Мыши adam6

Мыши adam6

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Описаны генетически модифицированные мыши, клетки, эмбрионы и ткани, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую функциональный локус ADAM6. Модификации затрагивают локусы иммуноглобулина человека и/или гуманизированного иммуноглобулина. Описаны мыши, у которых отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6, но присутствует функция ADAM6, в том числе мыши, у которых присутствует эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ADAM6. Описаны генетически модифицированные мыши-самцы с модификацией эндогенного локуса иммуноглобулина V_H, которая придает мыши неспособность к синтезу функционального белка ADAM6 и приводящей к потере фертильности, а также обеспечивающей функцию ADAM6 у мышей-самцов, в том числе мыши, у которых присутствует эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, восстанавливающая фертильность у указанных самцов мыши.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Мыши, у которых присутствует гены антител человека, известны в данной области техники. Фармацевтическое применение антител на протяжении последних двух десятилетий стимулировало значительный объем исследований, касающихся получения антител, подходящих для применения в качестве терапевтических средств для человека. Первые терапевтические средства на основе антител, для которых применялись антитела мыши, не были идеальны в качестве терапевтических средств для человека, так как многократное введение мышиных антител людям приводит к иммуногенности, что может мешать при долгосрочных схемах лечения. Разрабатывались решения, основанные на гуманизации антител мыши для придания им в большей степени качеств антител человека и в меньшей степени - антител мыши. Затем появились способы экспрессирования последовательностей иммуноглобулина человека для применения в антителах, главным образом основанные на in vitro экспрессии фаговых, бактериальных или дрожжевых библиотек иммуноглобулина человека. Наконец, были предприняты попытки получить подходящие антитела человека из лимфоцитов человека in vitro, от мышей, которым были привиты гемопоэтические клетки человека, и от трансхромосомных или трансгенных мышей с инактивированными эндогенными иммуноглобулиновыми локусами. У трансгенных мышей необходимо было инактивировать эндогенные гены иммуноглобулина мыши, чтобы случайным образом встроенные полностью человеческие трансгены функционировали в качестве источника последовательностей иммуноглобулина, экспрессирующихся у таких мышей. Такие мыши способны синтезировать антитела человека, подходящие для применения в качестве терапевтических средств для человека, но у таких мышей наблюдаются значительные проблемы с иммунной системой. Указанные трудности (1) делают использование таких мышей нецелесообразным для получения достаточно разнообразного репертуара антител, (2) требуют применения дорогостоящих реконструктивных доработок, (3) обеспечивают неоптимальный процесс селекции клонов, по-видимому, из-за несовместимости элементов человека и мыши, и (4) делают указанных мышей ненадежным источником больших и разнообразных популяций вариабельных последовательностей человека, которые действительно подходили бы для получения терапевтических средств для человека.

[0003] В данной области техники продолжает существовать потребность в получении улучшенных генетически модифицированных мышей, подходящих для синтеза последовательностей иммуноглобулина, в том числе последовательностей антител человека. Также остается потребность в мышах, способных к реаранжировке сегментов генов иммуноглобулинов с образованием подходящих реаранжированных генов иммуноглобулинов, или способных к синтезу белков из измененных иммуноглобулиновых локусов, в то же время уменьшая или устраняя оказывающие пагубное воздействие изменения, к которым могут приводить генетические модификации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Согласно одному из аспектов предложены нуклеиновокислые конструкции, клетки, эмбрионы, мыши и способы получения мышей, содержащих модификацию, приводящую к нефункциональности эндогенного мышиного белка ADAM6 или гена ADAM6 (например, к нокауту, или к делеции в эндогенном гене ADAM6), при этом у указанных мышей присутствует последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ADAM6, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мышей-самцов.

[0005] Согласно одному из аспектов предложены конструкции нуклеиновых кислот, клетки, эмбрионы, мыши и способы получения мышей, содержащих модификацию эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, при этом у указанных мышей присутствует белок ADAM6, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мышей-самцов. Согласно одному из вариантов реализации указанный эндогенный локус иммуноглобулина мыши представляет собой локус тяжелой цепи иммуноглобулина, и указанная модификация уменьшает или элиминирует активность ADAM6 в клетке или в ткани у мышей-самцов.

