Бактериофаг, обладающий активностью против pseudomonas aeruginosa, белки бактериофага и способы их применения

Бактериофаг, обладающий активностью против pseudomonas aeruginosa, белки бактериофага и способы их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная международная заявка претендует на приоритет перед Предварительной Заявкой США Сер. №61/150585, от 6 февраля 2009 г., озаглавленной «Бактериофаги и их применение», и Предварительной Заявкой США Сер. №61/218345, от 18 июня 2009 г., озаглавленной «Бактериофаги, белки бактериофагов и их применение». Все допустимые объекты и содержание, включая последовательность списка этих предварительных заявок, включены здесь ссылками во всей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области бактериофаговой терапии для лечения и контроля бактериальных инфекций. В частности, настоящее изобретение относится к новым бактериофагам F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и F91a/06, выделенным из них белкам, композициям, содержащим один или несколько новых бактериофагов и/или выделенных полипептидов, и способам лечения и профилактики бактериальных инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus по отдельности или в комбинации с другой антибактериальной терапией, например, антибиотиками или другой бактериофаговой терапией.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактериофаги (или фаги) представляют собой вирусы, которые специфически инфицируют и лизируют бактерии. Бактериофаговая терапия как способ использования целых фаговых вирусов для лечения заболеваний, вызванных бактериальными инфекциями, была предложена Felix d′Herelle в 1920-х годах. На первом этапе бактериофаговую терапию активно изучали и появлялись многочисленные работы, посвященные выяснению возможностей бактериофаговой терапии в лечении бактериальных инфекций у людей и животных. Первый успех стимулировал разработку многих промышленных бактериофаговых препаратов. Например, в 1940 г. Eli Lilly Company выпустила 7 бактериофагов для людей, включая бактериофаговые препараты для лечения различных недомоганий, вызываемых Staphylococcus sp., Е. coli и другими патогенными бактериями. Эти препараты использовали для лечения инфекций, которые вызывают абсцессы, гнойные раны, вагиниты, острые и хронические заболевания верхних дыхательных путей и отиты.

Однако с развитием антибиотиков в 1940-х годах на Западе интерес к бактериофаговой терапии снизился. Одним из наиболее важных факторов, повлиявших на это снижение интереса, было отсутствие стандартизованных методов тестирования и способов производства. Отсутствие промышленных стандартов для тестирования бактериофаговой терапии, а также документирования результатов исследований привело к потере эффективности и к проблемам надежности при оценке бактериофаговой терапии. Кроме того, первоначальное изучение и поиски осложнялись проблемами, связанными с получением образцов/препаратов бактериофагов. Вначале для повышения срока службы бактериофаговых препаратов использовали различные стабилизаторы и консерванты. Однако, поскольку биология как бактериофагов, так и различных стабилизаторов была слабо изучена, многие ингредиенты, добавляемые для повышения срока службы бактериофаговых препаратов, оказались либо токсичными для людей, либо не обеспечивали длительные сроки хранения. Другая проблема, связанная с получением бактериофагов, заключалась в степени чистоты промышленных препаратов этих вирусов. В то время препараты бактериофаговой терапии обычно состояли из сырых лизатов клеток-хозяев бактерий, которые обрабатывали для получения бактериофага. Таким образом, многие препараты содержали то, что теперь известно как нежелательные бактериальные компоненты, например, эндотоксины. Соответственно, отрицательные случаи часто ассоциировали с препаратами, особенно у пациентов, получавших их внутривенно. Тем не менее в Восточной Европе и в бывшем Советском Союзе, где доступность антибиотиков была ограниченной, разработка и применение бактериофаговой терапии продолжались наряду с антибиотиками либо вместо них.

По мере того как росла устойчивость бактерий к антибиотикам, на Западе возродился интерес к бактериофаговой терапии. Даже несмотря на то, что можно разработать новые классы антибиотиков, опасение того, что возрастает устойчивость бактерий к новым лекарствам, стимулировало поиск нехимиотерапевтических средств регулирования, профилактики и лечения бактериальных инфекций. Известны три основные стратегии применения бактериофаговой терапии в клинической практике: 1) назначение вирулентных бактериофагов; 2) использование эндолизинов или очищенных лизинов, кодированных бактериофагами; 3) использование структурных белков идентифицированных бактериофагов в качестве метаболических ингибиторов основных ферментов синтеза бактериального пептидогликана.

