Модифицированные антитела, с которыми связан мотив, включающий остаток цистеина, конъюгаты этих модифицированных антител с лекарственными веществами и способ их получения

Модифицированные антитела, с которыми связан мотив, включающий остаток цистеина, конъюгаты этих модифицированных антител с лекарственными веществами и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к модифицированным антителам, содержащим мотив, включающий остаток цистеина (Cys), связанный с исходным антителом, предпочтительно на конце его молекулы, более предпочтительно на конце тяжелой или легкой цепи исходного антитела, наиболее предпочтительно - на С-конце тяжелой или легкой цепи исходного антитела; к конъюгатам этих модифицированных антител с лекарственными веществами (mADC), включающим лекарственное вещество, предназначенное для диагностики или лечения и связанное с модифицированным антителом; и к способу получения этих модифицированных антител или их конъюгатов с лекарственными веществами.

Конъюгат модифицированного антитела с лекарственным веществом по данному изобретению может точно доставить это вещество к клетке-мишени благодаря высокой антигенной специфичности исходного антитела, включенного в конъюгат, и таким образом усиливается терапевтический эффект данного лекарственного вещества. Также это может увеличить полезность лекарства, что в особенности касается противораковых препаратов с высокой активностью, применение которых ограничено их токсичностью.

Также данное изобретение относится к композициям, включающим конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, для лечения заболеваний, в частности раковых заболеваний, и к способу лечения заболеваний с использованием конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами.

Конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению могут содержать некоторое число остатков цистеина, которые служат для образования конъюгата антитела с лекарственным веществом, поскольку мотив, содержащий один или более остатков цистеина, связан с исходным антителом. Таким образом, конъюгат по данному изобретению может содержать большое количество молекул связанного лекарственного вещества, и это количество лекарства может быть эффективно доставлено клетке-мишени или ткани, подлежащей лекарственному воздействию. Кроме того, число остатков цистеина, связывающихся с исходным антителом, легко контролировать, и, соответственно, легко контролировать количество лекарственного вещества, содержащегося в конъюгате с модифицированным антителом, доводя его до желаемого уровня.

Также, поскольку в силу своей высокой антигенной специфичности конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению способны точно доставлять лекарство к клетке-мишени, они могут усилить терапевтический эффект данного лекарства и увеличить полезность лекарственных препаратов, в частности противораковых, применение которых ограничено из-за их токсичности несмотря на противораковую эффективность.

Уровень техники

Среди биологических лекарственных (биофармацевтических) препаратов наиболее активно изучаются терапевтические агенты, в которых используются антитела, специфично связывающиеся со своими мишенями (то есть антигенами), экспрессирующимися при определенных заболеваниях. В частности, интенсивно идет идентификация антигенов, ассоциированных с опухолями и экспрессирующихся на поверхности раковых клеток, и широко применяются способы диагностирования и лечения опухолей с использованием антител (то есть противораковых антител), связывающихся с такими антигенами, для подавления клеточного роста или индукции гибели клеток; область разработки этих методов имеет очень хорошие перспективы.

Такие противораковые антитела обладают очень высокой специфичностью к мишени, но их цитотоксическое воздействие на раковые клетки обычно слабее, чем у существующих цитотоксических лекарств (то есть противораковых лекарственных препаратов или агентов). Поэтому во многих случаях эти противораковые антитела служат в комбинированной терапии с цитотоксическими агентами или иными лекарственными веществами, подавляющими пролиферацию клеток.

Что касается упомянутой выше комбинированной терапии, то весьма активно изучаются конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами (mADC), обеспечивающих усиление терапевтического эффекта связанного цитотоксического агента при снижении его токсичности. Считается, что при использовании конъюгата модифицированного антитела с лекарственным веществом системная токсичность этого вещества снижается, а его цитотоксичность в отношении определенных клеток (в частности, раковых клеток), в которых усилена экспрессия мишени, может увеличиться, и таким образом усиливается терапевтический эффект данного лекарственного вещества.

