Биоактивные композиции и метаболиты chromobacterium

Биоактивные композиции и метаболиты chromobacterium

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

В настоящей заявке предложены биоактивные композиции и метаболиты, полученные из Chromobacterium, в частности из культуры Chromobacterium substugae, ответственные за регулирование численности вредителей, а также способы их применения для регулирования численности вредителей.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Натуральными продуктами являются вещества, которые вырабатываются микроорганизмами, растениями и другими организмами. Натуральные продукты микробного происхождения являются распространенным источником различных химических веществ, и применение натуральных продуктов в фармацевтических целях имеет длинную историю. Несмотря на широкое применение натуральных продуктов в качестве терапевтических средств для человека, более 50% из которых получают из натуральных продуктов, лишь 11% пестицидов получают из натуральных источников. Тем не менее, пестициды на основе натуральных продуктов могут играть важную роль для регулирования численности вредителей в традиционном земледелии и земледелии с использованием органических удобрений. Вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами (бактериями, актиномицетами и грибками), обеспечивают получение новых химических соединений, которые можно применять по отдельности или в комбинации с известными соединениями для эффективного контроля численности насекомых-вредителей и для снижения риска развития резистентности у вредителей. Существует несколько широко известных примеров натуральных продуктов микробного происхождения, которые успешно применяют в качестве сельскохозяйственных инсектицидов (Thompson et al., 2000; Arena et al., 1995; Krieg et al., 1983).

Разработку микробных пестицидов начинают с выделения чистой культуры микроорганизмов. Затем проводят скрининг для определения эффективности и спектра действия с применением in vitro, in vivo исследований или опытно-промышленных испытаний в теплицах и в поле. В это же время активные соединения, вырабатываемые микроорганизмами, выделяют и идентифицируют. Для успешной коммерческой реализации микробного пестицида необходима возможность экономичного получения микроорганизма путем ферментации в промышленных масштабах и введения микроорганизмов в составы совместно с биосовместимыми и одобренными добавками для увеличения эффективности, максимально возможного упрощения применения, а также для обеспечения стабильности при хранении в полевых условиях.

Поскольку фермеры стараются расширить свой арсенал инсектицидов, и на рынке появляются новые продукты микробного происхождения, возникают различные варианты взаимного применения новых и уже существующих инсектицидов. Часто применяют комбинации, состоящие из 2 или более инсектицидов, которыми одновременно или последовательно обрабатывают монокультуру. Для решения этих вопросов ученые исследовали взаимодействие масел, грибков и химических пестицидов на вредителей и полезных насекомых путем их местного введения, а также введения совместно с пищей (см., например, Chalvet-Monfray, Sabatier et al. 1996; Meunier, Carubel et al. 1999; Hummelbrunner and Isman 2001; Wirth, Jiannino et al. 2004; Farenhorst, Knols et al. 2010; Shapiro-Ilan, Cottrell et al. 2011); тем не менее, еще не все взаимодействия были исследованы.

Chromobacterium

Штамм бета-протеобактерий, Chromobacterium subtsugae, обладает инсектицидной активностью в отношении широкого ряда насекомых (Martin, Blackburn et al. 2004; Martin 2004; Martin, Gundersen-Rindal et al. 2007; Martin, Hirose et al. 2007; Martin, Shropshire et al. 2007). Полагают, что действие обусловлено комбинацией антифидинговой активности и активности токсина, при этом ингибирование питания наблюдают в сублетальных дозах (Martin, Gundersen-Rindal et al. 2007). В частности, обнаружили, что Chromobacterium substugae являются эффективными в отношении взрослых особей колорадского картофельного жука (Leptinotarse decemlineata), взрослых особей западного кукурузного жука (Diabrotica virgifera), взрослых особей и личинок южного кукурузного жука (Diabrotica undecimpunctata), личинок малого ульевого жука (Aethina tumida), личинок капустной моли (Plutella xyllostella), взрослых особей и личинок белокрылки сладкого картофеля (Bernisia tabaci) и взрослых особей зеленого овощного клопа (Nezara viridula).