Поэтому необходимо разрабатывать новые бактериофаги в качестве потенциальных терапевтических и профилактических реагентов для применения in vivo против патогенных бактерий. В частности, необходимы бактериофаги, способные разрушать нозокомиальные бактерии, включая Acinetobacter baumannii, Enterococcus faecalis, E. faecium, Pseudomonas aeruginosa и/или Staphylococcus aureus. Поскольку большинство бактериофагов и фаговых белков, изученных к настоящему времени, часто активны только против родственных видов или подвидов бактерий, из которых они получены, новая бактериофаговая терапия может найти особое применение в больницах для избирательного лечения патогенных инфекций, не оказывающего влияния на нормальную окружающую флору.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенным бактериофагам и выделенным из бактериофагов антибактериальным полипептидам, применяемым для лечения, профилактики или управления состояниями, связанными с инфицированием грамположительными или грамотрицательными бактериями. В частности, выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению можно применять для лечения, профилактики или управления инфекциями, вызванными патогенными нозокомиальными бактериями, например грамположительными бактериями, включая, но не ограничиваясь ими, Enterococcus faecalis, Е. faecium, Е. hirae, Е. avium, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans и S. xylosis; и/или грамотрицательными бактериями, включая, но не ограничиваясь этим, Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa. В некоторых вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению используют для лечения состояний, связанных с инфицированием устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий, например, устойчивыми к метициллину штаммами Staphylococcus aureus (MRSA). В некоторых вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды используют для местного лечения инфекций, вызванных нозокомиальными патогенными бактериями у пациентов, которые в этом нуждаются. В других вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению используют для диагностики инфицирующего реагента во взятом у пациента образце ткани, крови, мочи или мокроты. В других вариантах выделенные бактериофаги или полипептиды по данному изобретению используют в качестве профилактического дезинфицирующего или противоинфицирующего реагента при подготовке твердых поверхностей, включая кожу или другие эпидермальные поверхности.

В некоторых вариантах данное изобретение предлагает выделенный бактериофаг F168/08 или F170/08 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 соответственно, проявляющий антибактериальную активность против одного или несколькихм штаммов Enterococcus faecalis и/или Е. faecium. В других вариантах изобретение предлагает выделенный бактериофаг F770/05 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, обладающий антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Pseudomonas aeruginosa. В еще других вариантах изобретение предлагает выделенные бактериофаги F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 соответственно; эти бактериофаги обладают антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Staphylococcus aureus. В других вариантах изобретение предлагает выделенный бактериофаг F1245/05 с геномом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 760, обладающий антибактериальной активностью против одного или нескольких штаммов Acinetobacter baumannii.

Настоящее изобретение также включает выделенные бактерии, инфицированные одним или несколькими бактериофагами по данному изобретению. В конкретных вариантах изобретение предлагает выделенные Е. faecalis, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В других вариантах изобретение предлагает выделенные Е. faecium, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 и/или SEQ ID NO: 2. В следующих вариантах изобретение предлагает выделенные P. aeruginosa, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3. В других вариантах изобретение предлагает выделенные S. aureus, инфицированные одним или несколькими бактериофагами с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и/или SEQ ID NO: 7. В еще других вариантах изобретение предлагает выделенные A. baumannii, инфицированные бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760.

Настоящее изобретение включает полипептиды, выделенные из бактериофага F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 и/или F91a/06, обладающие антибактериальной активностью против одного или нескольких видов или штаммов грамположительных или грамотрицательных бактерий, например, A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептиды по данному изобретению, выделенные или полученные из F168/08 или F/170/08, обладают антибактериальной или антимикробной активностью, например литической активностью по меньшей мере против Е. faecalis и/или Е. faecium; выделенные или полученные из F770/05 - против по меньшей мере P. aeruginosa; выделенные или полученные из F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06 - против по меньшей мере S. aureus; и выделенные или полученные из F1245/05 - против по меньшей мере A. baumannii.