Так, для лечения неходжкинской лимфомы или острого миелоидного лейкоза успешно разработаны конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, включающие цитотоксический агент или радиоактивный изотоп, связанный с антителом, например ZEVALIN™ [Witzig et al., J. Clin. Oncol, 2002, 20(15): 3262-3269]) или MYLOTARG™ [Drags of the Future, 2000, 25(7): 686]). Предпринимались также попытки получить конъюгаты антител с высокотоксичным мертанзином (например, кантузумаб-мертанзин (Immunogen, Inc. [Xie et al., J. of Pharm. and Exp. Ther. 2004, 308 (3): 1073-1082]) или трастузумаб-мертанзин (Roche [Isakoff et al., J. Clin. Oncol. 2011, 9(4): 351-4])) или с другими цитотоксическими лекарственными веществами, например производными доластатина (например, пептиды ауристатин, ауристатин Ε (АЕ), монометилауристатин (метил-валин-валин-долаизолейцин-долапроин-норэфедрин, обозначаемый ММАЕ, или метал-валин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланин, обозначаемый MMAF); при этом брали такие антитела, как cBR96 (специфичные к карциномному антигену Lewis Y); cAClO, специфичные к белку CD30, свойственному злокачественным заболеваниям крови; антитела, специфичные к опухолевому маркеру CD20, для лечения раковых заболеваний, при которых наблюдается экспрессия этого белка; моноклональные антитела Rituxan для лечения иммунных расстройств; антитела против рецептора эфрина EphB2R для лечения колоректального рака; антитела 2Н9, антитела против интерлейкина-8; антитела против селектина Ε ([Klussman, et al., Bioconjugate Chemistry, 2004, 15(4): 765-773]; [Doronina et al., Nature Biotechnology, 2003, 21(7): 778-784]; [Francisco et al., Blood, 2003, 102(4): 1458-1465]) US 2004/0018194 A1) WO 04/032828 A3; [Mao et al., Cancer Research, 2004, 64(3): 781-788]; [Bhaskar et al., Cancer Res, 2003, 63: 6387-6394]).

Предпринимались также попытки разработать конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, используя дауномицин, доксорубицин, метотрексат или виндезин. Известно, что в таких конъюгатах можно использовать бактериальные токсины (например, дифтерийный), растительные токсины (например, рицин) или некоторые низкомолекулярные соединения (например гелданамицин) ([Mandler et al., J. of the Nat. Cancer Inst, 2000, 92 (19): 1573-1581]; [Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 2000, 10: 1025-1028]; [Mandler et al., Bioconjugate Chem, 2002, 13: 786-791]), майтанзиноид ([ЕР 1391213 A1]; [Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 8618-8623]) или калихеамицин ([Lode et al., Cancer Res, 1998, 58: 2928]; [Hinman et al., Cancer Res, 1993, 53: 3336-3342]). Эти цитотоксические агенты обладают способностью убивать клетки и подавлять их пролиферацию посредством таких механизмов, как связывание тубулина, связывание ДНК или ингибирование топоизомеразы.

Когда для получения описанных выше конъюгатов антител с лекарственными веществами применяют обычные методы создания ковалентных связей между компонентами конъюгата, молекулы лекарственного вещества оказываются связанными с несколькими сайтами молекулы антитела, так что получается гетерогенная смесь. Например, цитотоксический агент может связываться с антителом через остатки лизина в его полипептидной цепи, в результате чего образуется гетерогенная смесь конъюгатов этого агента с молекулами антитела. В такой гетерогенной смеси могут быть конъюгаты, содержащие различное число связанных молекул лекарственного агента - от 0 до 8 в зависимости от условий реакции - и распределение их тоже может быть разным, то есть число молекул связанного лекарственного вещества на единицу антитела варьирует.

Для конъюгатов с определенным числом связанных молекул лекарственного вещества существует иной источник гетерогеннности - различные сайты конъюгирования. Для производства лекарств в больших масштабах гомогенизирующая очистка гетерогенной смеси не подходит ([Hamblett et al., Clin. Cancer Res, 2003, 10, 7063-7070], [Wang et al., Protein Sci. 2005, 14, 2436-2446]).

Другой метод конъюгирования лекарственных веществ с антителами состоит в восстановлении дисульфидных связей между остатками цистеина в молекуле антитела при помощи восстанавливающих агентов с последующим присоединением лекарственного агента к образовавшимся тиоловым группам восстановленных остатков цистеина. Этот метод тоже имеет свои недостатки, а именно: во-первых, из-за реакции восстановления антитело может утратить какие-либо присущие ему свойства, а во-вторых, образуется весьма гетерогенная смесь. Конкретные примеры: иммуноглобулин M - пентамер за счет дисульфидных связей, а в иммуноглобулине G - внутренние дисульфидные связи. В таких белках восстановление дисульфидных связей при помощи реагентов типа дитиотреитола (DTT) или селенола создает реакционноспособные тиоловые группы ([Singh et al., Anal. Biochem. 2002, 304: 147-156]). Это может привести к изменению исходной третичной структуры и потере связанной с ней специфичности связывания антигена ([Jagath et al., Nature Biotechnology, 2008, 26(8): 925-32]).