Со времени открытия С.substugae Мартин с сотрудниками были выделены и охарактеризованы по меньшей мере три новых вида Chromobacteria; Янг с соавторами (Young et al., 2008) выделили новый вид Chromobacterium, С.aquaticum, из родниковой воды на Тайване, а Кампфер с соавторами (Kampfer et al., 2009) выделили два вида, С.piscinae и С.pseudovilaceum, из природных образцов, собранных в Малайзии.

Вторичные метаболиты рода Chromobacterium

Среди всех известных видов Chromobacteria Chromobacterium violaceum исследовали в наибольшей степени, и опубликованная информация о вторичных метаболитах, вырабатываемых Chromobacteria, основана на исследованиях исключительно Chromobacterium violaceum. Дюран и Менк (Duran and Menck, 2001) опубликовали комплексный обзор фармакологических и промышленных перспектив применения Chromobacterium violaceum, грамотрицательного сапрофита, содержащегося в почве и воде. Обычно считается, что эта бактерия является непатогенной для человека, но так как она является условно-патогенным микроорганизмом, то может вызывать септицемию и фатальные инфекции у человека и животных. Известно, что Chromobacterium violaceum вырабатывает фиолетовый пигмент виолацеин, который представляет собой молекулу бис-индола, полученную в результате конденсации двух молекул L-триптофана в присутствии кислорода (Hoshino et al., 1987; Ryan and Drennan; 2009). Биосинтез виолацеина регулируется за счет чувства кворума, общего механизма, регулирующего различные другие вторичные пути метаболизма грамотрицательных бактерий (McClean et al., 1997).

Другие известные метаболиты Chromobacterium violaceum, приведенные в обзоре Дюрана и Менка (2001), включают цианид водорода, ферриоксамин E, бета-лактамные гликопептиды SQ 28504 и SQ 28546, антибиотики, такие как аэроцианидин, аэрокавин, 3,6-дигидроксиидоксазен и монобактам SB-26180, и противоопухолевый депсипептид FR 901228. Согласно обзору Дюрана и Менка (2001) Chromobacterium violaceum также вырабатывает необычные сахаристые соединения, такие как внеклеточные полисахариды и липополисахариды.

Нематоды и нематоциды

Нематоды представляют собой несегментированных двусторонне симметричных червеобразных беспозвоночных, у которых имеются полости тела и полная пищеварительная система, но отсутствуют дыхательные и кровеносные системы. Кожно-мускульный мешок состоит из многослойной кутикулы, гиподермы с четырьмя продольными тяжами и внутренней мускулатуры (Chitwood, 2003). Тело, главным образом, занято пищеварительной и репродуктивной системами. Большинство нематод являются свободноживущими, но небольшое число видов являются распространенными паразитами животных и растений.

Галловые нематоды (root-knot nematode) (Meloidogyne spp.) паразитируют в большом числе однолетних и многолетних культур, воздействуя на качество и количество товарного урожая. Нематоды этого рода считаются наиболее опасными с точки зрения экономических потерь нематодами, паразитирующими в растениях (Whitehead, 1998). Потери урожая однолетних культур, вызванные нематодами, паразитирующими в растениях, оценивались более чем в 100 миллиардов долларов США (Koenning et al., 1999), причем более половины потерь были вызваны нематодами рода Meloidogyne. Высеиваемые культуры этого штамма образуются в яйцах, из которых в благоприятных условиях вылупляются инфицированные личинки второй стадии (J2), которые мигрируют в почве в направлении корня растения-хозяина. Инфицирование происходит в результате проникновения через корневые кончики, после чего личинка перемещается в проводящую ткань, где нематода оседает и получает питание непосредственно из клеток растения. Ответ растения заключается в выработке гигантских клеток, которые образуют галлы (корневые наросты). На протяжении репродуктивного периода самки остаются скрытыми в ткани растения, и только отложенные яйца выводятся из корня.

