Способ получения вирусоподобных частиц растений

Способ получения вирусоподобных частиц растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам получения вирусоподобных частиц (VLP).

Уровень техники

Современные методы рекомбинантной экспрессии в клетках- хозяевах, таких как Е. coli, культура клеток насекомых и культура клеток млекопитающих, позволяют достигать высоких уровней экспрессии и секреции белков в культуральной среде. При использовании этих систем достигаются высокие уровни экспрессии, правильный фолдинг (укладка) и соответствующая посттрансляционная модификация белков. Помимо этого, упрощается очистка экспрессируемого белка, так как внутриклеточные белки могут легко отделяться от других компонентов (ДНК, везикул, мембран, пигментов и т.д.). В случае систем экспрессии растительного происхождения и дрожжевой системы экспрессии клеточная стенка предупреждает секрецию экспрессируемого белка в культуральную среду.

Одним из основных методов борьбы с вирусными инфекциями является вакцинация. В ответ на вспышку эпидемии или для удовлетворения сезонных потребностей (например, ежегодное наступление "периода заболеваний гриппом", или недавние вспышки "свиного гриппа", наблюдаемые во всем мире) необходимо получать достаточное количество вакцины за короткий период времени. Современный мировой объем производства вакцин гриппа может быть недостаточен перед лицом пандемии гриппа. Помимо этого, доминирующие штаммы гриппа год от года изменяются, так что создание запасов в периоды низкой потребности в вакцине нецелесообразно. Экономичное массовое производство эффективной вакцины против гриппа имеет существенно важное значение.

Для приготовления противогриппозных вакцин можно применять вирусоподобные частицы (VLP). Сверхструктуры, такие как VLP, имитируют структуру вирусного капсида, но не содержат генов и поэтому не могут реплицироваться или обеспечивать механизм вторичной инфекции. VLP предлагают улучшенную альтернативу для выделенных (растворимых) рекомбинантных антигенов стимулировать мощный иммунный ответ.VLP собираются после экспрессии специфических вирусных белков и находятся на внешней поверхности, напоминая внешнюю поверхность соответствующего вируса, но в отличие от истинной вирусной частицы, не включают генетический материал. Презентация антигенов в частичной и мультивалентной структуре, аналогично презентации нативного вируса, обеспечивает усиленную стимуляцию иммунного ответа со сбалансированными гуморальным и клеточным компонентами. Полагают, что такое улучшение по сравнению со стимуляцией изолированными антигенами особенно верно для оболочечных вирусов, таких как оболочечные VLP, представляющие поверхностные антигены в их естественном мембраносвязанном состоянии (Grgacic and Anderson, 2006, Methods 40, 60-65). Помимо этого, показано, что VLP гриппа, с их организацией в виде наночастиц, являются лучшими кандидатами по сравнению с рекомбинантным гемагглютинином (НА) (т.е. мономерным НА, или НА, организованным в виде "розеток": сборки из 3-8 тримеров НА), и они способны активировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ.(Bright, R.A., et. al.,. 2007, Vaccine 25, 3871-3878).

Подавляющее большинство вакцин гриппа, имеющихся в настоящее время на рынке, состоят из вирусных частиц или вирусных антигенов, полученных из вирионов, выращенных в яйцах. Получение аллантоисных вакцин основано на культивировании живых вирусов на аллантоисной оболочке куриных эмбрионов. "Сплит"- вакцины гриппа (вакцины из расщепленных вирусов гриппа) получают после химической дезактивации и разрушения очищенных вирионов с помощью детергента. Рекомбинантные антигены вирусов гриппа являются эффективной альтернативой вирусных антигенов в качестве "вакцинных продуктов". Рекомбинантные антигены можно получать, используя информацию о генетическом составе нового штамма, как только она становится доступной и позволяет быстро инициировать процесс производства. Однако, по- видимому, очищенные рекомбинантные НА субъединицы менее эффективны, чем инактивированные "сплит"- вакцины гриппа, и для того, чтобы вызвать мощный иммунный ответ, требуется повышенное содержание антигенов (Treanor et al., 2007, J. Am. Med. Assoc. 297, 1577-1582).