[0006] Согласно одному из аспектов предложены мыши, у которых присутствует эктопическая последовательность нуклеотидов, кодирующая ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент; также предложены мыши, у которых присутствует эндогенная последовательность нуклеотидов, кодирующая ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, и по меньшей мере одна генетическая модификация локуса тяжелой цепи иммуноглобулина.

[0007] Согласно одному из аспектов предложены способы получения мышей, у которых присутствует модификация эндогенного локуса иммуноглобулина мыши, при этом у указанных мышей присутствует белок ADAM6, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мышей-самцов. Мышей согласно настоящему изобретению можно получить, например, с применением описанных в настоящей заявке способов.

[0008] Согласно одному из аспектов предложены способы получения мышей, у которых присутствует генетическая модификация локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом применение указанных способов дает мышей-самцов, у которых присутствует модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делеция); указанные мыши-самцы способны производить потомство посредством спаривания. Согласно одному из вариантов реализации указанные мыши-самцы способны продуцировать сперму, способную перемещаться из матки мыши через маточные трубы мыши для оплодотворения мышиной яйцеклетки.

[0009] Согласно одному из аспектов предложены способы получения мышей, у которых присутствует генетическая модификация локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом применение указанных способов дает мышей-самцов, у которых присутствует модифицированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина (или его делеция); у указанных мышей-самцов наблюдается снижение фертильности; у указанных мышей также имеется генетическая модификация, полностью или частично восстанавливающая сниженную фертильность. Согласно различным вариантам реализации снижение фертильности характеризуется неспособностью спермы мышей-самцов передвигаться из матки мыши по маточным трубам мыши для оплодотворения мышиной яйцеклетки. Согласно различным вариантам реализации снижение фертильности характеризуется проявлением дефекта подвижности у спермы in vivo. Согласно различным вариантам реализации генетическая модификация, полностью или частично восстанавливающая сниженную фертильность, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мышей-самцов.

[00010] Согласно одному из вариантов реализации указанная генетическая модификация включает замену эндогенных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина вариабельными локусами тяжелой цепи иммуноглобулина других видов (например, не являющихся мышами). Согласно одному из вариантов реализации указанная генетическая модификация включает вставку ортологичных вариабельных локусов тяжелой цепи иммуноглобулина в эндогенные вариабельные локусы тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту реализации указанный вид представляет собой человека. Согласно одному из вариантов реализации указанная генетическая модификация включает удаление эндогенного локуса вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина полностью или частично, при этом указанное удаление приводит к потере функции эндогенного ADAM6. Согласно конкретному варианту реализации указанная потеря функции эндогенного ADAM6 связана со снижением фертильности у мышей-самцов.

[00011] Согласно одному из аспектов предложены мыши, у которых присутствует модификация, которая уменьшает или элиминирует экспрессию ADAM6 мыши из эндогенного аллеля ADAM6, так что у самца мыши, имеющего указанную модификация, наблюдается снижение фертильности (например, значительное снижение способности производить потомство посредством спаривания) или по существу бесплодность из-за снижения или утраты функции эндогенного ADAM6, при этом у указанных мышей также присутствует эктопическая последовательность ADAM6, либо его гомолога, ортолога или функционального фрагмента. Согласно одному из аспектов модификация, которая уменьшает или элиминирует экспрессию ADAM6 мыши, представляет собой модификацию (например, вставку, удаление, замещение, и т.п.) в локусе иммуноглобулина мыши.

[00012] Согласно одному из вариантов реализации снижение или утрата функции ADAM6 включает неспособность или по существу полную неспособность мыши продуцировать сперму, способную передвигаться из матки мыши через маточные трубы мыши для оплодотворения мышиной яйцеклетки. Согласно конкретному варианту реализации по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% спермиев в объеме эякулята мыши неспособны проходить через маточные трубы in vivo после копуляции и оплодотворять яйцеклетку мыши.