Наиболее эффективными средствами регулирования численности галловых нематод являются нематоциды, которые подавляют вылупливание яиц, подвижность особей и/или инфицирующую активность в отношении растений. Разработка химических средств для регулирования численности нематод, паразитирующими в растениях, является сложной с учетом экологических и физиологических причин: 1. Большинство фитопаразитических нематод живет в ограниченном пространстве почвы около корней, и, следовательно, доставка химических нематоцидов затруднена. 2. Внешняя поверхность нематод является плохой биохимической мишенью и непроницаема для многих органических молекул (Chitwood, 2003). Кроме того, пероральная доставка токсичных соединений практически невозможна, так как большинство видов нематод, паразитирующих в растениях, поглощают вещество только после того, как они проникают в корни растений и инфицируют их. Таким образом, нематоциды должны представлять собой токсины широкого спектра с высокой летучестью или другими химическими и физическими свойствами, способствующими их перемещению в почве.

В последнее десятилетие галогенированные углеводороды (например, этилендибромид, метилбромид) наиболее широко применяли в качестве нематоцидов по всему миру. Вследствие высокой токсичности для человека и отрицательного воздействия на озоновый слой стратосферы эти соединения были запрещены монреальским протоколом, но разрешение на применение метилбромида для регулирования численности нематод и патогенами растений продлили в Соединенных Штатах из-за отсутствия заменителей. Наряду с органофосфатами карбаматы являются наиболее эффективными нематоцидами, для применения которых не требуется фумигация. К сожалению, большинство карбаматов, таких как алдикарб и оксамил, также являются высокотоксичными. По состоянию на август 2010 года производитель алдикарба, Bayer, согласился аннулировать свидетельство о регистрации продукции, применяемой для обработки картофеля и цитрусовых в США, и алдикарб полностью снимут с производства к концу августа 2018 года. В последнее время абамектин - смесь двух авермектинов, вырабатываемых актиномицетом почвы, Streptomyces avermitilis - был зарегистрирован для применения в качестве нематоцида (Faske and Starr, 2006). Syngenta реализует указанный активный ингредиент в качестве средства обработки семян хлопка и овощей под торговой маркой Avicta^®.

Сообщалось, что некоторые микробные патогены растений/патогены нематод обладают активностью в отношении нематод, паразитирующих в растениях (Guerena, 2006). Эти биологические регуляторы включают бактерии Bacillus thuringiensis, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans и Р.usgae. Pausteria Biosciences запустила производство Р.usgae, обладающих активностью в отношении жалящих нематод, обитающих в торфяных почвах на юго-востоке США. Нематоцидные грибки включают Trichoderma harzianum, Hirsutella rhossiliensis, H.minnesotensis, Verticillium chlamydosporum, Arthrobotrys dactyloides и Paecilomyces lilanicus (реализуются под торговыми марками BioAct^® и Melcon^® компанией Prophyta). Другой грибок, Myrothecium verrucaria, который коммерчески доступен в виде состава, DiTera^®, производства Valent Biosciences, представляет собой мертвый грибок; следовательно его активность вызвана нематоцидными соединениями. Другие коммерческие бионематоциды включают Deny^® и Blue Circle (A cepacia). Activate^® (Bacillus chitinosporus) (Quarles, 2005) и BioNem (Bacillus firmus) производства Israeli (в настоящее время реализуемый Bayer в качестве средства обработки семян Votivo^®) (Terefe et al. 2009). Были выдвинуты предположения, что отрицательное воздействие штаммов микроорганизмов на вылупливание яиц нематод, подвижность особей и инфицирующую активность можно связывать с выработкой токсинов в указанных организмах (Hallman and Sikora, 1996; Marrone et al, 1998; Siddiqui and Mahmood, 1999; Saxena et al., 2000; Meyer and Roberts, 2002), со способностью паразитировать в нематодах или даже захватывать их (Siddiqui and Mahmood, 1996; Kerry, 2001; Jaffee and Muldoon, 1995), с возникновением резистентности хозяина (Hasky-Gunther et al. 1998), с изменением поведения нематод (Sikora and Hoffman-Hergarter, 1993) или с препятствованием распознаванию растений нематодами (Oostendorp and Sikora, 1990).