Типичным недостатком обычных методов конъюгирования антител с лекарственными веществами, описанных выше, является то, что трудно точно контролировать сайты конъюгирования с лекарственным веществом в молекуле антитела и число связанных молекул лекарственного вещества. В попытке преодолеть эти недостатки для создания свободных тиоловых групп определенные аминокислотные остатки заменяли на остатки цистеина там, где такая замена не нарушала функционирование антитела. С этой целью для молекулы антитела была предсказана вероятная реакционноспособность тиоловых групп в каждом сайте возможных мутаций, после чего был разработан способ скрининга для выявления оптимальных мутантов. (Korean Patent Laid-Open Publication No. 2007-0054682, ′ThioFab technology′). Полученный таким путем конъюгат антитела (трастузумаба) с лекарственным веществом (мертанзином) проходит в настоящее время испытания применительно к лечению метастазирующего рака молочной железы. ([Bums III et al., J. Clin. Oncol, 2011, 29(4): 398-405]). Описанный выше метод, обозначенный ThioFab, обладает тем преимуществом, что нарушение дисульфидных связей в молекул исходного антитела можно свести к минимуму путем введения в молекулу антитела новых остатков цистеина, однако опасение относительно изменения структуры и функционирования исходных антител из-за замены некоторых аминокислотных остатков в молекуле исходного антитела на цистеин остается.

Следовательно, настоятельно необходимо разработать новые конъюгаты антител с лекарственными веществами и способ их получения, которые бы позволяли точно контролировать число и положение связанных молекул лекарственного вещества, конъюгированного с исходным антителом так, чтобы структурные и функциональные свойства исходного антитела не изменялись.

Раскрытие изобретения

Цель настоящего изобретения - решить существовавшие в данной области техники проблемы, описанные выше, и предложить новые антитела (далее называемые модифицированными антителами), которые содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, связанных с молекулой исходного антитела, для создания множества сайтиов связывания лекарственного вещества. Также цель данного изобретения состоит в том, чтобы предложить конъюгаты модифицированных антител с лекарственными веществами, содержащие лекарственный агент, связанный с модифицированным антителом.

Модифицированные антитела по данному изобретению способны эффективно связываться с различными лекарственными агентами, причем свойства исходного антитела сохраняются, и таким образом достигается высокая специфичность в отношении мишени и увеличивается терапевтический эффект содержащегося в конъюгате лекарственного вещества.

Преимущество модифицированных антител по данному изобретению состоит в том, что они содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, и таким образом лекарственное вещество, связавшись с этими остатками цистеина, в составе конъюгата будет прицельно доставлено к ткани-мишени. Кроме того, можно точно контролировать число остатков цистеина, с которыми может связаться лекарственное вещество, и тем самым контролировать число или количество молекул лекарственного агента в конъюгате с модифицированным антителом. Соответственно, конъюгаты модифицированных антител с лекарственным веществом по данному изобретению можно использовать как отличную систему прицельной доставки лекарств в организме, в которой преодолеваются недостатки обычных конъюгатов антител с лекарственными веществами и которую можно эффективно применять для лечения заболеваний, например рака.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 изображает схему экспрессионного вектора для модифицированного антитела, представляющего собой трастузумаб, содержащий цистеин

Фиг. 2 представляет результаты вестерн-блоттинга после очистки трастузумаба (две правых дорожки) и варианта трастузумаба, содержащего цистеин (HR-Cys, две левых дорожки).

Фиг. 3 представляет результаты абсорбционной спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом диапазоне (UV-VIS) (3А) и электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (3В), подтверждающие образование конъюгата доксорубицина с HR-Cys.

Фиг. 4 представляет результаты электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) (4А) и определения относительной интенсивности флуоресценции (4В) красителя Alexa488, связавшегося с тяжелыми и легкими цепями, для Her-M2(Cys)-Alexa488, являющегося конъюгатом варианта антитела Her-M2(Cys) и AlexaFluor® 488.

Фиг. 5 представляет результаты определения при помощи реагента MTS [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия] подавляющего действия на клеточный рост конъюгата HR-Cys-DOX, герцептина, смеси (1:2) герцептина с доксорубицином и доксорубицина в клетках ВТ-474, в которых экспрессируется антиген HER2.