[00013] Согласно одному из вариантов реализации уменьшение или утрата функции ADAM6 включает неспособность к формированию или по существу полную неспособность к формированию комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности спермия мыши. Согласно одному из вариантов реализации утрата функции ADAM6 включает по существу полную неспособность к оплодотворению мышиной яйцеклетки посредством копуляции с самкой мыши.

[00014] Согласно одному из аспектов предложена мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует белок (или эктопическая последовательность нуклеотидов, кодирующая белок), обеспечивающий функционал ADAM6 у указанной мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная мышь представляет собой самца мыши, а указанный функционал включает повышение фертильности по сравнению с мышью, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6.

[00015] Согласно одному из вариантов реализации указанный белок кодируется геномной последовательностью, расположенной в иммуноглобулиновом локусе зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту реализации указанный иммуноглобулиновый локус представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно другому конкретному варианту реализации указанный локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно одному из вариантов реализации эктопический белок кодируется геномной последовательностью расположенной в не-иммуноглобулиновом локусе зародышевой линии мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанный не-иммуноглобулиновый локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту реализации указанный транскрипционно активный локус представляет собой ROSA26 локус. Согласно конкретному варианту реализации указанный транскрипционно активный локус связан с тканеспецифической экспрессией. Согласно одному из вариантов реализации указанная тканеспецифическая экспрессия происходит в репродуктивных тканях. Согласно одному из вариантов реализации указанный белок кодируется геномной последовательностью, случайным образом встраиваемой в зародышевую линию мыши.

[00016] Согласно одному из вариантов реализации у мыши присутствует легкая цепь человека, или гибридная легкая цепь человека/мыши, или гибридная легкая цепь человека/крысы (например, вариабельная область человека, константная область мыши или крысы); и гибридная тяжелая цепь с вариабельной областью человека/константной областью мыши или крысы. Согласно конкретному варианту реализации у мыши присутствует трансген, который содержит ген гибридной легкой цепи с вариабельной областью человека/константной областью крысы или мыши, функционально связанный с транскрипционно активным промотором, например, промотором ROSA26. Согласно еще одному конкретному варианту реализации указанный трансген гибридной легкой цепи человека/мыши или крысы содержит последовательность реаранжированной вариабельной области легкой цепи человека в зародышевой линии мыши.

[00017] Согласно одному из вариантов реализации указанная эктопическая последовательность нуклеотидов расположена в иммуноглобулиновом локусе в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту реализации указанный иммуноглобулиновый локус представляет собой локус тяжелой цепи. Согласно одному из вариантов реализации указанный локус тяжелой цепи содержит по меньшей мере один генный сегмент V_H человека, по меньшей мере один генный сегмент D_H человека и по меньшей мере один генный сегмент J_H человека. Согласно одному из вариантов реализации указанная эктопическая последовательность нуклеотидов расположена в не-иммуноглобулиновом локусе в зародышевой линии мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанный не-иммуноглобулиновый локус представляет собой транскрипционно активный локус. Согласно конкретному варианту реализации указанный транскрипционно активный локус представляет собой локус ROSA26. Согласно одному из вариантов реализации указанная эктопическая последовательность нуклеотидов случайным образом встроена в зародышевую линию мыши.

[00018] Согласно одному из аспектов предложена мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6, при этом указанная мышь содержит эктопическую последовательность нуклеотидов, которая восполняет утрату функции ADAM6 мыши. Согласно одному из вариантов реализации эктопическая последовательность нуклеотидов придает указанной мыши способность производить потомство, сопоставимую с соответствующей способностью мыши дикого типа, у которой присутствует функциональный эндогенный ген ADAM6. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность придает мыши способность к образованию комплекса ADAM2 и/или ADAM3 и/или ADAM6 на поверхности спермия мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность придает сперме указанной мыши способность перемещаться из матки мыши через маточные трубы мыши к яйцеклетке мыши для оплодотворения указанной яйцеклетки.

[00019] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, производит по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, или 90% от числа пометов мыши дикого типа того же возраста и линии за период времени, равный шести месяцам.