Растительные нематоциды, такие как растительные экстракты и эфирные масла, можно применять для регулирования численности нематод (Kokalis-Burrelle and Rodriguez-Kabana, 2006). Читвуд (Chitwood) обобщил возможности применения соединений, полученных из растений, для регулирования численности нематод в последнем обзоре (Chitwood, 2002). Сиддики и Алам (Siddiqui and Alam, 2001) показали, что применение почвы для выращивания горшечных растений, содержащей части нима (Azadirachta indica) и китайской ягоды (Melia azidarah) подавляли развитие галловых нематод в томатах. Тем не менее, в настоящее время продукты на основе нима не зарегистрированы в США для регулирования численности нематод. Новый растительный продукт чилийского производства (Nema-Q^®) на основе экстракта дерева Quillaja saponaria, содержащего сапонины (бидесмозидные производные квиллаевой кислоты, замещенные трисахаридом в положении С-3 и олигосахаридом в положении С-28), недавно был зарегистрирован в качестве органического нематоцида в US EPA (агентстве по охране окружающей среды США) и одобрен для земледелия с использованием органических удобрений Институтом экспертизы органических материалов (Organic Materials Review Institute, OMRI). Этот продукт реализуется компанией Monterey AgResources.

Севооборот с использованием культур, которые не могут быть хозяевами нематод, сам по себе часто является достаточной мерой для предотвращения разрастания популяций нематод до угрожающего экономике уровня (Guerena, 2006). Аллелохимикаты представляют собой соединения растительного происхождения, которые воздействуют на поведение организмов в среде растения. Примеры нематоцидных аллелохимикатов включают политиенилы, глюкозинолаты, алкалоиды, липиды, терпеноиды, стероиды, тритерпеноиды и фенолики (Kokalis-Burrelle and Rodriguez-Kabana, 2006; Chitwood, 2002). При использовании покровных насаждений биоактивные соединения аллелопатических растений выделяются во время роста и/или высвобождаются в почву при разложении биомассы. Культуры рода Brassica можно применять для биофумигации - стратегии регулирования численности вредителей, основанной на высвобождении биоцидных летучих веществ при разложении тканей, попадающих в почву (Kirkegaard and Sarwar, 1998). Тем не менее, в исследованиях Рубцовой с соавторами (Roubtsova et al., 2007) действия гниения брокколи на число М. incognita было показано, что для успешной борьбы требовалось тщательное смешение тканей растения со всеми фрагментами почвы, инфицированной нематодами.

Развитие новых средств для регулирования численности нематод в сельскохозяйственных почвах основано на двух факторах: на разработке культур, устойчивых к нематодам, и открытии и разработке новых менее токсичных нематоцидов широкого спектра. Стоимость исследований, разработки и регистрации новых химических нематоцидов чрезвычайно высока (>200 миллионов долларов США), что ограничивает разработку. Среди 497 новых активных ингредиентов, зарегистрированных для применения в качестве пестицидов с 1967 по 1997 год, только семь было зарегистрировано в качестве нематоцидов (Aspelin and Grube, 1999). Помимо традиционных химических способов было предложено применение РНК-интерференции (РНКи) в качестве способа регулирования численности нематод. Применение сайленсинга генов путем РНКи впервые было показано на Caenorhabditis elegans и сравнительно недавно на нематодах, паразитирующих в растениях, таких как Meloidogyne spp. (Bakhetia et al., 2005). Поиск новых штаммов микроорганизмов для применения в качестве источников биологических нематоцидов является важным для снижения значительных экономических потерь, вызванных нематодами, паразитирующими в растениях, а также для снижения применения токсичных соединений, зарегистрированных в настоящее время для регулирования численности нематод.