VLP гриппа получены в культивированных клетках млекопитающих при совместной экспрессии (коэкспрессии) всех 10 белков гриппа (Меnа et al., 1996, J. Virol. 70, 5016-5024). Некоторые вирусные белки необязательны для продуцирования VLP, и VLP гриппа в программах разработки вакцин получали при совместной экспрессии 2 основных антигенных оболочечных белков (НА и NA) с M1 или при совместной экспрессии только НА и M1 (Kang et al., 2009, Virus Res. 143, 140-146). Chen et al. (2007, J. Virol. 81, 7111-7123) показали, что один НА способен обусловливать образование и отпочковывание VLP, и в их системе совместную экспрессию с Ml можно опустить. Однако, так как найдено, что НА связывается с сиалилированными белками на поверхности клеток млекопитающих, продуцирующих VLP, совместно экспрессируется вирусная сиалидаза, обеспечивая высвобождение VLP из экспрессирующих клеток после отпочковывания.

Для ускорения разработки вакцин желательна более простая система продуцирования VLP, например, система, не требующая экспрессии неструктурных вирусных белков. Получение вирусных антигенов, включающих VLP, в системах растений обеспечивает преимущество продуцирования тем, что их можно выращивать в теплице или в поле и не требуется методов культивирования и обработки тканевых культур в асептических условиях.

В опубликованной Международной заявке РСТ WO 2006/119516 (выданной Williamson and Rybicki) раскрывается экспрессия полноразмерного и усеченного человеческого, оптимизированного по кодону Н5 НА вируса гриппа A/Vietnam/1194/2004 в растениях. В усеченной конструкции отсутствует мембранозаякоренный домен. Наивысшую аккумуляцию белка НА получают при использовании конструкций, нацеленных на ER. Конструкции, в которых отсутствует домен, нацеливающий на мембрану, не дают детектируемых количеств НА. О продуцировании VLP не сообщалось.

Продуцирование НА VLP вируса гриппа, которые содержит липидную оболочку, описывалось заявителями ранее в Международных патентных заявках WO 2009/009876 и WO 2009/076778 (принадлежащих D'Aoust et al.; обе эти заявки вводятся в данное описание посредством отсылки). В случае оболочечных вирусов может быть предпочтительным, чтобы липидный слой или мембрана удерживались вирусом. Состав липида может меняться в зависимости от системы (например, оболочка продуцируемого в растении оболочечного вируса будет включать растительные липиды или фитостеролы) и может способствовать усиленному иммунному ответу.

Сборка оболочечных VLP в трансгенном табаке, экспрессирующем HBV поверхностный антиген (HBsAg) HBV, описана Mason et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11745-11749). Было показано, что продуцируемые в растениях HBV VLP, при парентеральном введении, вызывают мощный В- и Т- клеточный иммунный ответ (Huang et al., 2005, Vaccine 23, 1851-1858), но пероральная иммунизация в исследованиях с введением их с пищей вызывает умеренный иммунный ответ (Smith et al., 2003, Vaccine 21, 4011-4021). Greco (2007, Vaccine 25, 8228-8240) показал, что эпитопы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV) при слиянии с HBsAg накапливаются (аккумулируются) в виде VLP при экспрессии в трансгенном табаке и в Arabidopsis (арабидопсисе), давая бивалентную VLP вакцину.

Экспрессия вирусного капсидного белка (NVCP) в трансгенных растениях табака и картофеля приводит к сборке безоболочечных VLP (Mason et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5335- 5340). NVCP VLP продуцировались в листьях агроинфильтрованного Nicotiana benthamiana (семейство пасленовые) (Huang et al. 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714), и их иммуногенность при пероральном введении продемонстрирована на мышах (Santi et al., 2008, Vaccine 26, 1846-1854). Введение взрослым добровольцам 2 или 3 доз сырого картофеля, содержащих 215-751 мкг NVCP в виде VLP, привело к проявлению иммунного ответа у 95% иммунизированных добровольцев (Tacket et al. 2000, J. Infect. Dis. 182, 302-305). Также получали безоболочечные VLP при экспрессии HBV корового антигена (HBcAg; Huang et al., 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714), и основного капсидного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) (Varsani et al., 2003, Arch. Virol. 148,1771-1786).

Перед тем, как использовать VLP в составе вакцины, может быть целесообразным отделить VLP от некоторых, или всех белков, углеводов и т.д., имеющихся в растении или растительном материале. Метод экстракции (извлечения) белка из внутриклеточного пространства, включающий процесс вакуумирования и центрифугирования для получения экстракта интерстициальной жидкости, содержащей целевой белок, описан в опубликованной Международной заявке РСТ WO 00/09725 (выданной Turpen et al.). Такой подход пригоден для малых белков (длиной 50 кДа или менее), которые проходят через поры при вакуумировании и центрифугировании, но не пригодны для белков с суперструктурами большего размера или белковых комплексов, таких как VLP.

