Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе

Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к лекарственному средству для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом.

Уровень техники

Сепсис представляет собой синдром системной воспалительной реакции (SIRS), вызываемой инфекцией. Конкретно сепсис определяют как патологическое состояние, которое соответствует, помимо наличия инфекции, двум или более пунктам SIRS ((1) температура тела >38°C или <36°C, (2) частота сердечных сокращений >90/минуту, (3) частота дыхания >20/минуту, или PaCO₂ <32 торр, и (4) число лейкоцитов >12000/мкл или <4000/мкл, или количество незрелых лейкоцитов >10%). Хотя наличию бактерий в крови (бактериемии) до сих пор уделяется значительное внимание, положительный результат на наличие бактерий при посеве крови не является обязательным согласно приведенному выше определению. Помимо сепсиса состояние, характеризующееся дисфункцией органов, гипоперфузией органов или пониженным давлением (гипотензией), называют тяжелым сепсисом. Гипоперфузия органов или нарушенная перфузия включает молочнокислый ацидоз, олигурию, затуманивание сознания и т.п. Помимо тяжелого сепсиса состояние, при котором постоянно наблюдается гипотензия, несмотря на достаточно интенсивную инфузионную терапию, называется септическим шоком (непатентный документ 1). Считается, что нарушение кровообращения, наблюдаемое при указанных патологических состояниях, вызвано нарушением функции симпатической нервной системы или медиатора, высвобождаемого нейтрофилами, и т.п., и дисфункция органов вызывается тканевой гипоксией (dysoxia).

Тромбомодулин известен как вещество, которое специфически связывается с тромбином, ингибируя, таким образом, его коагуляционную активность, и в то же время проявляет антикоагулянтную активность, тем самым существенно усиливая способность тромбина активировать белок C. Также известно, что тромбомодулин увеличивает время свертывания, осуществляемого тромбином, или подавляет агрегацию тромбоцитов, вызываемую тромбином. Белок C является витамин К-зависимым белком, который играет важную роль в свертывании крови и фибринолизе, и он активируется под действием тромбина с превращением в активированный белок С. Известно, что активированный белок С инактивирует активированный фактор свертывания крови V и активированный фактор свертывания крови VIII in vivo, и участвует в образовании активатора плазминогена, обладающего тромболитической активностью (непатентный документ 2). Таким образом, считается, что тромбомодулин способствует активации белка C тромбином и в связи с этим полезен в качестве антикоагулянта или тромболитического агента. Также сообщалось, что в эксперименте на животных тромбомодулин эффективен при терапии или профилактике заболеваний, ассоциированных с состоянием гиперкоагуляции (непатентный документ 3).

Впервые тромбомодулин был открыт и получен в виде гликопротеина, экспрессированного на эндотелиальных клетках сосудов различных видов животных и человека, а затем успешно клонирован. Конкретно ген предшественника тромбомодулина человека, содержащий сигнальный пептид, клонировали из библиотеки кДНК клеток легких человека методами генной инженерии и установили полную последовательность гена тромбомодулина, и в результате открыли аминокислотную последовательность, состоящую из 575 остатков, содержащую сигнальный пептид (как правило, представленный 18 аминокислотными остатками) (патентный документ 1). Известно, что молекула зрелого тромбомодулина, от которой отщепляется сигнальный пептид, состоит из 5 областей, а именно N-концевой области (аминокислотные остатки 1-226, эти положения указаны для случая, когда сигнальный пептид состоит из 18 аминокислотных остатков, и то же самое относится к последующим описаниям), области, содержащей шесть EGF-подобных структур (аминокислотные остатки 227-462), области O-связанного гликозилирования (аминокислотные остатки 463-498), трансмембранной области (аминокислотные остатки 499-521) и цитоплазматической области (аминокислотные остатки 522-557), если считать с N-концевой стороны зрелого пептида. Также известно, что неполный белок, обладающий такой же активностью, как полноразмерный тромбомодулин (т.е. минимальная активная единица), преимущественно состоит из 4-й, 5-й и 6-й EGF-подобных структур, считая с N-конца в области, содержащей шесть EGF-подобных структур (непатентный документ 4).