Согласно Сассеру и Фрекману (Sasser and Freckman, 1987) потери урожая, вызванные нематодами, составляют от 8 до 20% для основных культур по всему миру. Нематоды, паразитирующие в растениях, могут приводить к значительным потерям урожая, ежегодные экономические потери по оценкам составляют 87 миллиардов долларов США по всему миру (Dong and Zhang, 2006). Измененные культуры, устойчивые к нематодам, и химические нематоциды в настоящее время являются основным выбором средств регулирования численности нематод. Фумиганты, такие как метилбромид, являются очень эффективными для борьбы с заболеваниями растений, передаваемыми через почву, и нематодами, но вследствие высокой токсичности для млекопитающих, разрушения озонового слоя и других эффектов последействия применение метилбромида было запрещено в ряде стран, и полное прекращение его реализации планируется в соответствии с международным соглашением (Oka et al., 2000). Применение химических альтернатив, таких как метилйодид, 1,3-дихлорпропен и хлорпикрин, также сталкивается с проблемами, связанными с безопасностью человека и окружающей среды. Химические нематоциды, для применения которых не требуется фумигация, были выведены из производства и запрещены. Совсем недавно USEPA объявило о прекращении производства алдикарба.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В настоящей заявке предложены новые применения и комбинации и, в частности, композиции, содержащие штамм Chromobacterium sp., в частности, штамм Chromobacterium substugae, более конкретно, штамм Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамм Chromobacterium substagae sp. nov., имеющий отличительные характеристики NRRL В-30655, описанные в патенте США №7244607.

Таким образом, в настоящей заявке предложен способ модулирования заражения нематодами растений, включающий нанесение на растение и/или его семена и/или в субстрат, применяемый для выращивания указанного растения количества супернатанта, фильтрата и/или экстракта и/или одного или более метаболитов штамма Chromobacterium sp., в частности, штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., имеющего отличительные характеристики NRRL В-30655, описанные в патенте США №7244607, входящих в состав указанного супернатанта, фильтрата и/или экстракта, и возможно другого нематоцидного вещества в количестве, эффективном для модулирования указанного заражения нематодами.

Также в настоящей заявке предложена пестицидная комбинация, обладающая синергическим действием в отношении по меньшей мере одного вредителя, содержащая в качестве активных компонентов: (а) супернатант, фильтрат и/или экстракт штамма Chromobacterium sp., в частности, штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., имеющего отличительные характеристики NRRL В-30655, описанные в патенте США №7244607, и/или одного или более метаболитов, входящих в состав указанного супернатанта, фильтрата и/или экстракта Chromobacterium sp., в частности, Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., имеющего отличительные характеристики NRRL В-30655, описанные в патенте США №7244607, и (b) другое пестицидное вещество, где (a) и (b) присутствуют в синергических количествах. Вредитель согласно конкретному варианту реализации может представлять собой насекомое-вредителя, но также может включать, не ограничиваясь ими, нематоды, грибки растений, вирусы растений, бактерии растений и сорняки. Кроме того, комбинация может иметь форму композиции. Пестицидное вещество может (a) быть получено из микроорганизма; (b) представлять собой натуральный продукт и/или (c) представлять собой химический пестицид, в частности химический нематоцид.

В частности, комбинация может содержать супернатант, фильтрат и/или экстракт штамма Chromobacterium sp., в частности, штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., имеющего отличительные характеристики NRRL В-30655, описанные в патенте США №7244607, и пестицидное вещество, полученное из микроорганизма, включая, но не ограничиваясь ими. Bacillus sp. (например, Bacillus thuringiensis или Bacillus thuringiensis kurstaki) и спиносад. В качестве альтернативы комбинация может содержать супернатант, фильтрат и/или экстракт штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, и более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., и еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL B-30655, описанными в патенте США №7244607, и пестицидное вещество, полученное из натурального продукта, такого как пиретрум. В качестве альтернативы комбинация может содержать супернатант, фильтрат и/или экстракт штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL B-30655, описанными в патенте США №7244607, и пестицидное вещество, которое представляет собой химический пестицид, в частности, инсектицид, где инсектицид включает, но не ограничивается ими, пиретрины, спиротетрамет и диамид антраниловой кислоты.