[00020] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, производит больше потомства по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз или приблизительно в 10 раз, либо более, при размножении на протяжении равного шести месяцам периода времени, чем мышь того же возраста и той же или сходной линии, у которой отсутствуют функциональный эндогенный ген ADAM6 и указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, при размножении на протяжении такого же по существу периода времени и в таких же по существу условиях.

[00021] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, производит в среднем по меньшей мере приблизительно в 2 раза, в 3 раза или в 4 раза больше детенышей на помет на протяжении периода размножения, равного 4 или 6 месяцам, по сравнению с мышью, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и указанная эктопическая нуклеотидная последовательность, размножающейся на протяжении такого же периода времени.

[00022] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, представляет собой самца мыши, и указанный самец мыши продуцирует сперму, которая при извлечении из маточных труб приблизительно через 5-6 часов после копуляции проявляет способность к передвижению по маточным трубам по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 30 раз, по меньшей мере в 40 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 60 раз, по меньшей мере в 70 раз, по меньшей мере в 80 раз, по меньшей мере в 90 раз, в 100 раз, в 110 раз или в 120 раз, либо более, большую, чем у мыши, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и указанная эктопическая нуклеотидная последовательность.

[00023] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует эктопическая последовательность нуклеотидов, при копуляции с самкой мыши производит сперму, способную пересечь матку, проникнуть в маточные трубы и переместиться по маточным трубам не более чем приблизительно за 6 часов с эффективностью, приблизительно равной эффективности спермы мыши дикого типа.

[00024] Согласно одному из вариантов реализации мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный ген ADAM6 и присутствует указанная эктопическая последовательность нуклеотидов, производит потомство чаще приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, или приблизительно в 4 раза, либо более, на протяжении сопоставимого периода времени по сравнению с мышью, у которой отсутствует функциональный ген ADAM6 и указанная эктопическая нуклеотидная последовательность.

[00025] Согласно одному из аспектов предложена мышь, содержащая в зародышевой линии не происходящую от мыши последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок-иммуноглобулин, при этом указанная последовательность не происходящего от мыши иммуноглобулина содержит вставку гена ADAM6 мыши, либо его гомолога, ортолога или функционального фрагмента. Согласно одному из вариантов реализации указанная не происходящего от мыши иммуноглобулина содержит последовательность иммуноглобулина человека. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность содержит последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность содержит последовательность легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность содержит один или более генных сегментов V, один или более генных сегментов D и один или более генных сегментов J; согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность содержит один или более генных сегментов V и один или более генных сегментов J. Согласно одному из вариантов реализации указанный один или более генных сегментов V, D и J, или один или более генных сегментов V и J, нереаранжирован(ы). Согласно одному из вариантов реализации указанный один или более генных сегментов V, D и J, или один или более генных сегментов V и J, реаранжирован(ы). Согласно одному из вариантов реализации после реаранжировки указанного одного или более генных сегментов V, D и J, или одного или более генных сегментоы V и J, в геноме указанной мыши содержится по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ген ADAM6 мыши, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному из вариантов реализации после реаранжировки геном указанной мыши содержит по меньшей мере две последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ген ADAM6 мыши, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному из вариантов реализации после реаранжировки геном указанной мыши содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую ген ADAM6 мыши, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент. Согласно одному из вариантов реализации указанная мышь содержит ген ADAM6, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент, в B-клетке. Согласно одному из вариантов реализации у мыши присутствует ген ADAM6, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент в клетке, не являющейся В-клеткой.

[00026] Согласно одному из аспектов предложены мыши, экспрессирующие вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент из эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, при этом у указанных мышей присутствует активность ADAM6, функционального у мышей-самцов.

[00027] Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей-самцов присутствует один немодифицированный эндогенный аллель ADAM6 или его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент, в эндогенном локусе ADAM6.

[00028] Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей-самцов присутствует эктопическая последовательность ADAM6 мыши, либо ее гомолог, ортолог или функциональный фрагмент, кодирующая(ий) белок, обеспечивающий функцию ADAM6.

