Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи

Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, косметологии, геронтологии и может быть использовано в молекулярной фармакологии и фармацевтической промышленности, для целей клеточной терапии, а также в научных исследованиях.

Известно, что при биологическом старении, наряду с уменьшением количества фибробластов в коже, последние характеризуются снижением пролиферативной активности и восприимчивости (реакционноспособности) к факторам роста [Campisi J. Molecular mechanisms of intrinsic aging // Ann. Dermatol. Venerol. - 2002. - Vol. 129. - P. 1100.]. В результате снижается синтез фибробластами белков коллагена и эластина, а также компонентов аморфного вещества соединительной ткани дермы, и в то же время интенсивность синтеза металлопротеиназ, разрушающих коллаген и эластин, возрастает [Jenkins G. Molecular mechanisms of skin ageing. // Mech. Ageing. Dev. 2002 Apr; 123(7): 801-10; Sardy M. Role of matrix metalloproteinases in skin ageing. // Connect Tissue Res. 2009; 50(2): 132-8].

Известно также, что в фибробластах кожи по мере старения изменяется соотношение коллагенов различных типов, при этом синтез упорядоченных коллагенов и в первую очередь I-II типов, формирующих рубцовую ткань, остается практически неизменным [http://global.britannica.com/EBchecked/topic/9171/aging; Смирнова Г.О., Мантурова Н.Е., Топчиева Г.В., Ступин В.А. Прогнозирование результатов эстетических вмешательств по механизмам старения кожи и соотношению коллагена I/III типов // Фундаментальные исследования. - 2012. - №7 (часть 1). - С.190-194]. Преобладание таких коллагенов, образующих грубые тяжи в стареющей коже, наряду с дефицитом минорных коллагенов, определяет развитие косметологических дефектов.

При этом именно минорный коллаген XI типа (кодируемый генами COL11A1, COL11A2), будучи распространенным в мягких тканях, ответственен за формирование прочной сетчатой фибриллярной структуры, препятствующей возрастному гравитационному птозу кожи и деформации надлежащих тканей [http://ghr.nlm.nih.gov/gene/COL11A1, http://ghr.nlm.nih.gov/gene/COL11A2; Bernard M., Yoshioka H., Rodriguez E., et al (Dec 1988). Cloning and sequencing of pro-alpha 1 (XI) collagen cDNA demonstrates that type XI belongs to the fibrillar class of collagens and reveals that the expression of the gene is not restricted to cartilagenous tissue. // J. Biol. Chem. 263 (32): 17159-66].

Означенное обуславливает низкую эффективность клеточной терапии возрастных изменений кожи у лиц старших и средних возрастных групп, с одной стороны, вследствие использования аутологичных клеток с количественным снижением их восстановительной активности, а с другой - возрастным качественным изменением соотношения синтезируемых макромолекулярных структур [Minaker K.L., Common clinical sequelae of aging. In: Goldman L., Schafer A.I., eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011: chap 24].

Принципиально важно, что третичная структура коллагена состоит из трех полипептидных молекул (трипептид), упакованных в микрофибриллы за счет образования водородных и ковалентных связей. Объединения микрофибрилл создают коллагеновые тяжи.

Упорядоченность сформированных параллельно друг другу тяжей определяет высокую прочность коллагеновой структуры «на разрыв», что наблюдается в рубцовой ткани, в которой преобладают упорядоченные коллагены (в основном тип I и II) [Tang S.J., Hu S.L., Pang S.F. Content changes of type/collagen in tissues of hypertrophic scar and keloid its clinical significance. // J. Clin. Res. 2004, 21: 366-368]. Такие структуры устойчивы к действию металлопротеиназ, характеризуются медленной обновляемостью и образуют грубые неровности кожи, выступающие над ее поверхностью, которые поддаются коррекции исключительно хирургическими методами.

В отличие от структур, образованных упорядоченными коллагенами, включение в фибриллы минорных коллагенов с низкой упорядоченностью микрофибрилл формирует ровную пластичную сеть.