Согласно родственному аспекту в настоящей заявке предложен способ синергической модулирования заражения по меньшей мере одним вредителем или видом вредителя растения, включающий нанесение на растение и/или его семена и/или на субстрат для выращивания указанного растения комбинаций, приведенных выше, где количество комбинации является эффективным для модулирования заражения указанным вредителем или видом вредителя. Также в настоящей заявке предложены выделенные соединения, которые можно получать или которые вырабатываются штаммами различных видов Chromobacterium, в частности штаммом Chromobacterium substugae, более конкретно штаммом Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штаммом Chromobacterium substagae sp. nov., обладающим отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607, или в качестве альтернативы организмами, способными вырабатывать указанные соединения, которые можно применять для регулирования численности вредителей, в частности, вредителей, которые чувствительны к нематоцидам.

В одном из вариантов реализации соединение может представлять собой соединений, которое (a) обладает пестицидной активностью; (b) имеет молекулярную массу, составляющую примерно 840-900, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); и (c) имеет время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 7-12 минут на ВЭЖХ-колонке С-18 с обращенной фазой с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN, 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный СН₃CN, 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм; и (d) необязательно может быть получено из штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607. Соединение согласно одному из вариантов реализации может представлять собой пептид.

В конкретном варианте реализации соединение содержит 43 атома углерода, семь метальных, десять метиленовых атомов углерода, двенадцать метиновых, 6 олефиновых метиновых и восемь четвертичных атомов углерода согласно ¹³С ЯМР.

В одном из конкретных вариантов реализации соединение «A»: (а) можно получать из штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607; (b) является токсичным для вредителя; (с) имеет молекулярную массу, составляющую примерно 840-890, более конкретно 860, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); (d) имеет пики ¹H ЯМР со значениями δ 8,89, 8,44, 8,24, 8,23, 7,96, 7,63, 6,66, 5,42, 5,36, 5,31, 5,10, 4,13, 4,07, 4,05, 3,96, 3,95, 3,88, 3,77, 3,73, 3,51, 3,44, 3,17, 2,40, 2,27, 2,11, 2,08, 2,03, 2,01, 1,97, 1,95, 1,90, 1,81, 1,68, 1,63, 1,57, 1,53, 1,48, 1,43, 1,35, 1,24, 1,07, 1,02, 0,96, 0,89, 0,88, 0,87, 0,80 и пики ¹³C ЯМР со значениями δ 173,62, 172,92, 172,25, 172,17, 171,66, 171,28, 170,45, 132,13, 130,04. 129,98, 129,69, 129,69, 125,48, 98,05, 70,11, 69,75, 68,30, 68,25, 64,34, 60,94, 54,54, 52,82, 49,72, 48,57, 45,68, 40,38, 39,90, 38,18, 36,60, 31,98, 31,62, 31,58, 29,53, 28,83, 27,78, 24,41, 23,06, 22,09, 20,56, 19,31, 18,78, 17,66, 15,80; (e) имеет время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 7-12 минут, более конкретно примерно 9 минут, еще более конкретно 9,08 минуты на ВЭЖХ-колонке колонке С-18 с обращенной фазой (Phenomenex, Luna, 5 мкм, С18(2), 100А, 100×4,60 мм) с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN, 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный СН₃СН 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм;. В частности, на спектре ¹³C ЯМР видны сигналы 43 атомов углерода, семи метальных, десяти метиленовых атомов углерода, двенадцати метиновых, 6 олефиновых метиновых, восьми четвертичных атомов углерода и/или на спектре ¹H ЯМР изображены пики, характерные для типичного пептида, соответствующие сигналам пяти амидных NH групп [δ_H: 8,89, 8,44, 8,23, 8,22, 7,96], сигналу одной NH₂ аминогруппы [δ_H: 7,64, 6,65], сигналам шести α-аминопротонов [δ_H: 4,07, 4,06, 3,96, 3,95, 3,88, 3,72], и на спектре ¹³C ЯМР изображены резонансы шести/семи атомов углерода амидных или сложноэфирных групп [δ_C: 173,62, 172,92, 172,25, 172,17, 171,66, 171,28, 170,45].