Полноразмерный тромбомодулин плохо растворяется без сурфактанта (поверхностно-активного вещества), и добавление сурфактанта необходимо при производстве препарата полного тромбомодулина. Также существует растворимый тромбомодулин, который можно полностью растворить даже без сурфактанта. Растворимый тромбомодулин можно получить путем удаления по меньшей мере части трансмембранной области или всей трансмембранной области. Например, доказано, что растворимый тромбомодулин, состоящий только из 3 областей, а именно N-концевой области, области, содержащей шесть EGF-подобных структур, и области O-связанного гликозилирования (т.е. растворимый тромбомодулин, имеющий аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков 19-516 SEQ ID NO: 9), можно получить с помощью рекомбинантных технологий, и что получаемый рекомбинантный растворимый тромбомодулин обладает такой же активностью, как и полноразмерный тромбомодулин (патентный документ 1). Также имеются некоторые другие сообщения относительно растворимых тромбомодулинов (патентные документы 2-9). Растворимый тромбомодулин, полученный из мочи человека, и т.п. также являются примерами нативных тромбомодулинов (патентные документы 10 и 11).

Как установлено во многих случаях, в результате спонтанных мутаций или мутаций, происходящих при получении тромбомодулинов, полиморфные мутации были обнаружены в генах человека. В настоящее время идентифицированы тромбомодулиновые белки, в которых аминокислота в положении 473 предшественника тромбомодулина человека, имеющего аминокислотную последовательность, состоящую из 575 аминокислотных остатков, заменена на Val или Ala. В нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, указанная вариация аминокислотного остатка соответствует мутации T или C в положении 1418 (непатентный документ 5). Однако два типа тромбомодулинов являются полностью идентичными по активности и физико-химическим свойствам, и их можно считать по существу идентичными.

Сообщается, что тромбомодулин является эффективным при терапевтическом лечении диссеминированного внутрисосудистого свертывания (в дальнейшем также обозначаемого как DIC) (непатентный документ 6). Что касается применения тромбомодулина, в дополнение к упомянутому выше применению, предполагается применение тромбомодулина при терапевтическом и профилактическом лечении различных заболеваний, таких как острый коронарный синдром (ACS), тромбоз, обструкция периферических сосудов, обструктивный артериосклероз, васкулит, функциональное нарушение, возникающее после операции на сердце, осложнение, вызванное трансплантацией органов, стенокардия, транзиторная ишемическая атака, токсикоз беременных, диабет, VOD печени (первичный тромбоз печеночных вен, например, скоротечный гепатит, тромбоз печеночных вен, возникающий после пересадки костного мозга) и тромбоз глубоких вен (DVT), и кроме того, сепсис и респираторный дистресс-синдром взрослых (ARDS) (патентный документ 12).

Ссылки на известный уровень техники

Патентные документы

Патентный документ 1: нерассмотренная патентная публикация Японии (Kokai) No. 64-6219

Патентный документ 2: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 5-213998

Патентный документ 3: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 2-255699

Патентный документ 4: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-133380

Патентный документ 5: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-259084

Патентный документ 6: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 4-210700

Патентный документ 7: WO92/00325

Патентный документ 8: WO92/03149

Патентный документ 9: WO93/15755

Патентный документ 10: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-86900

Патентный документ 11: нерассмотренная патентная публикация Японии No. 3-218399

Патентный документ 12: WO03/061687

Непатентные документы

Непатентный документ 1: American College of Chest Physicians, CHEST/101/6-/JUNE, 1992:1481-1483

Непатентный документ 2: Koji Suzuki, Igaku no Ayumi (Progress of Medicine), Vol. 125, 901 (1983)

Непатентный документ 3: K. Gomi et al., Blood, 75, 1396-1399 (1990)

Непатентный документ 4: M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 246, 10351-10353 (1989)

Непатентный документ 5: D.Z. Wen et al., Biochemistry, 26, 4350-4357 (1987)

Непатентный документ 6: S.M. Bates et al., Br. J. Pharmacol., 144, 1017-1028 (2005)

Сущность изобретения

Цель, которая достигается с помощью изобретения

Целью изобретения является предоставление лекарственного средства или способа эффективного терапевтического лечения или улучшения состояния при сепсисе у пациента с тяжелым сепсисом.