Фиг. 6 представляет результаты определения подавляющего действия на клеточный рост конъюгата модифицированного герцептина с монометилауристатином (HER-M(Cys)-ММАЕ) в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, по сравнению с герцептином.

Фиг. 7 представляет результаты определения каспазной активности, отражающей апоптоз, в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, под действием различных концентраций HR-Cys2-MMAE в сравнении с герцептином.

Фиг. 8 представляет результаты определения каспазной активности, отражающей вызываемый монометилауристатином (ММАЕ) апоптоз, в клетках SK-BR3, в которых экспрессируется антиген HER2, под действием различных концентраций конъюгата варианта герцептина с монометилауристатином в сравнении с герцептином.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение описывается подробнее.

Настоящим изобретением предлагаются новые модифицированные антитела, которые содержат мотив, включающий один или более остатков цистеина, связанный с молекулой исходного антитела, для создания множества сайтов связывания антитела с лекарственным агентом, причем иммуноконъюгат лекарственного агента содержит такое модифицированное антитело. Модифицированные антитела по данному изобретению могут образовывать конъюгаты с различными лекарственными веществами, сохраняя свойства исходных антител, и, таким образом, их можно эффективно использовать в иммуноконъюгатах.

В настоящем документе термин «исходное антитело» означает обычное антитело - без мотива, содержащего цистеин. По данному изобретению можно без ограничения использовать любые исходные антитела, обладающие сродством связывания и специфичностью в отношении определенного антигена. Примеры исходных антител, которые можно использовать по данному изобретению, включают моноклональные или поликлональные антитела, например происходящие из животных (например, мышей), гибридные антитела, гуманизированные антитела и человеческие антитела, полученные с использованием трансгенных мышей или методом фагового дисплея. Для специалиста в данной области техники должно быть ясно, что по настоящему изобретению в качестве модифицированных антител можно использовать также биспецифичные антитела или фрагменты антител.

В настоящем документе термин «фрагмент антитела» относится к фрагментам, сохраняющим по меньшей мере сродство связывания в отношении антигена. Примеры фрагментов антител включают одноцепочечные антитела (scAb), диантитела, триантитела, тетраантитела, фрагменты Fab, F(ab′)₂, Fd, scFv, доменные антитела, миниантитела, производные константных областей антител и искусственные антител на основе белковых каркасов.

Кроме того, примеры исходных антител, которые можно использовать по данному изобретению, включают все типы иммуноглобулинов (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) и их подтипы (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Также исходные антитела могут происходить из любого вида живых организмов.

Исходные антитела по данному изобретению обладают сродством связывания и специфичностью к антигенам, характерным для раковых заболеваний, например к антигенам, ассоциированным с опухолями (ТАА), рецепторным белкам клеточной поверхности, нерецепторным белкам и другим молекулам клеточной поверхности, трансмембранным белкам, сигнальным белкам, регуляторам выживания клеток, регуляторам пролиферации клеток, веществам, ассоциированным с (то есть установлено или предполагается функциональное участие) развитием или дифференцировкой тканей, лимфокинам, цитокинам, веществам, участвующим в регуляции клеточного цикла, веществам, участвующим в васкулогенезе, и веществам, ассоциированным (то есть установлено или предполагается функциональное участие) с ангиогенезом.

Конкретные антигены, с которыми могут связываться исходные антитела, по данному изобретению следующие (не ограничиваясь перечисленным здесь):

(1) BMPR1B (рецептор костного морфогенетического белка типа IB; Genbank регистрационный номер NM_001203);

(2) Е16 (LATI, SLC7A5; Genbank регистрационный номер NM_003486);

(3) STEAP1 (шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы; Genbank регистрационный номер NM_012449);

(4) 0772Р (СА125, MUC16; Genbank регистрационный номер AF361486);

(5) MPF (MPF, MSLN, SMR, мегакариоцитарный потенцирующий фактор, мезотелин; Genbank регистрационный номер NM_005823);

(6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, член 2 семейства 34 переносчиков растворенных веществ (фосфата натрия), натрий-зависимый переносчик фосфата 3b типа II; Genbank регистрационный номер NM_006424);

(7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, Семафорин 5b Hlog, sema-домен, семь тромбоспондиновых повторов (тип 1 и подобные типу 1), трансмембранный домен (ТМ) и короткий цитоплазматический домен, (семафорин) 5В; Genbank регистрационный номер АВ040878);

(8) PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN кДНК 2700050C12; Genbank регистрационный номер AY358628);