McCormick et al 1999 (Proc Natl Acad Sci USA 96:703- 708) раскрывают применение сигнального пептида амилазы зерна риса, слитого с одноцепочечным Fv (scFv) эпитопом, для нацеливания экспрессируемого белка на внеклеточный компартмент с последующей вакуум-инфильтрацией тканей листа и стебля для извлечения scFv полипептидов. Moehnke et al., 2008 (Biotechnol Lett 30: 1259-1264) описывают применение вакуум-инфильтрации по McCormick для получения рекомбинантного растительного аллергена из растения табака методом экстракции апопласта. В опубликованной Международной заявке РСТ WO 2003/025124 (выдана Zhang et al.) раскрывается экспрессия scFv иммуноглобулинов в растениях, нацеливающих на апопластическое пространство, с применением мышиных сигнальных последовательностей.

Принимая во внимание сложность VLP и растительной ткани, в которой их можно продуцировать, все еще остается потребность в способах получения VLP, которые по существу не содержат растительных белков или могут быть легко отделены от них, с сохранением структурных и иммуногенных характеристик оболочечного вируса.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения вирусоподобных частиц Ha(VLP) основе растений. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения VLP, содержащих антигены вируса гриппа.

Целью данного изобретения является предоставление усовершенствованного способа получения вирусоподобных частиц на основе растений.

Настоящее изобретение предусматривает способ (А) получения VLP на основе растений, включающий получение растения или растительного материала, содержащего VLP на основе растений, локализованных в апопласте (во внеклеточной структуре); получение фракции протопластов и фракции апопласта, причем фракция апопласта содержит VLP на основе растений; и регенерацию (выделение) фракции апопласта. Помимо этого, способ может включать стадию очистки VLP на основе растений от фракции апопласта. VLP на основе растений может представлять собой химерную VLP на основе растений. VLP на основе растений можно выбирать из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса. VLP на основе растений могут содержать гемагглютинин вируса гриппа. Фракции апопласта и протопластов можно получать, обрабатывая растение или растительный материал с помощью ферментной композиции. Ферментная композиция может содержать одну или более пектиназ, одну или более целлюлаз или одну или более пектиназ и одну или более целлюлаз. Далее, при необходимости, ферментная композиция не включает липазу или протеазу, или композиция не включает дополнительную липазу или протеазу.

Растение или растительный материал можно получать выращиванием, сбором или выращиванием и сбором растения. Растительный материал может представлять собой некоторую часть растения или целое растение, одну или более растительных клеток, листья, стебли, корни растения или культивируемые клетки растения.

Настоящее изобретение включает способ получения VLP на основе растений, как описано выше (Метод А), отличающийся тем, что нуклеиновую кислоту, кодирующую VLP, выбранный из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса, временно (транзиторно) вводят в растение. Или же нуклеиновую кислоту стабильно интегрируют в растительный геном.

Настоящее изобретение включает способ получения VLP на основе растений, описанный выше (Метод А), дополнительно включающий стадию очистки VLP на основе растений от фракции апопласта. Стадия очистки может включать фильтрование фракции апопласта глубинной фильтрацией, при этом получают осветленный экстракт, с последующей хроматографией осветленного экстракта на катионообменной смоле.

Не желая связывать себя какой-либо теорией, можно сказать, что белки, полученные из апопласта, являются более гомогенными, так как промежуточные формы посттрансляционных модифицированных белков или белки, включающие другие типы процессирования, которое происходит в различных внутриклеточных компартментах, не экстрагируются совместно. Повышенная степень гомогенности рекомбинантного белка, как правило, позволяет в результате получать препарат, содержащий белок, более высокого качества, и в конце концов можно получать продукт с более благоприятными свойствами, включая более высокую эффективность, более продолжительный период полужизни или лучшие иммуногенные свойства. Например, белки крови с высокой степенью гликозилирования маннозой элиминируют в кровотоке быстрее, чем белки со сложным гликозилированием. В гликозилированном белке, продуцированном во фракции апопласта, наблюдается гликозилирование более сложного типа. Поэтому у белка из апопласта, полученного методами по данному описанию, включая разрушение (гидролиз, расщепление) клеточной стенки, продолжительность полужизни в кровотоке выше.