Средства достижения целей

Международное нормализованное отношение (также в дальнейшем обозначаемое сокращением "INR") в образце плазмы пациента с сепсисом, как известно, используют для обозначения коагулопатии. Например, на Конгрессе реаниматологии (CCM), проходившем в 2003 г., показатель INR>1,5, как и значение aPPT>60 с представлены в качестве критерия коагулопатии (Crit. Care Med., 31, pp. 1250-1256 (2003)). Однако показатель INR еще не принят официально в виде точного критерия, поскольку показатель INR не был подтвержден клиническими испытаниями и т.п. В действительности сообщается, что в III-й фазе клинического испытания по лечению пациентов с тяжелым сепсисом с применением Tifagofin в качестве ингибитора внешнего пути активации свертывания крови в классе антикоагулянтов более благоприятный исход получен в группе пациентов с INR≤1,2, чем в группе пациентов с INR>1,2 в качестве результата клинического теста, который преимущественно охватывал пациентов с INR>1,2 (JAMA, July 9, Vo. 290, No. 2, pp. 238-247 (2003)). В то же время в качестве другого результата упомянутого выше клинического теста сообщается, что в классе пациентов с INR>1,2 препарат оказывал более сильный эффект у пациентов с INR>1,5, чем у пациентов с INR>1,2. Кроме того, в случае Xigris, который является единственным препаратом, эффективность которого при сепсисе подтверждена клиническими испытаниями, наблюдали увеличение протромбинового времени (PT) у большинства пациентов в исследовании (93,4%).

Как показано выше, при терапевтическом лечении пациентов с сепсисом антикоагулянтом, высокая эффективность лечения с учетом некоторых результатов клинических исследований ожидается при выборе класса пациентов, у которых заболевание сопровождается коагулопатией. Однако следует принимать во внимание то, что определение коагулопатии еще не принято официально, поскольку, например, получены противоречивые клинические результаты. Другими словами, неясно, как можно получить хороший результат лечения путем подбора соответствующих пациентов с помощью показателя INR, и не существует общей технической информации о том, какой уровень показателя INR у пациента с сепсисом обеспечивает определенную эффективность препарата. В отношении взаимосвязи показателя INR и клинической эффективности считается, что известна только небольшая часть указанной взаимосвязи в виде отдельных случаев для некоторых отдельных препаратов.

В таких условиях авторы изобретения обратили свое внимание среди множества антикоагулянтов на тромбомодулин и провели различные исследования терапевтического эффекта и/или эффекта улучшения состояния при сепсисе. В результате они обнаружили, что сепсис можно лечить терапевтически и/или можно более эффективно улучшить состояние пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов (за исключением пациентов с тяжелым сепсисом с дисфункцией органов, ограничивающихся печенью или почками), чем у пациентов с тяжелым сепсисом без дисфункции органов, если показатель INR у пациентов превышает 1,4, другими словами, в отношении терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе с помощью тромбомодулина, авторы изобретения обнаружили, что в группе пациентов с сепсисом существует определенная взаимосвязь между состоянием пациентов с тяжелым сепсисом и дисфункциями одного или более органов и показателем INR, превышающим 1,4, которая неожиданна для специалистов в данной области. Авторы изобретения также обнаружили, что у пациентов с тяжелым сепсисом при показателе INR выше 1,4 и равном или меньше 1,6, достигался особенно выраженный эффект, при котором разность между показателями смертности группы тромбомодулина и группы плацебо превышала 15%, и в результате авторы осуществили изобретение. Ввиду того, что разница в показателях смертности между группой лекарственного средства и группой плацебо составляет 6% при использовании препарата Xigris (N. Engl. J. Med., 344, No.10, March 8, pp. 699-709 (2001)), который является единственным коммерчески доступным препаратом в Европе для лечения сепсиса, значение 15% в качестве разницы в показателях смертности является заметным значением, которое выше приблизительно в 2,5 раза, и поэтому можно признать, что в одном из вариантов осуществления изобретения достигается неожиданно удивительный результат.

Конкретно изобретение включает нижеследующее:

[A1] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[A1-2] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождаемого коагулопатией, которое содержит тромбомодулин в качестве активного ингредиента, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[A2] Лекарственное средство по пунктам [A1] или [A1-2], упомянутым выше, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4 и равен или меньше 1,6.

[A3] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A2], упомянутых выше, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

Если указанные номера пунктов обозначены в виде ряда пунктов "[A1]-[A2]", приведенных выше, и ряд включает пункт, обозначенный номером, имеющим подномер, такой как [A1-2], это значит, что пункт, обозначенный номером, имеющим подномер, такой как [A1-2], также приводится. То же самое относится к нижеследующим определениям.

[A4] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A3], упомянутым выше, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранных из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

[A5] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A4], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

[A5-2] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин обладает следующими свойствами (1)-(4):

(1) эффект избирательного связывания с тромбином,

(2) эффект усиления активации белка C тромбином,

(3) эффект увеличения тромбинового времени и

(4) эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином.