(9) ETBR (рецептор эндотелина типа В; Genbank регистрационный номер AY275463);

(10) MSG783 (RNF124, гипотетический белок FLJ20315; Genbank регистрационный номер NM_017763);

(11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, ген, ассоциированный с раком предстательной железы, 1, белок, ассоциированный с раком предстательной железы, 1, шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы 2, шестой трансмембранный белок предстательной железы; Genbank регистрационный номер AF455138);

(12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, рецептор катионного канала с транзиторным потенциалом, подсемейство М, член 4; Genbank регистрационный номер NM_017636);

(13) CRIPTO (GR, CRI, CRGF, CRIPTO, TDGF1, тератокарциномный фактор роста; Genbank регистрационный номер NP 003203 или NM_003212);

(14) CD21 (CR2 (рецептор комплемента 2) или C3DR (рецептор компонента комплемента C3d и вируса Эпштейна-Барр) или Hs.73792 Genbank регистрационный номер М26004);

(15) CD79b (CD79B, CD79β, IGb (ассоциированный с Ig-бета), В29; Genbank регистрационный номер NM_000626);

(16) FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (фосфатазный жорный белок, содержащий домен SH2, 1a), SPAP1B, SPAP1C; Genbank регистрационный номер NM_030764);

(17) HER2 (Genbank регистрационный номер M11730);

(18) NCA (Genbank регистрационный номер M18728);

(19) MDP (Genbank регистрационный номер ВСО17023);

(20) IL20Rα (Genbank регистрационный номер AF184971);

(21) Бревикан (Genbank регистрационный номер AF229053);

(22) EphB2R (Genbank регистрационный номер NM 004442);

(23) ASLG659 (Genbank регистрационный номер АХ092328);

(24) PSCA (Genbank регистрационный номер AJ297436);

(25) GEDA (Genbank регистрационный номер AY260763);

(26) BAFF-R (рецептор фактора активации В-клеток, BLyS-рецептор, BR3, NP_443177.1);

(27) CD22 (В-клеточный рецептор CD22-B изоформа; NP_001762.1);

(28) CD79a (CD79A, CD79α, ассоциированный с Ig-альфа специфичный для В-клеток белок, который ковалентно взаимодействует с Ig-бета (CD79B) и образует комплекс на поверхности с молекулами IgM, передает сигнал, участвующий в дифференцировке В-клеток; Genbank регистрационный номер NP_001774.1);

(29) CXCR5 (рецептор 1 лимфомы Беркитта, рецептор, сопряженный с G белком, то есть активируемый хемокином CXCL13, действует при миграции лимфоцитов и гуморальной защите, играет роль в инфекции HTV-2 и, возможно, в развитии СПИДа, лимфомы, миеломы и лейкоза); Genbank регистрационный номер NP_001707.1);

(30) HLA-DOB (бета-субъединица молекулы МНС класса II (антиген 1а), который связывается с пептидами и представляет их (CD4⁺)Т-лимфоцитам; Genbank регистрационный номер NP_002111.1);

(31) Р2Х5 (пуринергический рецептор Р2Х лиганд-зависимого ионного канала 5; ионный канал, управляемый внеклеточным АТФ, может участвовать в синаптической передаче и нейрогенезе, недостаточность может вносить вклад в патофизиологическую картину идиопатической гиперактивности (нестабильности) детрузора; Genbank регистрационный номер NP_002552.2);

(32) CD72 (антиген CD72, ассоциированный с дифференцировкой В-клеток; Lyb-2; Genbank регистрационный номер NP_001773.1);

(33) LY64 (лимфоцитарным антиген 64 (RP105), мембранный белок семейства белков, богатых лейциновыми повторами (LRR) типа I, регулирует активацию В-клеток и апоптоз, утрата функции связана с агрессивностью заболевания у больных системной красной волчанкой; Genbank регистрационный номер NP 005573.1);

(34) FcRHl (белок 1, подобный Fc-рецептору, предполагаемый рецептор для Fc-домена иммуноглобулинов, который содержит С2-тип Ig-подобных и ITAM-доменов, может играть роль в дифференцировке В-лимфоцитов); Genbank регистрационный номер NP_443170.1);

(35) IRTA2 (ассоциированный с транслокацией рецептор суперсемейства 2 иммуноглобулинов, предполагаемый иммунорецептор, возможно, играющий роль в развитии В-клеток и лимфомагенезе; нарушение регуляции его гена в результате транслокации встречается при некоторых В-клеточных злокачественных новообразованиях; Genbank регистрационный номер NP_112571.1); и

(36) TENB2 (предполагаемый трансмембранный протеогликан, родственный семейству факторов роста EGF/герегулин и фоллистатину; Genbank регистрационный номер AF179274). Кроме того, примеры антигенов включают все антигены, которые можно использовать для лечения или диагностики.

