает трансгенное животное, отличное от человека, где ответный элемент выбран из группы, состоящей из ответного элемента цАМФ (CRE), активирующего белка 1 (ASP1), ответного элемента глюкокортикоида (GRE), ответного элемента теплового шока (HSE), ответного элемента сыворотки (SRE), ответного элемента тиреоида (TRE) и ответного элемента эстрогена (ERE). Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где ответный элемент повторяется в тандеме от двух до двадцати четырех раз. Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где ответный элемент повторяется в тандеме шесть раз. Дополнительным вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где ответный элемент представляет собой CRE, дополнительно, где ответный элемент CRE может быть единственным элементом или повторяемым от двух до двадцати четырех раз.

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где промотор представляет собой минимальный промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV TK min).

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где биолюминесцентный репортер выбран из группы, состоящей из люциферазы, хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), бета-галактозидазы, секретированной щелочной фосфатазы (SEAP), человеческого гормона роста (HGH) и зеленого флуоресцентного белка (GFP).

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где функциональный элемент представляет собой ген человеческого гормона роста (hGH).

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где трансген содержит SEQ ID NO:18.

Вариантом осуществления данного изобретения является трансгенное животное, отличное от человека, где трансген содержит SEQ ID NO:19.

Вариантом осуществления данного изобретения является клетка, выделенная из трансгенного животного, отличного от человека, или тканевый срез, выделенный из трансгенного животного, отличного от человека, по п.1.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации лиганда рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), включающий (a) измерение количества биолюминесценции в трансгенном животном, отличном от человека, раскрытом в данном описании; (b) введение тестируемого средства трансгенному животному, отличному от человека; (c) измерение количества биолюминесценции трансгенного животного, отличного от человека, в один или более моментов времени после введения тестируемого средства; и (d) сравнение количества биолюминесценции, измеренной в (a), с количеством биолюминесценции, измеренной в (c), где разница в количестве биолюминесценции в (a) по сравнению с (c) идентифицирует тестируемое средство как лиганд GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации лиганда рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), включающий (a) приготовление тканевого среза из трансгенного животного, отличного от человека, раскрытого в данном описании; (b) измерение количества биолюминесценции в тканевом срезе; (c) введение тестируемого средства в тканевой срез; (d) измерение количества биолюминесценции тканевого среза в один или более моментов времени после введения тестируемого средства; и (e) сравнение количества биолюминесценции, измеренной в (b), с количеством биолюминесценции, измеренной в (d), где разница в количестве биолюминесценции в (b) по сравнению с (d) идентифицирует тестируемое средство как лиганд GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации лиганда рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), включающий (a) приготовление клетки, выделенной из трансгенного животного, отличного от человека, раскрытого в данном описании; (b) измерение количества биолюминесценции в клетке; (c) введение тестируемого средства в клетку; (d) измерение количества биолюминесценции в клетке в один или более моментов времени после введения тестируемого средства; и (e) сравнение количества биолюминесценции, измеренной в (b), с количеством биолюминесценции, измеренной в (d), где разница в количестве биолюминесценции в (b) по сравнению с (d) идентифицирует тестируемое средство как лиганд GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ мониторинга функции GPCR в животном, отличном от человека, включающий (a) трансгенное модифицирование животного, отличного от человека, для экспрессии трансгена, содержащего первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент; (b) мониторинг биолюминесценции из животного, отличного от человека; и (c) коррелирование указанной биолюминесценции с функцией GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ мониторинга функции GPCR в животном, отличном от человека, включающий (a) трансгенное модифицирование животного, отличного от человека, для экспрессии трансгена, содержащего первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент; (b) мониторинг люциферазы животного, отличного от человека; и (c) коррелирование указанной биолюминесценции с функцией GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ мониторинга функции GPCR в животном, отличном от человека, включающий (a) трансгенное модифицирование животного, отличного от человека, для экспрессии трансгена, содержащего первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент; (b) манипулирование животным, отличным от человека, для имитации аспекта болезненного состояния; (c) мониторинг биолюминесценции от животного, отличного от человека; и (d) коррелирование указанной биолюминесценции с функцией GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ мониторинга функции GPCR в животном, отличном от человека, включающий (a) трансгенное модифицирование животного, отличного от человека, для экспрессии трансгена, содержащего первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент; (b) манипулирование животным, отличным от человека, для имитации аспекта болезненного состояния; (c) мониторинг люциферазы животного, отличного от человека; и (d) коррелирование указанной биолюминесценции с функцией GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ создания трансгенного животного, отличного от человека, для применения в мониторинге функции GPCR, включающий (a) трансгенное модифицирование животного, отличного от человека, для экспрессии трансгена, содержащего первый инсуляторный элемент, ответный элемент, промотор, биолюминесцентный репортер, функциональный элемент и второй инсуляторный элемент; (b) измерение количества биолюминесценции в трансгенном животном, отличном от человека, из (a); (c) введение лиганда GPCR трансгенному животному, отличному от человека; (d) измерение количества биолюминесценции трансгенного животного, отличного от человека, в один или более моментов времени после введения лиганда GPCR; и (e) сравнение количества биолюминесценции, измеренной в (b), с количеством биолюминесценции, измеренной в (d), где разница в количестве биолюминесценции в (b) по сравнению с (d) идентифицирует трансгенное животное, отличное от человека, для применения в мониторинге функции GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации соединения, которое модулирует рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR), включающий (a) приготовление клетки, выделенной из трансгенного животного, отличного от человека, раскрытого в данном описании; (b) измерение количества биолюминесценции в клетке; (c) введение тестируемого средства в клетку; (d) измерение количества биолюминесценции в клетке в один или более моментов времени после введения тестируемого средства; и (e) сравнение количества биолюминесценции, измеренной в (b), с количеством биолюминесценции, измеренной в (d), где разница в количестве биолюминесценции в (b) по сравнению с (d) идентифицирует тестируемое средство как лиганд GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации соединения, которое модулирует рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR), включающий (a) предоставление клеток, выделенных из трансгенного животного, отличного от человека, раскрытого в данном описании, в один или более сосудов; (b) введение контроля в один или более сосудов; (c) введение тестируемого средства в один или более сосудов; и (d) измерение количества люциферазы в сосудах, где разница в количестве люциферазы, измеренной в сосуде(ах), содержащем контроль, по сравнению с количеством люциферазы в сосуде(ах), содержащем тестируемое средство, идентифицирует соединение как модулирующее GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения является способ идентификации соединения, которое модулирует рецептор, сопряженный с G-белком (GPCR), включающий (a) предоставление клеток, выделенных из трансгенного животного, отличного от человека, раскрытого в данном описании, в один или более сосудов; (b) введение неспецифического модулятора цАМФ в один или более сосудов; (c) введение тестируемого средства в один или более сосудов; и (d) измерение количества люциферазы в сосудах, где разница в количестве люциферазы, измеренной в сосуде(ах), содержащем только неспецифический модулятор цАМФ, по сравнению с количеством люциферазы в сосуде(ах), содержащем неспецифический модулятор цАМФ и тестируемое средство, идентифицирует соединение как модулирующее GPCR.

Вариантом осуществления данного изобретения