В другом конкретном варианте реализации соединение «B» имеет следующие характеристики: (a) его можно получать из штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL B-30655, описанными в патенте США №7244607; (b) оно является токсичным для вредителя; (c) имеет молекулярную массу, составляющую примерно 850-900, более конкретно 874, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); (d) имеет время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 7-12 минут, более конкретно примерно 9 минут, еще более конкретно 9,54 минуты на ВЭЖХ-колонке С-18 с обращенной фазой (Phenomenex, Luna, 5 мкм, С 18(2), 100А, 100×4,60 мм) с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный CH₃CN, 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм.

В более конкретном варианте реализации предложены соединения, включая, но не ограничиваясь ими:

(A) соединение, имеющее структуру ##STR001##

или его пестицидно приемлемую соль или стереоизомеры, где R представляет собой -H, низший алкил, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 алкильных фрагментов, арильный или арилалкильный фрагмент, замещенный низший алкил; Х представляет собой O, NH, NR или S; n равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ независимо представляют собой H, могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют собой фрагмент боковой цепи аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероцикл, замещенный гетероцикл, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенный алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидроксил, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(B) соединение, имеющее структуру ##STR001a##

где R представляет собой -H, низший алкил, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 алкильных фрагментов, арильный или арилалкильный фрагмент, замещенный низший алкил; X представляет собой О, NH, NR или S; R_2a и R_2b независимо выбраны из группы, состоящей из -H, алкила, низшего алкила, замещенного алкила и замещенного низшего алкила; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ независимо представляют собой H, могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют собой фрагмент боковой цепи аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероцикл, замещенный гетероцикл, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенный алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидроксил, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)H, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(C) соединение, имеющее структуру ##STR001b##

где R представляет собой -H, низший алкил, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 алкильных фрагментов, арильный или арилалкильный фрагмент, замещенный низший алкил; X представляет собой O, NH, NR или S; n равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9; R_2a и R_2b независимо выбраны из группы, состоящей из -H, алкила, низшего алкила, замещенного алкила и замещенного низшего алкила; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ независимо представляют собой H, могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют собой фрагмент боковой цепи аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероцикл, замещенный гетероцикл, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенный алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидроксил, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил;

(D) соединение, имеющее структуру ##STR001c##

где R представляет собой H, низший алкил, арил или арилалкильный фрагмент, замещенный низший алкил, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 алкильных фрагментов; X представляет собой O, NH, NR или S; n равен 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9; R_2a и R_2b независимо выбраны из группы, состоящей из -H, алкила, низшего алкила, замещенного алкила и замещенного низшего алкила; R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, R₉, R₁₀, R₁₁ независимо представляют собой H, могут быть одинаковыми или различными и независимо представляют собой фрагмент боковой цепи аминокислоты или производное боковой цепи аминокислоты, алкил, замещенный алкил, алкенил, замещенный алкенил, алкинил, замещенный алкинил, арил, замещенный арил, гетероарил, замещенный гетероарил, гетероцикл, замещенный гетероцикл, циклоалкил, замещенный циклоалкил, алкокси, замещенный алкокси, тиоалкил, замещенный тиоалкил, гидроксил, галоген, амино, амидо, карбоксил, -C(O)Н, ацил, оксиацил, карбамат, сульфонил, сульфонамид или сульфурил.

В более конкретном варианте реализации соединение представляет собой хромамид A(1).