Наличие в фибрилле неупорядоченных коллагенов создает условия для «вплетания» микрофибрилл одной фибриллы в соседние фибриллы.

В результате образуется достаточно прочная сетчатая структура [Eyre D., Wu J-J. Type XI or 1α2α3α collagen. / In Burgeson R, Mayne R Structure and Function of Collagen Types. // Orlando, Academic Press, 1987, 261-281; Keene D.R., Oxford J.T., Morris N.P. Ultrastructural localization of collagen types II, IX, and XI in the growth plate of human rib and fetal bovine epiphyseal cartilage: type XI collagen is restricted to thin fibrils. // J. Histochem. Cytochem. 1995, 43: 967-979; Li Y., Lacerda D.A., Warman M.L., et al (1995) A fibrillar collagen gene, Col11al, is essential for skeletal morphogenesis. // Cell, 1995, 80: 423-430].

Примером таких структур, которые образуются при посредстве преобладающего коллагена XI типа, объединяющих фибриллы коллагенов в сеть, являются фасции лица, передней брюшной стенки и ягодиц [Rinn J.L., Chanda Bondre, Hayes B Gladstone, Patrick O Brown, and Howard Y. Chang. Anatomic Demarcation by Positional Variation in Fibroblast Gene Expression Programs // PLoS Genet. - 2006 July. - vol. 2(7). - 119-124].

В свою очередь, целенаправленное изменение соотношения синтезируемых трансплантируемыми клетками коллагенов способно обеспечить лучший косметологический эффект и предотвращать формирование неровностей кожи из упорядоченного коллагена в местах введения аутологичного клеточного материала.

Известны научные публикации, в которых описаны методы стимуляции синтеза коллагенов путем применения цитокинов, гормонов, витаминов, механической и электромагнитной стимуляции клеток, продуктов деградации коллагенов и олигопептидов [Klatte-Schulz F., Pauly. S, Scheibel М., et al. Characteristics and stimulation potential with BMP-2 and BMP-7 of tenocyte-like cells isolated from the rotator cuff of female donors. // PLoS One. 2013 Jun 25; 8(6):e67209. doi: 10.1371/journal.pone.0067209; Dogru A.G., Tunik S., Akpolat V., et al. The effects of pulsed and sinusoidal electromagnetic fields on E-cadherin and type IV collagen in gingiva: a histopathological and immunohistochemical study. // Adv. Clin. Exp. Med. 2013 Mar-Apr; 22(2): 245-52] или отбора синтезирующих коллаген I типа клеток в ходе культивирования [Зорин В.Л., Зорина А.И., Терехов С.М. и др. Патент РФ №2281776]. Однако все эти методы сопровождаются либо повышением синтеза упорядоченных коллагенов, что неприемлемо для косметологии, или оставляют соотношение синтезирующихся в фибробластах коллагенов неизменным.

Известны также патенты RU 2289417 C1, WO 2006045963 A3, US 5660850 A, US 6524233 B2, описывающие различные способы антивозрастной терапии кожи. Наиболее близким аналогом является способ по патенту US 20100297088 «Methods for Culturing Minimally-Passaged Fibroblasts and Uses Thereof)), предусматривающий выделение и культивирование аутологичных фибробластов с последующим их применением для коррекции возрастных изменений кожи. Однако данный способ отличается невысокой эффективностью (57-59% по оценке косметологов и 67% при самооценке пациентов) (http://www.fda.gov/downloads/AdvisoryCommittees/CommitteesMeetingMaterials/BloodVaccinesandOtherBiologics/CellularTissueandGeneTherapiesAdvisoryCommittee/UCM185519.pdf]. Последнее обусловлено тем, что в основу способа положено использование аутологичных клеток, стимулированных добавлением в культуру 10% фетальной бычьей сыворотки по стандартному протоколу, то есть клеток того же возраста, что и сам пациент и, следовательно, характеризующихся сниженным восстановительным потенциалом в отношении компонентов стареющей кожи при отсутствии селективной стимуляции синтеза отдельных типов коллагенов.