Настоящее изобретение предусматривает также способ (В) получения VLP на основе растений, содержащих оболочку из растительных липидов, причем этот способ включает получение растения или растительного материала, содержащего VLP, локализованные в апопласте; обработку растения или растительного материала ферментной композицией с получение фракции протопластов и одной или более одной композиции белка апопласта; выделение одного или более белковых комплексов апопласта из фракции протопластов, причем один или более белковых комплексов апопласта содержат VLP. Ферментная композиция может содержать одну или более пектиназ, одну или более целлюлаз или одну или более пектиназ и одну или более целлюлаз. Далее, при необходимости, ферментная композиция не включает липазу или протеазу, или композиция не включает дополнительную липазу или протеазу. VLP на основе растений может представлять собой химерную VLP на основе растений. VLP на основе растений можно выбирать из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса. VLP на основе растений могут содержать гемагглютинин вируса гриппа.

Настоящее изобретение включает способ получения VLP, описанный выше (Метод В), отличающийся тем, что нуклеиновую кислоту, кодирующую VLP, выбранную из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса, вводят в растение транзиторно (временно). Или же, нуклеиновую кислоту стабильно интегрируют в геном растения.

Настоящее изобретение охватывает способ получения VLP на основе растений, описанный выше (Метод В), дополнительно включающий стадию очистки VLP на основе растений от фракции апопласта. Стадия очистки может включать фильтрование фракции апопласта глубинной фильтрацией, при этом получают осветленный экстракт, с последующей хроматографией осветленного экстракта на катионообменной смоле.

VLP на основе растений могут включать VLP, содержащие один или более НА полипептидов вируса гриппа. НА полипептид вируса гриппа может также представлять собой химерный НА полипептид. Кроме того, VLP на основе растений могут содержать гемагглютинирующую активность. Растения или растительный материал можно получать выращиванием, сбором или выращиванием и сбором или выращиванием и сбором растения. Растительный материал может представлять собой некоторую часть растения или целое растение, или одну или более растительных клеток, листья, стебли, корни растения или культивированные клетки растения.

Настоящее изобретение охватывает также способ (С) получения VLP на основе растений, включающий получение растения или растительного материала, содержащего VLP на основе растений, расщепление (гидролиз) растительного материала с помощью ферментной композиции, разрушающей клеточную стенку, с образованием обработанной (расщепленной) фракции и фильтрование обработанной (расщепленной) фракции, в результате чего получают отфильтрованную фракцию, и извлечение VLP на основе растений из отфильтрованной фракции.

Ферментная композиция может содержать одну или более пектиназ, одну или более целлюлаз или одну или более пектиназ и одну или более целлюлаз. Далее, при необходимости, ферментная композиция не включает липазу или протеазу, или композиция не включает дополнительную липазу или протеазу. VLP на основе растений может представлять собой химерную VLP на основе растений. VLP на основе растений можно выбирать из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса. VLP на основе растений могут содержать гемагглютинин вируса гриппа.

Настоящее изобретение включает способ получения VLP, описанный выше (Метод С), отличающийся тем, что нуклеиновую кислоту, кодирующую VLP, выбранную из группы вирусных оболочечных белков, вирусных структурных белков, вирусных капсидных белков и белков оболочки вируса, вводят в растение транзиторно (временно). Или же, нуклеиновую кислоту стабильно интегрируют в геном растения.

Настоящее изобретение охватывает способ получения VLP на основе растений, описанный выше (Метод С), дополнительно включающий стадию очистки VLP в отфильтрованной фракции (фракции после фильтрации) от клеточного осадка и нерастворимых материалов. Стадию отделения (выделения) можно осуществлять центрифугированием, глубинной фильтрацией или как центрифугированием, так и глубинной фильтрацией, получая осветленную фракцию. VLP на основе растений можно далее очищать хроматографией, например, осветленный экстракт можно очищать хроматографией на катионообменной смоле.

VLP на основе растений могут включать VLP, содержащие один или более НА полипептидов вируса гриппа. НА полипептид вируса гриппа может также представлять собой химерный НА полипептид. Кроме того, VLP на основе растений могут содержать гемагглютинирующую активность. Растения или растительный материал можно получать выращиванием, сбором или выращиванием и сбором или выращиванием и сбором растения. Растительный материал может представлять собой некоторую часть растения или целое растение, или одну или более растительных клеток, листья, стебли, корни растения или культивированные клетки растения.