Указанные соединения можно получать путем (a) выращивания штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607, в питательной среде или в цельноклеточном бульоне в условиях, достаточных для получения указанного соединения, с получением культуры Chromobacterium и (b) выделения указанного полученного соединения из цельноклеточного бульона, применяемого на стадии (a). В частности, соединение на стадии (b) можно выделять путем (i) применения цельноклеточного бульона на по меньшей мере одном из ионообменной колонки, колонки эксклюзионной хроматографии или колонки обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением колоночных фракций; (ii) исследования колоночных фракций на предмет пестицидной активности и (iii) концентрирования колоночных фракций согласно (ii) с получением выделенного соединения.

Дополнительно предложены композиции, в частности, пестицидные композиции, содержащие указанные соединения, а также другие соединения, которые можно получать из штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607, обладающие пестицидной активностью. Указанные другие соединения могут иметь следующие характеристики: (a) молекулярную массу, составляющую примерно 315-360, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); (b) время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 8-15 минут на ВЭЖХ-колонке С-18 с обращенной фазой с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN, 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный CH₃CN, 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм; и которые можно получать путем (A) выращивания штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607, в питательной среде в условиях, достаточных для получения указанного соединения, с получением культуры штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607, и (B) выделения указанного полученного соединения из цельноклеточного бульона, полученного на стадии (A).

В конкретном варианте реализации одно из соединение, применяемое в указанной композиции, приведенной выше, соединение «С», имеет следующие характеристики: (a) его можно получать из штамма Chromobacterium sp., в частности штамма Chromobacterium substugae, более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., еще более конкретно штамма Chromobacterium substagae sp. nov., обладающего отличительными характеристиками NRRL В-30655, описанными в патенте США №7244607; (b) оно является токсичным для вредителей; (c) имеет молекулярную массу, составляющую примерно 325-360, более конкретно примерно 343, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); (d) имеет время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 8-14 минут, более конкретно примерно 10 минут, еще более конкретно 10,88 минуты на ВЭЖХ-колонке С-18 с обращенной фазой (Phenomenex, Luna, 5 мкм, С 18(2), 100А, 100×4,60 мм) с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN, 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный CH₃CN, 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм. В конкретном варианте реализации соединение «C» может представлять собой виолацеин (2), известное соединение, ранее выделенное из Chromobacterium violaceum.

В другом варианте реализации другое соединение, применяемое в композиции, приведенной выше, соединение «D», имеет следующие характеристики: (a) его можно получать из бактерий различных видов Chromobacterium; (b) оно является токсичным для вредителей; (c) имеет молекулярную массу, составляющую примерно 315-350, более конкретно примерно 327, определенную путем жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ЖХ/МС); (d) имеет время удерживания высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), составляющее примерно 10-15 минут, более конкретно примерно 12 минут, еще более конкретно 12,69 минуты на ВЭЖХ-колонке С-18 с обращенной фазой (Phenomenex, Luna, 5 мкм, С 18(2), 100А, 100×4,60 мм) с применением градиентной системы растворителей вода:ацетонитрил (CH₃CN) (0-20 мин; 90-0% водный CH₃CN, 20-24 мин; 100% CH₃CN, 24-27 мин; 0-90% водный CH₃CN, 27-30 мин; 90% водный CH₃CN), при расходе 0,5 мл/мин и УФ-детектировании при 210 нм. В конкретном варианте реализации соединение «D» можно охарактеризовать как дезоксивиолацеин (3), известное соединение, ранее выделенное из Chromobacterium violaceum.

Указанные композиции могут дополнительно содержать второе вещество, где указанное второе вещество представляет собой химический или биологический пестицид, и/или по меньшей мере один носитель, разбавитель, поверхностно активное вещество или адъювант.

Также предложен способ применения соединений (например, соединений «A», «B», «C» и «D») и композиций, приведенных выше, для модулирования заражения растения вредителями, в частности, вредителями, чувствительными к нематоцидам, включающий нанесение на растение количества соединения или композиции и возможно второго химического или биологического пестицида, которое является эффективным для модулирования указанного заражения вредителями. Кроме того предложено применение соединений, приведенных выше, для приготовления