Задачей изобретения является ускорение и увеличение эффективности коррекции возрастных изменений кожи при использовании аутологичных фибробластов с неизменной последовательностью известных этапов подготовки клеток и при минимальных изменениях в процессе их культивирования, то есть в отсутствие больших дополнительных затрат и при минимальной травматичности.

Задача решается последовательно и поэтапно тем, что в культивируемых клетках, предназначенных для терапии, стимулируют синтез формообразующего неупорядоченного минорного коллагена XI типа путем избирательного усиления экспрессии генов COLL11, причем для избирательного усиления экспрессии генов COLL11, в культуральную среду клеток дополнительно вносят интерлейкин 6, фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 и ингибитор циклооксигеназы 2 - индометацин, при этом дополнительно вносят интерлейкин 6 в концентрации 1 нг/мл среды (Sigma), фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 в концентрации 6 нг/мл среды (Sigma) и ингибитор циклооксигеназы 2 - индометацин в концентрации 1,33 мкг/мл (Sigma), а для культивирования фибробластов используют клетки, выделенные из участка кожи, взятого у пациента из области ягодицы с площадью иссечения до 10 мм² на всю глубину кожи, при этом количество однократно вводимых пациенту клеток варьирует от 10×10⁶ до 30×10⁶, при разовом объеме вводимого препарата - 1-3 мл, а клетки вводят пациентам методом «папулы» для крупных морщин, обкалывания мелких морщин или равномерно на площадь проблемной зоны с помощью микроинъекций, причем курс введений повторяют 2-4 раза с 7-10-дневными перерывами.

Способ осуществляют следующим образом.

Для исследований или лечения независимо от стадии возрастных изменений кожи у пациента первоначально производят забор тканевого материала с ягодичной области.

Образцы (эксплантаты) кожи отбирают при отсутствии противопоказаний под местной анестезией. Участок площадью до 10 мм² иссекают на всю глубину кожи. Закрытие раны производят пластырем (Unomedical, Дания), позволяющим обеспечить плотное смыкание краев раны и не препятствующим заживлению, или наложением косметического шва. Эксплантаты помещают в солевой буферный раствор PBS (MP Biomedicals, США), содержащий двухкратные культуральные концентрации пенициллина, стрептомицина, тилозина (все Sigma, Германия) и амфотерицина B (MP Biomedicals, США) и сохраняют при 4°C не более 24 часов. Одновременно с взятием эксплантата забирают 9-10 мл венозной крови с целью получения плазмы для использования при культивировании, криоконсервации и диагностических исследований.

Культуральные среды для обработки эксплантатов готовят из концентратов на стерильной воде с высокой степенью очистки класса MQ (удельное сопротивление не менее 20 МОм). Среда для культивирования фибробластов включает: среды D-MEM (Sigma) - 60%, Ham′s F-10 (MP Biomedicals) - 30% и фетальную бычью сыворотку степени очистки defined (HyClone, США) - 10%. Полученную смесь титруют до pH 7.3 при 5% CO₂ и фильтруют через стерилизующий ацетат-целлюлозный фильтр (диаметр пор - 0.2 мкм; Sarstedt, Германия). На начальном этапе культивирования в среду добавляют антибиотики в концентрациях: пенициллин - 100 ЕД/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, тилозин - 10 мкг/мл, амфотерицин-B - 2.5 мкг/мл (Sigma, MP Biomedicals, все антибиотики относятся к категории «для клеточных культур»).

Культивирование фибробластов проводят в инкубаторе Sanyo (Япония) при 37°C, 5% CO₂ и 95% влажности. Культуральную среду меняют 1 раз в 3 дня. Ежедневно производят микроскопический контроль за состоянием культуры с использованием темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. После подсчета взвесь клеток заливают на вентилируемые культуральные матрасы (Sarstedt, Германия) из расчета: 3×10³/см² культуральной поверхности/100 мкл среды и помещают в CO₂-инкубатор. Дальнейшее культивирование проводят при тех же условиях (смена среды, визуальный контроль) с пассажами известного количества клеток на матрасы, имеющие большую площадь.