Не желая связывать себя какой- либо теорией, можно сказать, что VLP на основе растений, содержащие липиды растительного происхождения, могут вызывать более сильный иммунный ответ, чем VLP, полученные в других системах, и что иммунная реакция, вызванная этими VLP, сильнее иммунной реакции, вызванной живой или аттенюированной вакциной на основе целых вирусных частиц.

Композиция белкового экстракта, полученного при использовании клетки-хозяина, является сложной и, как правило, содержит межклеточные и внутриклеточные компоненты наряду с белком или целевой супраструктурой, которую нужно выделять. Получение фракции апопласта с последующей стадией разделения внутриклеточных белков и компонентов является предпочтительным, так как может происходить обогащение белком или целевой супраструктурой и повышаться эффективность процесса производства. Более простой процесс, включающий меньше эффективных стадий, может иметь результатом значительное повышение выхода и уменьшение стоимости. Обнаружено также, что процесс разрушения клеточной стенки под действием ферментов, разрушающих клеточную стенку, повышает выход VLP белка, даже если протопласты не остаются интактными в процессе экстракции. Не желая связывать себя какой- либо теорией, можно сказать, что на стадии разрушения клеточных стенок полимерные компоненты клеточных стенок могут освобождаться и способствовать высвобождению VLP, иначе ассоциированных с клеточной стенкой. Этот протокол позволяет также свести к минимуму загрязнение VLP во внутриклеточных компонентах.

Методы разрушения стенок растительных клеток известны, и смеси для ферментных коктейлей, которые разрушают клеточные стенки, могут меняться. Настоящее изобретение не ограничивается используемым методом разрушения клеточных стенок.

Методы по данному описанию вызывают меньшее разрушение и загрязнение экстракта VLP на основе растений по сравнению с методами получения VLP на основе растений, включающими гомогенизацию, смешение или измельчение. Методы по данному описанию предоставляют фракцию апопласта растительной ткани, это может сохранять целостность протопластов и их компонентов. Метод по данному описанию позволяет эффективно очищать VLP, даже если протопласты, или часть протопластов, утрачивают свою целостность и более не являются интактными.

Эти методы обеспечивают более высокий выход VLP по сравнению с методами экстракции VLP, включающими стандартные методики разрушения ткани, например, гомогенизацию, смешение или измельчение. Повышенный выход может быть достигнут, частично, вследствие уменьшения напряжения сдвига, которое нарушает структурную целостность VLP и/или липидной оболочки. Получение VLP из фракции апопласта может быть предпочтительным, так как фракции апопласта содержат значительно меньше, или совсем не содержат, цитоплазматических белков. Следовательно, отделение VLP от других белков и материала, включая НА мономеры, тримеры или фрагменты НА, во фракции апопласта осуществляется просто. Однако, повышенные выходы VLP можно также получать методами по данному описанию, даже если препарат протопластов, или часть препарата протопластов, не являются интактными.

VLP по настоящему изобретению характеризуются также более высокой гемагглютинирующей активностью, чем VLP, полученные стандартными методами разрушения тканей. Эта повышенная гемагглютинирующая активность может являться результатом более высокого выхода интактных VLP (меньше свободных НА мономеров или тримеров в растворе), более высокого выхода интактных VLP с интактными липидными оболочками, или их сочетания.

Преимущество вакцин, приготовленных с применением VLP, по сравнению с вакцинами, приготовленными из целых вирусов, заключаются в том, что они не являются инфицирующими. Следовательно, меры предосторожности при работе с биологическим материалом не являются актуальными и не требуются для продуцирования. Другим преимуществом VLP на основе растений является то, что они позволяют выращивать систему экспрессии в теплице или в поле, являясь поэтому значительно более экономичными и подходящими для промышленных масштабов.

Кроме того, растения не содержат ферментов, участвующих в синтезе и присоединении остатков сиаловой кислоты к белкам. VLP можно продуцировать в отсутствие нейраминидазы (NA), и отсутствует необходимость в том, чтобы совместно экспрессировать NA, или обрабатывать продуцирующие клетки, или экстрагировать с применением сиалидазы (нейраминидазы), чтобы гарантировать продуцирование VLP в растениях.

В этом кратком изложении изобретения необязательно описываются все признаки изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Эти и другие признаки изобретения станут более очевидными из нижеприведенного описания, в котором даются ссылки на прилагаемые фигуры:

На Фигуре 1 схематически представлена кассета экспрессии на основе CPMVHT (конструкция 685) для экспрессии Н5 A/Indonesia/5/05 гемагглютинина.