В некоторых вариантах полипептиды по данному изобретению содержат или состоят из выделенного эндолизина или его фрагмента (например, домена CHAP, который проявляет антибактериальную активность против одного или нескольких видов или штаммов бактерий, например, грамположительных или грамотрицательных бактерий, таких как A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой выделенный белок лизин, например, эндолизин или лизин белок хвостового отростка, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В еще других вариантах изобретение предлагает полипептиды, содержащие или состоящие из аминокислотной последовательности, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 761 и до SEQ ID NO: 816.

В других вариантах полипептид по данному изобретению содержит фрагмент, вариант или производное SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, причем указанный фрагмент обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, против одного или нескольких штаммов Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В конкретных примерах по этому варианту вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202 и/или SEQ ID NO: 203 проявляет антибактериальную или антимикробную активность, (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium. В других примерах по этому варианту вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 и/или SEQ ID NO: 712 обладает антибактериальной или антимикробной активностью (например, литической активностью) против одного или нескольких штаммов S. aureus.

В конкретных вариантах выделенный полипептид по данному изобретению содержит или состоит из домена CHAP последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712. В некоторых вариантах выделенный полипептид по изобретению содержит или состоит из домена CHAP последовательности SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 641 или SEQ ID NO: 712, например, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759 соответственно. В еще других вариантах полипептид по изобретению содержит фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758 или SEQ ID NO: 759, причем указанный фрагмент, вариант или производное обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, против по меньшей мере одного или нескольких штаммов Е. faecalis, Е. faecium, Р. aeruginosa и/или S. aureus. В следующих вариантах полипептид по изобретению содержит фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 761 до SEQ ID NO: 816, причем указанный фрагмент, вариант или производное обладает антибактериальной или антимикробной активностью, например, литической активностью, против по меньшей мере одного или нескольких штаммов A. baumannii.

В других вариантах полипептид по данному изобретению содержит или состоит из выделенного белка «рулетки» (tape measure protein), определяющего длину хвостового отростка, или белка хвостового отростка*, например, компонента хвостового отростка, фибрилл белка хвостового отростка, связанного с адсорбцией белка хвостового отростка, или его фрагмента, биологическая функция которого связана с бактериофагом, из которого он получен, который проявляет антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против по меньшей мере одного или нескольких видов или штаммов Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или A. baumannii. В конкретных вариантах полипептид по данному изобретению представляет собой выделенный белок «рулетка», определяющий длину хвостового отростка или белок*, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 795. В других вариантах полипептид по изобретению представляет собой фрагмент, вариант или производное последовательности SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704 или SEQ ID NO: 795, причем биологическая функция указанного фрагмента, его варианта или производного связана с бактериофагом, из которого он получен, например, обуславливает антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus и/или A. baumannii.

В некоторых вариантах данное изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61 или SEQ ID NO: 63, и их биологическая функция определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 204 или SEQ ID NO: 214, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 2, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов Е. faecalis и/или Е. faecium.

В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 435 или SEQ ID NO: 438, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или несколькоих штаммов Р. aeruginosa.

В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538 или SEQ ID NO: 539, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 4, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов S. aureus. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 567 или SEQ ID NO: 568, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов S. aureus. В еще других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 632 или SEQ ID NO: 633, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов S. aureus. В других вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703 или SEQ ID NO: 704, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 7, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или нескольких штаммов S. aureus.

В некоторых вариантах изобретение включает вариант, фрагмент или производное аминокислотной последовательности SEQ ID NOS: 761-816, биологическая функция которых определяется бактериофагом с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 760, которая обуславливает, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) против одного или несколькоих штаммов А. baumannii.

В некоторых вариантах изобретение предлагает выделенные полипептиды, обладающие антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью) против одного или нескольких штаммов бактерий (например, грамположительных бактерий типа Е. faecalis, Е. faecium, S. aureus, грамотрицательных бактерий типа A. baumannii, P. aeruginosa или бактерий, не относящихся к числу грамположительных или грамотрицательных), причем выделенные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более процентов идентична вторичной аминокислотной последовательности той же длины (т.е. состоящей из такого же числа аминокислотных групп), которая представляет собой последовательность SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 и/или ее фрагмент.