Культуру фибробластов выращивают до получения требуемой клеточной массы. По завершении культивирования клетки трипсинизируют, отмывают и используют для исследования, введения испытуемым или криоконсервации.

Клеточные культуры консервируют по протоколу [Farrant J. General observations on cell preservation. In: M.J. Ashwood-Smith and J. Farrant, Eds. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology. - Pitman Medical Limited. - Kent, England. - 1980. - P. 1-18] в аутологичной плазме крови, взятой у пациента, содержащей 10% (по объему) стерильного диметилсульфоксида - ДМСО (MP Biomedicals). Хранение гомогенной взвеси клеток в консервирующем растворе осуществляют в стерильных криопробирках в морозильнике (Sanyo, Япония) при температуре -70°C (в первые 24 часа) с последующим перемещением в жидкий азот. Методика обеспечивает длительную сохранность свойств клеток и возможность их клинического использования.

Для разморозки извлеченную из жидкого азота пробирку помещают на водяную баню при 37°C. После исчезновения кристаллов льда клетки многократно отмывают от консерванта центрифугированием.

Для обоснования способа было проведено исследование по определению области взятия эксплантата кожи. Исследовались параметры 30 суточных культур фибробластов (5-6 пассаж), полученных из кожных эксплантатов, взятых с кисти, предплечья, плеча, заушной складки, передней брюшной стенки, спины, ягодичной области, внутренней поверхности бедра и голени. В опытах кожные эксплантаты были получены от 75 различных доноров, возраст которых 44-61 год, во время плановых оперативных вмешательств, предполагающих иссечение участка кожи. В качестве контроля использовали клетки 5 различных доноров в возрасте 23-26 лет, взятые с внутренней поверхности бедра.

Специфическую функцию фибробластов для терапии возрастных изменений кожи оценивали по включению в макромолекулы меченых селективных предшественников синтеза ДНК (2¹⁴C-тимидин), коллагена (L-U¹⁴C-пролин) и кислых ГАГов (D-6³H-глюкозамин гидрохлорид) (все радиофармпрепараты Amersham Pharmacia Biotech). Радионуклиды с активностью 37 кБк/мл среды вносили на 75 см² матрасы одновременно с 0.5×10⁶ фибробластов из вторичной 30-суточной культуры. Эксперименты прерывали через трое суток культивирования, фибробласты снимали с флаконов раствором трипсина-версена по стандартной методике и подсчитывали на гематологическом анализаторе. Подсчет радиоактивности производили в спирто-толуоловом сцинтилляторе на жидкостном сцинтилляционном счетчике Бета-2 (эффективность счета по углероду - 98%, по тритию - 56%). Результаты выражали в беккерелях на 10⁶ клеток.

Для оценки синтетической активности по включению 2¹⁴C-тимидина в ДНК клетки отмывали от свободной радиоактивности переосаждением в изотоническом растворе и трехкратно - этанолом. Гидролиз ДНК проводили 5% раствором муравьиной кислоты при нагревании с последующим упариванием и перерастворением в этаноле для подсчета радиоактивности.

С целью изучения синтеза коллагена, после удаления фибробластов 0.25% раствором трипсина, не повреждающим коллагеновые волокна, матрасы многократно отмывали от невключившегося меченого L-пролина. Адгезированные на пластике волокна двухкратно обезвоживали пропанолом, а пролин и оксипролин экстрагировали с культуральной поверхности кислым этанолом при нагревании. Полученные экстракты упаривали и перед радиометрией перерастворяли в этаноле.