На Фигуре 2А показаны нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) участка конструкции для экспрессии H5/Indo (конструкции номер 685) от РасI (в направлении 3'-5' от 35S промотора) до AscI (сразу же 5'-3' от NOS терминатора транскрипции). Последовательность, кодирующая Н5 из A/Indonesia/5/2005, подчеркнута. На Фигуре 2 В показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NО: 2) Н5 A/Indonesia/5/05 гемагглютинина, кодируемая конструкцией номер 685.

На Фигуре 3 показана эксклюзионная хроматография (SEC) гемагглютинин (НА)- содержащих структур. После центрифугирования расщепленного растительного экстракта осадок ресуспендируют и фракционируют методом SEC. На Фигуре 3А показано содержание тотального растворимого белка во фракции (черные треугольники; % от максимума, слева от оси Y; определяют методом Бредфорд). Также показана гемагглютининовая активность собранных фракций (закрашенные столбцы; справа от оси Y). На Фигуре 3 В представлено изучение SEC- элюированных фракций методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия SDS- PAGE. Перед анализом Фракции осаждают ацетоном и перед анализом ресуспендируют в объеме 1/40 восстанавливающего буфера для образцов. Гель окрашивают 0.1% раствором Кумасси R- 250. Очищенные VLP используют в качестве контроля. Полоса, соответствующая НАО мономеру, показана стрелкой. MW - стандарты молекулярной массы (кДа); С - Очищенные VLP (контроль); дорожки от 7 до 10 и от 14 до 16 соответствуют номерам фракций, элюированных в ходе SEC, показанным на Фигуре ЗА.

На Фигуре 4 сравниваются профили белков, полученных ферментативным расщеплением и механической гомогенизацией с применением гомогенизатора Comitrol™. Образцы обрабатывают в денатурирующем буфере для образцов и белки разделяют методом SDS- PAGE элюированных фракций. Гели окрашивают 0.1% раствором Кумасси R- 250. MW - Стандарты молекулярной массы (кДа); дорожка 1 -25 мкл смеси ферментов; дорожка 2-25 мкл продуктов ферментативного расщепления растительной ткани и дорожка 3-5 мкл экстракта, полученного на гомогенизаторе Comitrol.

На Фигуре 5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 9) кассеты экспрессии НА, включающая промотор и 5' UTR (нетранслируемую область) пластоцианина люцерны, гемагглютинин- кодирующую область Н5 из A/Indonesia/5/2005 (Конструкция # 660), 3' UTR и терминаторную последовательность пластоцианина люцерны.

На Фигуре 6 показано, что нанесение (захват) НА-VLP на катионообменную смолу непосредственно приводит к отделению НА-VLP во фракции апопласта. Образцы обрабатывают невосстанавливающим буфером для образцов и белки разделяют методом SDS- PAGE. Гели окрашивают 0.1% раствором Кумасси R-250. Дорожка 1: Фракция апопласта после центрифугирования. Дорожка 2- 3: Фракция апопласта после последующей микрофильтрации; Дорожка 4: Загрузка на катионообменную смолу; Дорожка 5: Проточная фракция с катионообменной колонки. Дорожка 6; элюция с катионообменной колонки, концентрировано 10Х; Дорожка 7:

Стандарты молекулярной массы (кДа).

На Фигуре 7 показан полученный способом анализа Nanoparticle Tracking analysis, (NTA) профиль H5/Indo VLP (А) и Hl/Cal VLP (В) после осветления без добавления NaCl к буферу для расщепления и Hl/Cal VLP (С) с таким добавлением. Эксперименты NTA проводят на приборе NanoSight LM20 (NanoSight, Amesbury, UK). Прибор снабжен голубым лазером (405 нм), камерой для образцов и уплотнителем о-ring из фторэластомера Viton. Видеоизображения регистрируют при комнатной температуре и анализируют с помощью программы NTA 2.0. Образцы регистрируют в течение 60 сек. Затвор и усилитель выбирают вручную таким образом, чтобы получить оптимальное разрешение для частиц.