В одном из предпочтительных воплощений данного изобретения исходное антитело обладает сродством связывания и специфичностью к рецепторам семейства эпидермального фактора роста EGFR/ErbB, выбираемому из EGFR, HER2, НЕЮ, HER4 и других раковых антигенов.

В частности, исходные антитела, которые используются по данному изобретению, включают одно или более антител, выбираемых из (не ограничиваясь перечисленным здесь) трастузумаба (торговое название Herceptin/герцептин), ритуксимаба (торговое название Rituxan/ритуксан), бевацизумаба (торговое название Avastin/авастин), цетуксимаба (торговое название Erbitux/эрбитукс), cBR96, cAClO, антител против CD20, антител против EphB2, антител против интерлейкина-8, антител против селектина Е, антител против MUC16 и антител против CD30.

Обозначение HER2 (ErB-В2) относится к одному из членов семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR/ErbB), являющемуся ключевым элементом сигнального каскада, участвующего в пролиферации и выживании раковых клеток молочной железы Известно, что тирозинкиназные рецепторы семейства EGFR/ErbB, включающие erb1, erb2/HER2, erb3 и erb4, участвуют в регуляции не только пролиферации, но и адгезии, миграции и дифференцировки клеток.

Такого лиганда, который из четырех членов erb этого семейства связывался бы только с erb2/HER2 не существует, но erb2/HER2 известен как наиболее мощный онкоген при раке молочной железы. При нормальном уровне HER2 этот белок участвует в росте и развитии нормальной ткани молочной железы, но при аномально усиленной экспрессии или амплификации HER2 нормальная регуляция клеток нарушается таким образом, что в ткани молочной железы возникают агрессивные раковые клетки. Иными словами, если HER2 активирован в результате олигомеризации с другими членами семейства EGFR, он фосфорилирует ряд последующих молекулярных мишеней, что ведет к активации различных сигнальных каскадов. Примерами механизмов, связанных с пролиферацией раковых клеток, являются путь SOS-Ras-Raf-MEK-MAPK, участвующий в пролиферации клеток, и путь PI-3K/Akt, обеспечивающий подавление смерти клеток.

Результаты предклинических и клинических испытаний показывают, что чрезмерная экспрессия HER2 является важным биологическим маркером, появляющимся на начальных этапах развития рака и играющим существенную роль в росте опухолей и прогрессировании рака. Известно, что чрезмерная экспрессия HER2 имеет место в 20-30% случаев инвазивного рака молочной железы, а также ассоциирована с плохим прогнозом развития этого заболевания, его высокой агрессивностью и злокачественностью.

Согласно данному изобретению мотив, содержащий один или более остатков цистеина, связан с исходным антителом, обладающим специфичностью к рецептору фактора роста, выбираемому из группы, состоящей из рецепторов HER2 или EGF. Обычное противораковое лекарственное вещество конъюгируют с указанным мотивом, так что получается модифицированный иммуноконъюгат (конъюгат антитела с лекарственным веществом) по данному изобретению. Когда такой конъюгат модифицированного антитела с лекарственным веществом вводят больному в количестве, эффективном для подавления роста опухолевых клеток, он может дать превосходный вклад в лечение рака благодаря подавлению роста опухолевых клеток, в которых чрезмерно экспрессируется рецептор фактора роста, и в то же время вызывая смерть таких клеток.

Исходным антителом по данному изобретению предпочтительно служит трастузумаб. Хотя этот препарат изготовляют таким образом, что он практически не содержит остатков лизина на С-концах полипептидных цепей, для конъюгатов модифицированных антител с лекарственным веществом по данному изобретению можно использовать трастузумаб как содержащий остатки лизина в С-концевой области, так и не содержащий их там, где может быть связан мотив, включающий цистеин (Cys).

В настоящем документе аминокислоты обозначаются общепринятыми трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами. Нуклеотиды в различных фрагментах нуклеиновых кислот обозначаются стандартными однобуквенными аббревиатурами, принятыми в данной области техники.