[A5-3] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин обладает следующими свойствами (1)-(5):

(1) эффект избирательного связывания с тромбином,

(2) эффект усиления активации белка C тромбином,

(3) эффект увеличения тромбинового времени,

(4) эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином, и

(5) противовоспалительный эффект.

[A6] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A5-3], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

[A7] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), приведенную ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность (i-1), приведенная выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или больше аминокислотных остатков.

[A7-2] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий:

(i) аминокислотную последовательность из положений 367-480 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, и аминокислотную последовательность (ii-1) или (ii-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина:

(ii-1) аминокислотная последовательность из положений 19-244 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(ii-2) аминокислотная последовательность (ii-1), упомянутая выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков.

[A8] Лекарственное средство по любому из пунктов [A1]-[A7-2], упомянутых выше, где тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

[B1] Способ терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B1-2] Способ терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождаемого коагулопатией, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B-2] Способ по пунктам [B1] или [B1-2], упомянутым выше, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункцией одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4 и равен или меньше 1,6.

[B3] Способ по любому из пунктов [B1]-[B-2], упомянутых выше, где пациент с тяжелым сепсисом является пациентом с тяжелым сепсисом, у которого дисфункция органов не ограничивается дисфункциями печени или почек.

[B4] Способ по любому из пунктов [B1]-[B3], упомянутых выше, который включает стадию введения тромбомодулина пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, выбранных из группы, состоящей из дисфункции печени, дисфункции почек, дисфункции органов дыхания и дисфункции органов кровообращения.

[B5] Способ по любому из пунктов [B1]-[B4], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой растворимый тромбомодулин.

[B6] Способ по любому из пунктов [B1]-[B5], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой пептид, полученный из трансформированной клетки, созданной путем трансфекции клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11.

[B7] Способ по любому из пунктов [B1]-[B6], упомянутых выше, где растворимый тромбомодулин представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность (i-1) или (i-2), упомянутую ниже, и указанный пептид представляет собой пептид, обладающий активностями тромбомодулина;

(i-1) аминокислотная последовательность из положений 19-516 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или 11, или

(i-2) аминокислотная последовательность (i-1), упомянутая выше, дополнительно содержащая замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков.

[B8] Способ по любому из пунктов [B1]-[B7], упомянутых выше, где тромбомодулин вводят в дозе 0,005-1 мг/кг в течение 5 мин с помощью внутривенного струйного введения.

[B8-2] Способ по любому из пунктов [B1]-[B8], упомянутых выше, где тромбомодулин представляет собой тромбомодулин, обладающий характерными особенностями, упомянутыми в пунктах [A5-2], [A5-3] или [A7-2], приведенных выше.

[B9] Применение тромбомодулина в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с тяжелым сепсисом, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[B9-2] Применение по пункту [B9], упомянутому выше, где тромбомодулин представляет собой тромбомодулин, обладающий характерными особенностями, упомянутыми в пунктах [A5-2], [A5-3] или [A7-2], приведенных выше.

[B9-3] Применение по пункту [B9], упомянутому выше, которое обладает характерными особенностями, упомянутыми в любом из пунктов [A1]-[A8], приведенных выше.

[C1] Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или коррекции диссеминированного внутрисосудистого свертывания, где указанное лекарственное средство вводят пациенту с диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, сопровождающимся дисфункциями одного или более органов, где показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

[C2] Лекарственное средство по пункту [C1], упомянутому выше, которое обладает характерными особенностями, упомянутыми в любом из пунктов [A1]-[A8], приведенных выше.

Эффект изобретения

С помощью лекарственного средства по изобретению, содержащего тромбомодулин, можно эффективно лечить и/или корректировать сепсис у пациента с тяжелым сепсисом, у которого показатель международного нормализованного отношения (INR) образца плазмы, полученного от указанного пациента, составляет более 1,4.

Варианты осуществления изобретения

Далее конкретно объясняются несколько предпочтительных вариантов осуществления изобретения (предпочтительные варианты осуществления изобретения, в дальнейшем также обозначаемые в описании как "варианты осуществления"). Однако объем изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, объясняемыми ниже.

Предпочтительно известно, что тромбомодулин по изобретению обладает эффектом (1) избирательного связывания с тромбином, (2) усиления активации белка C под действием тромбина. Кроме того, предпочтительным является то, что тромбомодулин, как правило, обладает (3) эффектом увеличения тромбинового времени, (4) эффектом подавления агрегации тромбоцитов, вызываемой тромбином, и/или (5) противовоспалительным эффектом. Такие эффекты, которыми обладает тромбомодулин, могут упоминаться как активности тромбомодулина.