На Фигуре 8 показан Вестерн-блоттинг экстракта Н3/Brisbane VLP, получаемого ферментативным расщеплением с применением различных буферов. Дорожка 1) Стандартный чистый рекомбинантный НА (5 мкг, от Immune Technology Corp.IT-003-0042p) Дорожки со.2 до 5 содержат 7 мкл центрифугированного ферментативного экстракта, применяют следующие буферы: Дорожка 2) 600 мМ маннита +125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+25 мМ ЭДТА+0.04% бисульфита рН6.2, Дорожка 3) 600 мМ маннита +125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+50 мМ ЭДТА+0.04% бисульфита рН 6.2, Дорожка 4) 200 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+25 мМ ЭДТА+0.03% бисульфита рН 6.2, Дорожка 5) 200 мМ маннита+125 мМ цитрата+75 мМ NaPO₄+50 мМ ЭДТА+0.03% бисульфита рН 6.2. Стрелкой показан сигнал иммунодетекции НАО.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к способам получения вирусоподобных частиц (VLP) на основе растений. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения VLP, содержащих гемагглютинин вируса гриппа (НА).

Ниже представлено описание предпочтительного варианта изобретения.

Настоящее описание включает способ получения целевого белка или целевой белковой супраструктуры. Целевой белок может находиться в апопласте или внеклеточном компартменте, соответствующем участку растительной клетки, за исключением компартмента протопластов/сферопластов. Этот способ включает извлечение, разрушение или как разрушение, так и извлечение целлюлозной клеточной стенки, окружающей растительные клетки. При разрушении клеточной стенки полимерные компоненты клеточной стенки разрыхляются и целевой белок или целевая белковая супраструктура может легче высвобождаться. Этим способом происходит обогащение целевым белком или целевой белковой супраструктурой, так как компартмент протопластов/сферопластов, который содержит основные белки и компоненты клеток- хозяев, отделяется от апопласта. Как отмечается ниже, способ по данному изобретению эффективен также при получении целевого белка или целевой белковой супраструктуры, если в ходе процесса утрачивается целостность компартмента протопластов/сферопластов, если компартмент протопластов/ сферопластов не является интактным и если часть белков и компонентов клеток-хозяев из компартмента протопластов/сферопластов присутствует во фракции апопласта.

Примерами белковых супраструктур являются структуры, состоящие из двух или более полипептидов; полипептиды могут быть одинаковьми или различными;

будучи различными, они могут присутствовать в примерном соотношении от 1:1 до 10:1 или выше. Белковая супраструктура может дополнительно содержать один или более липидов, фосфолипидов, нуклеиновых кислот, мембран и т.п.Два или более полипептидов могут быть связаны ковалентной связью, дисульфидным мостиком, за счет взаимодействия зарядов, за счет гидрофобного взаимодействия, за счет сил ван дер Ваальса, за счет водородной связи и т.п.Примером белковой супраструктуры является вирусоподобная частица (VLP), которая может быть оболочечной или безоболочечной, например, вирусный оболочечный белок, вирусный структурный белок, вирусный капсидный белок или белок вирусной оболочки.

Настоящее изобретение включает также способ получения вирусоподобных частиц (VLP) на основе растений. Способ включает получение растения или растительного материала, содержащего VLP, локализованные в апопласте; получение фракции протопластов/сферопластов и фракции апопласта из растительного материала, фракции апопласта, содержащей VLP на основе растений и извлечение фракции апопласта.

Настоящее изобретение включает также способ получения VLP, содержащих растительную липидную оболочку. Способ включает получение растения или растительного материала, содержащего VLP, обработка растения или растительного материала ферментной композицией с целью получения одного или более комплексов белков апопласта и фракции протопластов/сферопластов, и выделение одного или более комплексов белков апопласта из фракции протопластов. Один или более комплексов белков апопласта содержит VLP, включающие растительную липидную оболочку.

Настоящее изобретение включает также способ получения VLP на основе растений, включающий получение растения или растительного материала, которые содержат VLP на основе растений, расщепление растительного материала с использованием разрушающей ферментной композиции с получением расщепленной фракции и фильтрование расщепленной фракции с получением отфильтрованной фракции (фильтрата) и выделение из отфильтрованной фракции (из фильтрата) VLP на основе растений. В этом способе целостность протопластов может быть необязательной.

Протопласт представляет собой растительную клетку, у которой клеточная стенка полностью или частично удалена. У сферопласта клеточная стенка может быть частично удалена. Протопласт, сферопласт или как протопласт, так и сферопласт (протопласт/сферопласт) можно использовать по данному описанию и эти термины, применяемые в данном описании, являются эквивалентными. Клеточную стенку можно разрушать и удалять механическим способом (например, гомогенизацией, смешением), клеточную стенку можно полностью или частично разрушить ферментативным способом, или клеточную стенку можно удалять комбинируя механические и ферментативные методы, например, применять гомогенизацию с последующей обработкой ферментами для разрушения клеточной стенки. Протопласты можно также получать с применением культивируемых растительных клеток, например, культур растительных клеток на жидких или твердых средах.