[00029] Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей-самцов присутствует последовательность ADAM6, либо ее гомолог, ортолог или функциональный фрагмент, расположение которой в геноме мыши приблизительно соответствует положению эндогенного аллеля ADAM6 мыши, например, в 3′ направлении от последний последовательности генного сегмента V и в 5′ направлении от первого генного сегмента D.

[00030] Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей-самцов присутствует последовательность ADAM6, либо ее гомолог, ортолог или функциональный фрагмент, фланкированная(ый) с 5′-стороны, 3′-стороны, либо с 5′- и 3′-стороны (относительно направления транскрипции указанной последовательности ADAM6) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей генный сегмент вариабельной области иммуноглобулина. Согласно конкретному варианту реализации указанный вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека. Согласно одному из вариантов реализации указанный вариабельный генный сегмент иммуноглобулина представляет собой генный сегмент человека, а указанная последовательность, кодирующая ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или фрагмент, функциональный у мыши, расположена между генными сегментами V человека; согласно одному из вариантов реализации указанная мышь содержит два или более генных сегментов V человека, и указанная последовательность находится в положении между последним генным сегментом V и предпоследним генным сегментом V; согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность расположена после последнего генного сегмента V и первого генного сегмента D.

[00031] Согласно одному из аспектов предложен самец мыши, в зародышевой линии у которого присутствует нефункциональный эндогенный ген ADAM6 или делеция эндогенного гена ADAM6, при этом спермии указанной мыши способны проходить по маточным трубам самки мыши и оплодотворять яйцеклетку. Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей присутствует экстрахромосомная копия гена ADAM6 мыши, либо его ортолога, гомолога или функционального фрагмента, функционального у мышей-самцов. Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей присутствует эктопический ген ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент, функциональный у мышей-самцов.

[00032] Согласно одному из аспектов предложены мыши, у которых присутствует генетическая модификация, снижающая функцию эндогенного ADAM6 мыши, при этом у указанных мышей присутствует по меньшей мере отчасти функционал ADAM6, что обеспечивается либо эндогенным немодифицированным аллелем, функциональным полностью или частично (например, у гетерозигот), либо экспрессией из эктопической последовательности, кодирующей ADAM6 либо его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент, функциональный у мышей-самцов.

[00033] Согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей присутствует функция ADAM6, достаточная для придания мышам-самцам способности производить потомство посредством спаривания, по сравнению с мышами-самцами, у которых отсутствует функциональный ADAM6. Согласно одному из вариантов реализации функция ADAM6 обеспечивается присутствием эктопической последовательности нуклеотидов, кодирующей ADAM6 мыши, либо его гомолог, ортолог или функциональный фрагмент. Гомологи или ортологи ADAM6, или фрагменты, функциональные у мышей-самцов, включают компенсирующие, полностью или частично, утрату способности производить потомство, наблюдаемую у мышей-самцов, у которых отсутствует достаточная активность эндогенного мышиного ADAM6, например, утрату способности, наблюдаемую у нокаутных по ADAM6 мышей. В этом смысле ADAM6-нокаутные мыши включают мышей, у которых присутствует эндогенный локус или его фрагмент, но не функциональный, т.е. либо совершенно не экспрессирущий ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b), либо экспрессирущий ADAM6 (ADAM6a и/или ADAM6b) на уровне, недостаточном для поддержания по существу нормальной способности самцов мыши дикого типа производить потомство. Утрата функции может происходить, например, из-за модификации структурного гена указанного локуса {т.е. кодирующей области ADAM6a или ADAM6b), или в регуляторной области локуса (например, в последовательности, расположенной в направлении 5′ от гена ADAM6a, или в направлении 3′ от кодирующей области ADAM6a или ADAM6b, при этом указанная последовательность контролирует, полностью или частично, транскрипцию гена ADAM6, экспрессию РНК ADAM6 или экспрессию белка ADAM6). Согласно различным вариантам реализации ортологи, гомологи или их фрагменты, функциональные у мышей-самцов, представляют собой такие ортологи, гомологи или их фрагменты, которые обеспечивают способность спермы мышей-самцов (или большинству спермиев в эякуляте мышей-самцов) проходить через маточные трубы мыши и оплодотворять яйцеклетку мыши.