Что касается эффектов тромбомодулина, тромбомодулин предпочтительно обладает эффектами (1) и (2), упомянутыми выше, и более предпочтительно обладает эффектами (1)-(4), упомянутыми выше. В отношении активностей тромбомодулина, тромбомодулин более предпочтительно обладает всеми эффектами (1)-(5), приведенными выше.

Эффект связывания тромбомодулина с тромбином может быть подтвержден методами исследования, описанными в различных известных публикациях, таких как Thrombosis and Haemostasis, 70(3): 418-422 (1993) и The Journal of Biological Chemistry, 264, 9, pp. 4872-4876 (1989). Что касается эффекта усиления активации белка C тромбином, то степень эффекта усиления активации белка C тромбином или наличия или отсутствия эффекта можно легко подтвердить методами исследования, подробно описанными в различных известных публикациях, включая, например, нерассмотренную патентную публикацию Японии No. 64-6219. Далее, эффект увеличения тромбинового времени и/или эффект подавления агрегации тромбоцитов, вызванной тромбином, можно без труда подтвердить аналогичным образом. Кроме того, противовоспалительный эффект также может быть подтвержден с методами исследования, описанными в различных известных публикациях, включая, например, Blood, 112: 3361-3670 (2008) и The Journal of Clinical Investigation, 115, 5: 1267-1274 (2005).

Тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен при условии, что он обладает активностями тромбомодулина. Тромбомодулин предпочтительно представляет собой растворимый тромбомодулин при условии отсутствия сурфактантов. Растворимость растворимого тромбомодулина в воде, например в дистиллированной воде, используемой для инъекций (в отсутствие сурфактанта, такого как Triton X-100 или полидоканол, и обычно при нейтральных значениях pH), составляет предпочтительно, например, 1 мг/мл или более, или 10 мг/мл или более; предпочтительно 15 мг/мл или более, или 17 мг/мл или более; более предпочтительно 20 мг/мл или более, 25 мг/мл или более, или 30 мг/мл или более; особенно предпочтительно 60 мг/мл или более. В некоторых случаях растворимость составляет, например, 80 мг/мл или более, или 100 мг/мл или более. Для того чтобы определить, хорошо ли растворяется в воде растворимый тромбомодулин, следует понимать, что в качестве простых критериев можно использовать прозрачность раствора и отсутствие заметных нерастворенных веществ, после того как растворимый тромбомодулин растворяют в воде и рассматривают раствор визуально, например, просто при белом свете в положении, соответствующем освещенности приблизительно 1000 люкс. Растворимость также можно определить по наличию или отсутствию какого-либо осадка после фильтрования раствора.

Молекулярная масса тромбомодулина не ограничена, при условии, что он обладает активностями тромбомодулина, которые описаны выше. Молекулярная масса предпочтительно составляет 100000 или меньше, более предпочтительно 90000 или меньше, еще более предпочтительно 80000 или меньше, наиболее предпочтительно 70000 или меньше, и молекулярная масса предпочтительно составляет 50000 или больше, наиболее предпочтительно 60000 или больше. Молекулярную массу растворимого тромбомодулина можно легко определить общепринятыми методами измерения молекулярной массы белка. Измерение с помощью масс-спектрометрии является предпочтительным, и метод MALDI-TOF-MS является более предпочтительным. Для получения растворимого тромбомодулина, обладающего молекулярной массой в желаемом диапазоне, растворимый тромбомодулин, который получают путем культивирования трансформированной клетки, созданной с помощью трансфекции клетки-хозяина ДНК, кодирующей растворимый тромбомодулин, с использованием вектора, можно подвергнуть фракционированию с использованием колоночной хроматографии или т.п., как описано ниже.