Кроме того, данное изобретение предлагает выделенные полипептиды, содержащие или состоящие из любой аминокислотной последовательности SEQ ID NOS: 8-130, SEQ ID NOS: 131-343, SEQ ID NOS: 344-438, SEQ ID NOS: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 и SEQ ID NOS: 761-816. В других вариантах предлагаются выделенные полипептиды по данному изобретению, которые рекомбинантно объединены или химически соединены (например, ковалентными или нековалентными связями) с терапевтическими реагентами (например, с гетерологичными полипептидами или малыми молекулами).

Изобретение также относится к полинуклеотидам, которые кодируют полипептиды по данному изобретению. В конкретном варианте изобретение предлагает выделенную нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, включающую любой полипептид из SEQ ID NOS: 8-130, SEQ ID NOS: 131-343, SEQ ID NOS: 344-438, SEQ ID NOS: 439-553, SEQ ID NOS: 554-616, SEQ ID NOS: 617-681, SEQ ID NOS: 682-759 и SEQ ID NOS 761-816. В других вариантах изобретение предлагает нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, включающую любой полипептид из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO:529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS 761-816 или его активный фрагмент, вариант или производное, причем полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное обладает биологической функцией, обусловленной бактериофагом, из которого его выделили и/или получили, например, антимикробной или антибактериальной активностью (например, литической активностью). Изобретение также относится к вектору, включающему указанную нуклеиновую кислоту. В одном конкретном варианте указанный вектор является вектором экспрессии. Кроме того, изобретение предлагает клетки-хозяева, содержащие вектор, включающий полинуклеотиды, кодирующие полипептиды по данному изобретению.

Настоящее изобретение включает способы получения полипептидов по изобретению или их активных фрагментов, в частности для использования в фармацевтических композициях, т.е. антимикробных композициях. Например, полипептиды по данному изобретению можно выделить непосредственно из клеточных культур, (например, из бактериальных клеточных культур), инфицированных бактериофагом F1245/05, F168/08, F170/08, F770/05, F197/08, F86/06, F87s/06 или F91a/06. Альтернативно полипептиды по настоящему изобретению можно получить рекомбинантными методами с использованием векторов экспрессии, содержащих нуклеотидную последовательность, включающую полипептиды по изобретению, например, используя векторы экспрессии, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды по данному изобретению, из SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 или их активные фрагменты, производные или разновидности. Полипептиды по данному изобретению или их фрагменты можно получить любым способом, известным в данной области, в частности химическим синтезом или способами рекомбинантной экспрессии. В конкретных вариантах изобретение относится к способу рекомбинантного получения фагового белка, например, белка лизина, концевого белка или его активного фрагмента, разновидности или производного, причем указанный способ включает: (i) культивирование в условиях, пригодных для экспрессии указанного белка в среде, причем клетка-хозяин содержит вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759, SEQ ID NOS: 761-816 или его фрагмента; и (ii) выделение указанного белка из указанной среды. В некоторых вариантах нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды по данному изобретению, функционально связывают с гетерологичными промоторами.