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению состоит из 1-100 аминокислотных остатков, предпочтительно из 1-50 аминокислотных остатков, более предпочтительно из 1-30, наиболее предпочтительно из 1-10 аминокислотных остатков, и включает один или более остатков цистеина. В частности, мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению включает предпочтительно 1-20 остатков цистеина, более предпочтительно 1-10 остатков цистеина, еще более предпочтительно 1-5 остатков цистеина.

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению, может представлять собой простой пептид без какой-либо специфической функции или вторичной либо третичной структуры, но предпочтительно, чтобы он обладал некой специфической функцией или вторичной либо третичной структурой. Под специфической функцией здесь имеется в виду предпочтительно свойство, состоящее в том, чтобы поддерживать/защищать способность остатков цистеина к химическому конъюгированию (но этим функции указанного мотива не ограничиваются). В частности, мотив, содержащий цистеин, может более эффективно поддерживать функциональность остатков цистеина путем предотвращения или задержки их окисления из-за связывания со специфичными лигандами или с вторичной/третичной структурой самого мотива (пептида).

Мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению, имеет структуру, представленную формулой (1):

где (M_Cys)_n представляет просто остаток цистеина или же пептид, содержащий остаток цистеина и обладающий специфической функцией или вторичной\третичной структурой; Ха и Xb_n независимо друг от друга представляют пептид, включающий 0-20 аминокислотных остатков, отличных от цистеина, а n - целое число от 1 до 20.

В формуле (1) (M_Cys)_n, то есть (M_Cys)₁, (M_Cys)₂……(M_Cys)_n могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга. Также Xb_n, то сеть Xb₁, Xb₂…Xb_n могут быть одинаковыми или же отличающимися друг от друга.

Кроме того, если (M_Cys)_n в формуле (1) является просто остатком цистеина, то мотив, содержащий цистеин, по данному изобретению имеет структуру, представленную формулой (2):

где Ха, Xb_n и n определяются так же, как в формуле (1).

Если (M_Cys)_n в формуле (1) является пептидом, включающим остаток цистеина и обладающим специфической функцией или вторичной/третичной структурой, то (M_Cys)_n может быть предпочтительно ионом металла, связывающим мотив, включающий остаток цистеина. Известно, что мотивы, включающие остаток цистеина и связывающиеся с ионами металлов, могут связывать ион металла для того, чтобы подавить окисление этого остатка цистеина, тем самым эффективно сдерживая способность цистеинового остатка к алкилированию (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8: 601-610).

Примеры применяемых по данному изобретению мотивов, содержащих остаток цистеина, которые связывают ионы металлов, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) хелатирующие агенты (Zhang et al. (2012) Biochem. Genet. 50(7-8): 585-599), которые используются для регуляции концентрации ионов металлов in vivo; шапероны (Ansbacher and Shurki, J. Phys. Chem. В (2012) 116(15): 4425-4432; Allen et al. (2012) Biochemistry 51(7): 1439-48; Click et al. (2012) H. Comput. Chem. 33(11): 1142-51), функция которых состоит в том, чтобы доставлять ионы металлов в определенные положения снаружи или внутри клетки; регуляторы транскрипции (Gunther et al. (2012) Biochim. Biophys. Acta. 1823(2): 476-483; Sitthisak et al. (2012) FEMS Microbiol. Lett. 327(2): 126-133), функционирование которых (регуляция транскрипции) зависит от концентрации ионов металлов; мотивы цинковых пальцев (MacPherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Bio. Rev. 70(3): 583-604; Schaeffer et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40(18): 9298-9307), которые имеются во многих белках, участвуя в белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействиях; и мотивы (Zielazinski et al. (2012) Biochemistry 51(40): 7891-7900; Zhou et al. (2012) FEBS J. 279(2): 285-298; Cochran et al. (2011) Nat. Struct. Mol. Biol. 19(1): 122-127), происходящие из различных ферментов. Мотивы, связывающие ионы металлов, содержат остаток цистеина, служащий ключевой связывающей группой; такие мотивы, связывающие ионы металлов, можно использовать для получения конъюгатов модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению.

Предпочтительные в данном изобретении примеры мотивов, связывающих ионы металлов, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) группу С₂Н₂ (класс Cys₂His₂: Cys-X_2-4-Cys-X₁₂-His-X_3-5-His), группу С₄ (класс С4: Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys-X_m-Cys-X₂-Cys-X_n-Cys-X₂-Cys) или группу С₆ (класс С6: Cys-X₂-Cys-X₆-Cys-X_5-12-Cys-X₂-Cys-X_6-8-Cys) цинковых пальцев; мотив вида Cys-X_m-Cys, например Cys-X-X-Cys или Cys-X-Cys; мотив Met-X-Cys-X-X-Cys или мотив C-Q-C-Q-C-A-C, часто встречающийся в белках - регуляторах транскрипции, белках металлошаперонах, белках - переносчиках металлов, супероксиддисмутазе или подобных ей белках; мотив Ser-Pro-Cys мембранной аденозинтрифосфатазы и проч. В описанных выше пептидных мотивах, связывающих ионы металлов, X представляет аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys); m - целое число от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5; X_m или X_m-q представляют аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys), количество которых указывается числом m или числом от m до q.