[00034] Согласно одному из вариантов реализации у мышей-самцов, экспрессирующих вариабельную область иммуноглобулина человека или ее функциональный фрагмент, присутствует достаточная активность ADAM6 для обеспечения способности указанных мышей-самцов производить потомство посредством спаривания с мышами-самками, и, согласно одному из вариантов реализации у указанных мышей-самцов наблюдается способность производить потомство при спаривании с мышами-самками, составляющая согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 25%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 30%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 40%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 50%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 60%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 70%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 80%, согласно одному из вариантов реализации по меньшей мере 90% от такой способности, а согласно одному из вариантов реализации приблизительно равная такой способности мышей с одним или двумя эндогенными немодифицированными аллелями ADAM6.

[00035] Согласно одному из вариантов реализации мыши-самцы экспрессируют достаточно ADAM6 (или его ортолога, гомолога или функционального фрагмента), чтобы обеспечить способность спермия указанных мышей-самцов проходить через маточные трубы самки мыши и оплодотворять яйцеклетку мыши.

[00036] Согласно одному из вариантов реализации функционал ADAM6 обеспечивается последовательностью нуклеиновой кислоты, смежной с хромосомной последовательностью мыши (например, указанную нуклеиновую кислоту случайным образом встраивают в хромосому мыши; или вводят в конкретный участок, например, направленным встраиванием указанной нуклеиновой кислоты в конкретный участок, например, опосредованным сайт-специфической рекомбиназой (например, опосредованным Cre) встраиванием или с помощью гомологичной рекомбинации). Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность ADAM6 находится на нуклеиновой кислоте, расположенной вне хромосомы мыши (например, указанная последовательность ADAM6 расположена на эписоме, т.е. экстрахромосомно, например, в экспрессионной конструкции, в векторе, на искусственной дрожжевой хромосоме (YAC), в трансхромосоме и т.п.).

[00037] Согласно одному из аспектов предложены генетически модифицированные мыши и клетки, содержащие модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом у указанных мышей экспрессируется по меньшей мере часть последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина, например, по меньшей мере часть последовательности человека, при этом у указанных мышей присутствует активность ADAM6, функционального у мышей-самцов. Согласно одному из вариантов реализации указанная модификация уменьшает или элиминирует активность ADAM6 мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная мышь модифицирована таким образом, что оба аллеля, кодирующие активный ADAM6, отсутствуют либо экспрессируют ADAM6 с недостаточной для поддержания нормального спаривания у мышей-самцов функциональностью. Согласно одному из вариантов реализации у указанной мыши также присутствует эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6 мыши, либо его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент.

[00038] Согласно одному из аспектов предложены генетически модифицированные мыши и клетки, содержащие модификацию эндогенного локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, при этом указанная модификация уменьшает или элиминирует активность ADAM6, экспрессируемого из последовательности ADAM6 указанного локуса, и при этом у указанных мышей присутствует белок ADAM6, либо его ортолог, гомолог или функциональный фрагмент. Согласно различным вариантам реализации указанный белок ADAM6 или его фрагмент кодируется эктопической последовательностью ADAM6. Согласно различным вариантам реализации указанный белок ADAM6 или его фрагмент экспрессируется из эндогенного аллеля ADAM6. Согласно различным вариантам реализации указанная мышь содержит первый аллель тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий первую модификацию, которая уменьшает или элиминирует экспрессию функционального ADAM6 из первого аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина; также указанная мышь содержит второй аллель тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит вторую модификацию, существенно не снижающую или не подавляющую полностью экспрессию функционального ADAM6 из второго аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина.

[00039] Согласно одному из вариантов реализации вторая модификация расположена в направлении 3′ (относительно направленности транскрипции генного сегмента V мыши) от последнего генного сегмента V мыши и в направлении 5′ (относительно направленности транскрипции последовательности константной области) от гена константной области тяжелой цепи иммуноглобулина мыши (или гибридного гена человека/мыши) или его фрагмента (например, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей: C_H1, и/или шарнир, и/или C_H2, и/или C_H3 человека и/или мыши).