Настоящее изобретение также включает способы диагностики возбудителей болезни при клиническом проявлении бактериальной инфекции. Выделенные бактериофаги или полипептиды по изобретению можно использовать для распознавания видов бактерий в образцах, взятых у пациента, путем анализа чувствительности бактерий в образце к бактериофагам и/или полипептидам по данному изобретению. Такие способы включают также методы оценки антибактериальной активности выделенных бактериофагов и/или полипептидов по данному изобретению. Антибактериальную активность бактериофагов или полипептидов по изобретению или чувствительность неизвестных образцов к такой активности можно определить любыми способами, известными в данной области, и/или описанными здесь. В некоторых вариантах антибактериальную активность и/или чувствительность определяют путем культивирования известных бактерий и/или образцов ткани, крови, жидкости или мазка по стандартной методике (например, в жидкой культуре или на агаровых пластинках), контактирования культуры с бактериофагами и/или полипептидами по изобретению и мониторинга роста клеток после указанного контактирования. Например, в жидкой культуре (например, A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa, S. aureus) можно выращивать клетки до достижения величины оптической плотности ("OD"), представляющей среднюю точку экспоненциального роста культуры; культуру приводят в контакт с одним или несколькими бактериофагами и/или полипептидами по данному изобретению при одной или нескольких концентрациях и отслеживают величину OD по сравнению с контрольной культурой. Снижение величины OD относительно контрольной культуры указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида, обладающего антибактериальной активностью (например, литической активностью) против тестируемого образца или видов бактерий и/или штаммов в культуре. Аналогично, колонии бактерий выращивают на агаровой пластинке, пластинку приводят в контакт с бактериофагом или полипептидом по данному изобретению и оценивают последующий рост колоний относительно контрольных пластинок. Уменьшившиеся в размере колонии или уменьшившееся общее число колоний указывает на антибактериальную активность бактериофага и/или полипептида против тестируемого образца и/или культивируемого вида или штамма.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим или состоящим из бактериофага с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760. В некоторых вариантах фармацевтическая композиция по данному изобретению включает бактериофаг с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760 наряду с одним или несколько другими бактериофагами. Один или несколько других бактериофагов могут представлять собой один или несколько бактериофагов по данному изобретению (например, с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760), один или несколько штаммов или один или несколько бактериофагов, известных в данной области. Кроме того, один или несколько бактериофагов в фармацевтической композиции по данному изобретению могут воздействовать на одни и те же или на разные виды или штаммы бактерий. В некоторых вариантах фармацевтические композиции, содержащие один или несколько бактериофагов по изобретению, включают также один или несколько полипептидов по изобретению и/или другие бактериофаги, как описано здесь или известно в данной области.

В некоторых вариантах данное изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие полипептиды или их активные фрагменты, в частности обладающие антимикробной и/или антибактериальной активностью, выделенные из бактериофагов с геномом, содержащим или состоящим из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 760. В конкретных вариантах фармацевтические композиции по изобретению содержат один или несколько полипептидов с аминокислотной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO:533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759 или SEQ ID NOS: 761-816. В других вариантах фармацевтические композиции по изобретению содержат полипептид, который является вариантом, производным или фрагментом SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 539, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 641, SEQ ID NO: 700, SEQ ID NO: 701, SEQ ID NO: 702, SEQ ID NO: 703, SEQ ID NO: 704, SEQ ID NO: 712, SEQ ID NO: 755, SEQ ID NO: 756, SEQ ID NO: 757, SEQ ID NO: 758, SEQ ID NO: 759 или SEQ ID NOS: 761-816, причем вариант, производное или фрагмент сохраняет биологическую функцию полипептида, из которого он получен, например, антимикробную или антибактериальную активность (например, литическую активность) предпочтительно против одного или нескольких штаммов A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, Р. aeruginosa и/или S. aureus.

Фармацевтические композиции по данному изобретению могут также содержать фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор. В некоторых вариантах предлагаемые фармацевтические композиции содержат композиции антибиотиков (когда они проявляют антибактериальную активность) или терапевтические композиции для лечения, профилактики и/или облегчения симптомов заболевания или недомогания, вызванных бактериальными инфекциями, у объекта, который в этом нуждается. В отдельных вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению представляют собой антибактериальные или терапевтические композиции для лечения, предупреждения и/или облегчения симптомов болезни или расстройства, вызванного заражением штаммами A. baumannii, Е. faecalis, Е. faecium, P. aeruginosa и/или S. aureus. В некоторых вариантах получателями фармацевтических композиций являются млекопитающие (например, коровы, овцы, козы, непарнокопытные животные, приматы (например, люди), грызуны, зайцы или птицы (цыплята, утки, гуси)).

Настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики бактериальных инфекций, включающие назначение пациенту, который в этом нуждается, фармацевтической композиции, содержащей один или несколько бактериофагов или фагов (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное), необязательно в дополнение к одному или нескольким другим описанным здесь бактериофагам или фагам. В контексте настоящего изобретения термин «лечение» относится как терапевтическому лечению, так и к профилактическим или упреждающим мерам, причем объект надо удалить, сократить, уменьшить его неблагоприятное воздействие, замедлить прогрессирование, а также устранить или упредить симптомы основной причины (например, бактериальной инфекции), связанные с патологическим состоянием или недомоганием. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать при лечении или управлении инфекциями, вызванными любой бактериальной инфекцией, включая, но не ограничиваясь этим, A. baumanni, S. aureus, S. epidermidis, S. auricularis, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis, S. saprophyticus, S. simulans, S. xylosis, M. luteus, B. subtilis, B. puwilus, E. faecalis, E. hirae, E. faecium, E. avium, P. aeruginosa и их комбинации. В некоторых вариантах фармацевтические композиции можно использовать для лечения состояний или недомоганий, связанных с бактериальными инфекциями, включая, но не ограничиваясь ими, пост-операционный эндофтальмит, эндокардит, инфекции центральной нервной системы, пневмонию, остеомиелит, раневые инфекции (например, диабетическую стопу), мастит, сепсис, пищевое отравление и менингит и/или другие состояния, вызванные нозокомиальными бактериальными инфекциями.

В некоторых вариантах настоящее изобретение предлагает использовать бактериофаг или выделенный из бактериофага продукт (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное) в качестве единственного терапевтического реагента. В других вариантах изобретение предлагает использовать бактериофаг или его продукт (например, выделенный из бактериофага полипептид или его активный фрагмент, вариант или производное) в комбинации со стандартным или экспериментальным лечением бактериальной инфекции. Такая комбинированная терапия может повысить эффективность стандартного или экспериментального лечения. Примерами терапевтических реагентов, которые особенно часто используют в комбинации с полипептидом по данному изобретению, являются противовоспалительные средства, стандартные хемиотерапевтические антибиотики (например, пенициллин, синтетические пенициллины, бацитрацин, метициллин, цефалоспорин, полимиксин, цефаклор, Цефадроксил, цефамандол нафат, цефазолин, цефиксим, цефметазол, цефониоид, цефоперазон, цефоранид, цефотам, цефотаксим, цефотетан, цефокситин, цефподоксим проксетил, цефтазидим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефриаксон моксалактам, цефуроксим, цефалексин, цефалоспорин С, натриевая соль цефалоспорина С, цефалотин, натриевая соль цефалотина, цефапирин, цефпадин, цефуроксимаксетил, дигидратцефалотин, моксалактам, лоракарбеф мафат и хелатирующие реагенты), местные анестетики и/или кортикостероиды. В еще одном варианте композиции по настоящему изобретению можно комбинировать с одним или несколькими бактериофагами или их продуктами, известными в данной области. Комбинированные терапии в объеме изобретения можно осуществлять в виде одной фармацевтической композиции или их можно назначать как отдельные композиции, но в виде частей суммарного режима лечения.

Фармацевтические композиции по данному изобретению можно назначать любым способом, известным в данной области, пригодным для введения антибактериального соединения (например, перорально или парэнтерально (например, ингаляцией, внутримышечно, внутривенно или эпидермально)). В предпочтительных вариантах фармацевтические композиции по данному изобретению назначают местно, например, в местных препаратах. Композиции по изобретению можно использовать местно для лечения и/или профилактики распространенных нозокомиальных инфекций, таких как инфекции в местах хирургического вмешательства или связанных с катетерами и дренажами. В других вариантах композиции по данному изобретению используют для лечения бактериальных инфекций кожи или верхних слоев кожи (например, инфекции при диабетической стопе).

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно также применять традиционно для нетерапевтического лечения, например, в косметике или в виде спреев либо растворов для обработки твердых поверхностей с целью предотвращения колонизации бактерий (т.е. как дезинфицирующие средства).

Настоящее изобретение также относится к способам поиска пептидов с антибактериальной активностью. В одном варианте способ включает поиск непрерывной аминокислотной последовательности по меньшей мере из 6, 10, 15, 20 или 25 аминокислотных групп, которые кодируемы в открытые рамки считывания нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 760, с антибактериальной активностью, п