Тромбомодулин, используемый в изобретении, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, которая известна как центральная часть, обеспечивающая активность тромбомодулина человека, и тромбомодулин особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков в положениях 19-132 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность, состоящая из аминокислотных остатков в положениях 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1, может быть естественно или искусственно изменена при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, то есть одной из активностей тромбомодулина. В частности, последовательность может содержать замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, состоящей из аминокислотных остатков в положениях 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1. Приемлемый уровень изменений особенно не ограничен при условии, что аминокислотная последовательность обладает активностями тромбомодулина. Пример включает гомологию 50% или более в виде аминокислотных последовательностей, и гомология предпочтительно составляет 70% или более, более предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более, особенно предпочтительно 95% или более и наиболее предпочтительно 98% или более. Такую измененную аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию или добавление одного или более аминокислотных остатков, называют гомологичной мутантной последовательностью. Как описано ниже, такие измененные аминокислотные последовательности можно легко получить с помощью обычных методов генной инженерии. Тромбомодулин конкретно не ограничен при условии, что он характеризуется вышеупомянутой последовательностью и эффектом селективного связывания с тромбином с усилением активации белка C тромбином по меньшей мере как целый тромбомодулин, но предпочтительно тромбомодулин также обладает противовоспалительным эффектом.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 125 последовательности SEQ ID NO: 1 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 3.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, если тромбомодулин имеет по меньшей мере аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-132, представленных в SEQ ID NO: 1 или 3, или мутантную последовательность, гомологичную упомянутой выше последовательности, и содержит по меньшей мере пептидную последовательность, обладающую активностями тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности с положениями 19-132 или 17-132 представленными в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности и по меньшей мере обладающий активностями тромбомодулина. Пептид, состоящий из последовательности с положениями 19-132, представленными в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, является более предпочтительным. В другом варианте осуществления более предпочтительным является пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, состоящей из положений 19-132 или 17-132, представленных в SEQ ID NO: 1 или в SEQ ID NO: 3, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина согласно изобретению тромбомодулин предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5, которая особенно не ограничена, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность, состоящая из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5, может представлять собой мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, т.е. одной из активностей тромбомодулина.

Последовательность SEQ ID NO: 7 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 473 последовательности SEQ ID NO: 5 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность с положениями 19-480 в SEQ ID NO: 7.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, если тромбомодулин имеет по меньшей мере последовательность, состоящую из положений 19-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, и содержит по меньшей мере пептидную последовательность, обладающую активностями тромбомодулина, предпочтительные примеры тромбомодулина включают пептид, состоящий из последовательности, состоящей из положений 19-480 или 17-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина. Пептид, состоящий из последовательности, состоящей из положений 19-480 в SEQ ID NO: 5 или 7, является более предпочтительным. В другом варианте осуществления пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной последовательности, состоящей из положений 19-480 или 17-480, представленных в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, и обладающий активностями тромбомодулина, является более предпочтительным.

В качестве другого варианта осуществления тромбомодулина согласно изобретению тромбомодулин предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9, который особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9. Аминокислотная последовательность, состоящая из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 9, может представлять собой мутантную последовательность, гомологичную указанной выше последовательности, при условии, что последовательность обладает эффектом усиления активации белка C тромбином, т.е. активностью тромбомодулина.

Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 11 содержит мутацию в виде аминокислоты Val в положении 473 в SEQ ID NO: 9 вместо Ala. Тромбомодулин, используемый в изобретении, также предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, состоящую из положений 19-515, представленных в SEQ ID NO: 11.

Как описано выше, хотя тромбомодулин, используемый в изобретении, особенно не ограничен, при условии, что тромбомодулин имеет по меньшей мере последовательность, состоящую из положений 19-515 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, или мутантную последовательность, гомологичную вышеуказанной последовательности, и содержит пептидную последовательность, обладающую по меньшей мере активностями тромбомодулина, более предпочтительные примеры включают пептид, характеризующийся последовательностью, состоящей из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, и пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной упомянутой выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина. Пептид, имеющий последовательность, состоящую из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 9, является особенно предпочтительным. Смесь их также является предпочтительным примером. В другом варианте осуществления пептид, имеющий последовательность, состоящую из положений 19-516, 19-515, 17-516 или 17-515, представленных в SEQ ID NO: 11, является особенно предпочтительным. Смесь их также является предпочтительным примером. Кроме того, пептид, состоящий из мутантной последовательности, гомологичной указанной выше последовательности, и обладающий по меньшей мере активностями тромбомодулина, также является предпочтительным примером. Предпочтительно растворимый тромбомодулин также обладает противовоспалительным эффектом.

Пептид, имеющий гомологичную мутантную последовательность, является таким, как описано выше, и означает пептид, который может содержать замену, делецию или добавление по меньшей мере одного, а именно одного или более, предпочтительно нескольких (например, 1-20, предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-5, особенно предпочтительно 1-3) аминокислотных остатков, в аминокислотной последовательности изменяемого пептида. Хотя приемлемый уровень изменения особенно не ограничен при условии, что пептид обладает активностями тромбомодулина, пример подходящего уровня гомологии включает 50%