Стандартные справочные издания, в которых излагаются общие принципы культур растительных тканей, культивируемых растительных клеток и получения протопластов, сферопластов и т.п., включают: Introduction to Plant Tissue Culture, by MK Razdan 2^nd Ed. (Science Publishers, 2003; вводится в данное описание посредством отсылки), или см., например, следующий URL (адрес ресурса в Интернете): molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htm. Обзор методов и оборудования, относящихся к получению протопластов (или сферопластов) и работе с ними, представлен, например, в Davey MR et al., 2005 (Biotechnology Advances 23: 131-171; вводится в данное описание посредством отсылки). Стандартные справочные издания, в которых излагаются общие методы и принципы биохимии белков, молекулярной биологии и т.п., включают, например, Ausubel et al. Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 and Supplements to 2001;

вводится в данное описание посредством отсылки); Sambrook et al., Molecular Cloning:

A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York, 1989 (вводится в данное описание посредством отсылки); Kaufman et al, Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton, 1995 (вводится в данное описание посредством отсылки); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991 (вводится в данное описание посредством отсылки).

Ферменты, применимые для расщепления или разрушения клеточных стенок с целью высвобождения либо протопластов, либо сферопластов, известны специалисту в данной области техники и могут включать целлюлазу (ЕС 3.2.1.4), пектиназу (ЕС 3.2.1.15), ксиланазу (ЕС 3.2.1.8), хитиназы (ЕС 3.2.1.14), гемицеллюлазу или их комбинацию. Неограничивающие примеры подходящих ферментов включают многокомпонентную смесь ферментов, содержащую целлюлазу, гемицеллюлазу и пектиназу, например MACEROZYME™ (эта смесь имеет примерный состав:

целлюлаза: 0.1 Ед/мг, гемицеллюлаза: 0.25 Ед/мг и пектиназа: 0.5 Ед/мг). Другие примеры продажных ферментов, смесей ферментов и фирм- поставщиков приводятся в Таблице 1 (см.: Introduction to Plant Tissue Culture, by MK Razdan 2^nd Ed.., Science Publishers, 2003).

Другие названия и типы целлюлаз включают следующие: эндо-1,4-β- D-глюканаза; β-1,4- глюканаза; β-1,4- эндоглюкан гидролаза; целлюлаза А; целлюлозин АР; эндоглюканаза D; щелочная целлюлаза; целлюлаза А 3; целлюдекстриназа; 9.5 целлюлаза; авицелаза; панцеллаза SS и 1,4- (1,3;1,4)-β- D- глюкан 4-глюканогидролаза. Другие названия и типы пектиназ (полигалоктуроназ) включают следующие: пектин деполимераза; пектиназа; эндополигалактуродаза; эндолаза; пектин гидролаза; пектин полигалактуроназа; эндо- полигалактуроназа; поли- α- 1,4-галактуронид гликаногидролаза; эндогалактуроназа; эндо- D- галактуроназа и поли (1,4- α- D- галактуронид) гликаногидролаза. Другие названия и типы ксиланаз включают следующие: гемицеллюлаза, эндо- (1→4)-β- ксилан 4- ксиланогидролаза; эндо- 1,4- ксиланаза; ксиланаза; β- 1,4- ксиланаза; эндо- 1,4- ксиланаза; эндо-β- 1,4-ксиланаза; эндо- 1,4- β- D- ксиланаза; 1,4-β- ксилан ксиланогидролаза; Р- ксиланаза; β-1,4- ксилан ксиланогидролаза; endo-1,4-β- ксиланаза; β- D- ксиланаза. Другие названия и типы хитиназ включают следующие: хитодекстриназа; 1,4- β- поли- N-ацетилглюкозаминидаза; поли- β- глюкозаминидаза; β- 1,4- поли- N- ацетил глюкозаминидаза; поли[1,4- (N- ацетил- β- D- глюкозаминид)] гликаногидролаза.

Таблица 1:
Неограничивающие примеры коммерчески доступных ферментов для выделения протопластов
Фермент	Источник	Фирма-поставщик
Целлюлазы