[00040] Согласно одному из вариантов реализации указанная модификация присутствует в первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина в первом локусе, кодирующем первый аллель ADAM6, а функция ADAM6 обусловлена экспрессией эндогенного ADAM6 из второго аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина во втором локусе, кодирующем функциональный ADAM6, причем указанный второй аллель тяжелой цепи иммуноглобулина содержит по меньшей мере одну модификацию генного сегмента V, D и/или J. Согласно конкретному варианту реализации указанная по меньшей мере одна модификация генного сегмента V, D, и/или J представляет собой удаление, замену на генный сегмент V, D и/или J человека, замену на генный сегмент V, D и/или J верблюдовых, замену на гуманизированный или «камелизированный» генный сегмент V, D и/или J, замену последовательности тяжелой цепи на последовательность легкой цепи, и их комбинации. Согласно одному из вариантов реализации указанная по меньшей мере одна модификация представляет собой удаление одного или более генных сегментов V, D и/или J тяжелой цепи и замене одной или более генных сегментов V и/или J легкой цепи (например, генного сегмента V и/или J легкой цепи человека) в указанном локусе тяжелой цепи.

[00041] Согласно одному из вариантов реализации указанная модификация присутствует в первом аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина в первом локусе, и втором аллеле тяжелой цепи иммуноглобулина во втором локусе, и функция ADAM6 обусловлена экспрессией эктопического ADAM6 в не-иммуноглобулиновом локусе в зародышевой линии мыши. Согласно конкретному варианту реализации указанный не-иммуноглобулиновый локус представляет собой локус ROSA26. Согласно конкретному варианту реализации указанный не-иммуноглобулиновый локус транскрипционно активен в репродуктивной ткани.

[00042] Согласно одному из аспектов предложена мышь, гетерозиготная или гомозиготная по нокауту ADAM6. Согласно одному из вариантов реализации у указанной мыши также присутствует модифицированная последовательность иммуноглобулина, представляющая собой последовательность иммуноглобулина человека, или последовательность гуманизированного иммуноглобулина, или последовательность иммуноглобулина верблюдовых, или последовательность «камелизированного» иммуноглобулина человека, или последовательность иммуноглобулина мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная модифицированная последовательность иммуноглобулина находится в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная модифицированная последовательность иммуноглобулина включает последовательность вариабельных генов тяжелой цепи человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность вариабельных генов тяжелой цепи человека замещает эндогенную последовательность вариабельных генов тяжелой цепи мыши в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

[00043] Согласно одному из аспектов предложена мышь, неспособная к осуществлению экспрессии функционального эндогенного ADAM6 мыши из эндогенного локуса ADAM6 мыши. Согласно одному из вариантов реализации у мыши присутствует эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ADAM6, или его функциональный фрагмент, функциональный у указанной мыши. Согласно конкретному варианту реализации указанная эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует белок, восстанавливающий утраченную способность производить потомство, наблюдаемую у самца мыши, гомозиготного по нокауту ADAM6. Согласно конкретному варианту реализации указанная эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует мышиный белок ADAM6.

[00044] Согласно одному из аспектов предложена мышь, у которой отсутствует функциональный эндогенный локус ADAM6, и у которой присутствует эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, обеспечивающая функцию ADAM6 мыши. Согласно одному из вариантов реализации указанная последовательность нуклеиновой кислоты содержит эндогенную последовательность ADAM6 мыши или его функциональный фрагмент. Согласно одному из вариантов реализации указанная эндогенная последовательность ADAM6 мыши содержит ADAM6a- и ADAM6b-кодирующую последовательность, расположенную у мыши дикого типа между крайним с 3′-стороны генным сегментом V тяжелой цепи (V_H) иммуноглобулина мыши и крайним с 5′-стороны генным сегментом D тяжелой цепи (D_H) иммуноглобулина мыши.

[00045] Согласно одном