Конкретнее, примеры используемых по данному изобретению мотивов, связывающих ионы металлов, из белков с цинковыми пальцами включают (но не ограничиваются перечисленным здесь):

Мотив, связывающий ионы металла, белка с цинковыми пальцами может быть любым выбираемым из мотивов, связывающих ионы металлов, белков с цинковыми пальцами, описанными в следующих работах: http://www.zincfingers.org, http://www.genenames.org/genefamilies/ZF,

http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php,

https://zifdb.msi.umn.edu:8444/ZiFDB/ или Macpherson et al. (2006) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70(3), 583-604, которая по техническим признакам согласуется с данным изобретением.

Примеры мотивов, связывающих ионы металлов, из белков - регуляторов транскрипции, белков - металлошаперонов или им подобных, которые используются по данному изобретению, включают (но не ограничиваются пересиленным здесь):

У белков, связывающих цинк (Zn), которые обнаружены среди мембранных белков, участвующих в передаче сигналов у бактерий, имеется присущий им мотив, связывающий ионы металла, который состоит из одного остатка цистеина и трех остатков гистидина (Draper et al., J. Bacteriol. 2011, 193 (17), 4338-4345). В настоящем документе идет речь о связывающих ионы металлов мотивах, имеющих структуру HXXWFYLX_21-28CXLFMVIGXWFLVIX_18-27HXXH, где X представляет любую аминокислоту, a X_m-q представляет аминокислотные остатки, отличные от цистеина (Cys), количество которых указано числом от m до q. Кроме того, по данному изобретению в качестве мотива, связывающего ионы металла, можно использовать 150 или более известных на сегодняшний день белков, связывающих цинк.

Известные переносчики ионов металлов включают белки, участвующие в механизме облегченной диффузии катионов; белки Zrt; Irk-подобные белки; белки, осуществляющие обмен катионов; переносчики меди; АТФ-азы, транспортирующие тяжелые металлы, типа Р; АТФ-связывающие кассетные переносчики и проч. (Hanikenne et al. Plant Physiology 2005, 137, 428-446; Hall and Williams, J. Experimental Botany, 2003, 54(393) 2601-2613), и по данному изобретению предпочтительно используются следующие мотивы М-Х-С-Х-Х-С (не ограничиваясь перечисленным здесь):

Кроме того, в конъюгатах модифицированных антител с лекарственными веществами по данному изобретению могут быть использованы различные связывающие ионы металлов мотивы, сконструированные искусственно на основе соответствующих мотивов дикого типа, обнаруженных in vivo. Приметы таких мотивов, связывающих ионы металлов, включают (не ограничиваясь перечисленным здесь) мотив CGH (Van Horn et al. (2003) J. Biol. Inorg. Chem. 8: 601-610) составленный на основе мотива GGH из белка с цинковыми пальцами, не содержащего остатков цистеина, и мотивы (Jancso et al. (2011) Metallomics 3(12): 1331-1339), полученные путем замены одного или более остатков цистеина в пептидном мотиве на остатки других аминокислот, например треонина, серина или гистидина. Мотив CGH имеет структуру, представленную приведенной ниже химической формулой 1, и предпочтительно имеет структуру ACGHA с остатками аланина на С- и N-концах.

Химическая формула 1

[где Μ представляет ион металла, a R - остаток аминокислоты, отличной от цистеина, предпочтительно аланин].

Мотив CGH по данному изобретению обладает свойством связывать ион металла даже когда положения С-конца и N-конца обратные. Специалисту в данной области техники должно быть очевидно, что мотив HGC с обратными положениями С- и N-концов входит в объем мотива CGH по данному изобретению.

По данному изобретению можно использовать связывающие ионы металлов мотивы, искусственно сконструированные на основе мотивов цинковых пальцев, включающие приведенные ниже связывающие ионы металлов мотивы (см. Roehm and Berg, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120. 13083-13087), полученные путем замены остатка цистеина (кот