Применение глюкозамина, содержащего тритий в шестом положении, позволяет оценить синтез в культуре гидрофильных высокомолекулярных ГАГов (ГК и хондроитин сульфат) и пренебречь возможностью его окисления (при окислении N-6³H удаляется с образованием ³H₂O). После подсчета клеток культуру инкубировали в 5% растворе трипсина при 37°C для отделения связанных с ГАГами белков. Из экстракта высокополимерные ГАГи выделяли трехкратным переосаждением смесью этанол-эфир. Препарат ГАГов перерастворяли в воде и радиометрировали в гетерогенной системе с введением в сцинтилляционную жидкость детергента тритон X-100.

Для изучения длины теломерных концов клетки снимали с культуральных флаконов, определялось их количество. Клетки лизировали и после отжига цепей к полученному раствору добавляли ДНК-зонды (CCCTAA)₃, радиоктивно-меченые по цитидину (³Н дезоксицитидин, Amersham Pharmacia Biotech). После того как зонды взаимодействовали с комплементарными участками ДНК (теломерные концы), хромосомы отмывали от излишков зондов, осаждали на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore) и производили подсчет радиоактивности.

Активность металлопротеиназы 1 изучали с использованием коммерческих наборов MMP Elisa Kit (Cusabio) согласно протоколу изготовителя.

Культуры фибробластов, полученные из эксплантантов с различных участков тела, обладают следующими характеристиками (Таблицы 1-4).

Фибробласты, эксплантированные с закрытых участков тела (такие как передняя брюшная стенка, ягодичная область), интенсивнее включают 2¹⁴C-тимидин в ДНК, чем фибробласты эксплантатов с открытых участков. Например, интенсивность включения 2¹⁴C-тимидина в ДНК фибробластов эксплантата кожи ягодичной области на 42% выше, чем аналогичный показатель клеток эксплантата с заушной складки.

Фибробласты кожи с закрытых участков тела не отличаются по интенсивности синтеза ДНК от аналогичных клеток молодых испытуемых.

Согласно данным ряда литературных источников наибольший пролиферативный потенциал имеют клетки, хромосомы которых отличаются большей длиной теломер.

Результаты проведенных нами исследований длины теломер, о которой мы судили по радиоактивности комплекса теломера + комплементарный радиоактивно-меченый зонд, продемонстрировали, что наибольшее количество радиоактивно-меченого зонда включали фибробласты культур 23-26 летних испытуемых и фибробласты культур эксплантатов с ягодичной области и передней брюшной стенки тела испытуемых в возрасте от 44 до 61 года.

Таким образом, наибольшей перспективностью в отношении заместительной терапии имеют фибробласты из эксплантатов с закрытых участков тела.

Следующим, требующим выяснения вопросом, является вопрос о компетентности культивируемых клеток в отношении синтеза коллагена и гиалуроновых кислот, достаточность которого во многом определяет эффективность ретрансплантации.

Фибробласты культур эксплантатов с закрытых участков кожи обладают большей способностью к синтезу основного вещества соединительной ткани (белков и ГАГов), чем клетки с открытых участков. Так, включение L-U¹⁴C-пролина в коллаген, синтезируемый клетками культур с ягодичной области, с передней брюшной стенки, а также с плеча было выше соответствующих показателей фибробластов с других участков в среднем на 64%, а включение D-6³H-глюкозамина в ГАГи - на 43%.

Темпы разрушения соединительной ткани также во многом определяются фибробластами путем синтеза последними металлопротеиназ, наиболее активной из которых является металлопротеиназа 1 - коллагеназа.

Исследования концентрации этой металлопротеиназы в изучаемых культурах фибробластов позволили заключить, что ее количество минимально в культурах клеток из эксплантатов с ягодичной области и передней брюшной стенки (Таблица 4).

Отличия клеточной активности в опытной группе в отношении синтеза ДНК, макромолекул основного вещества соединительной ткани, а также длины теломер клеток из эксплантатов с ягодичной области и передней брюшной стенки от соответствующих показателей испытуемых в возрасте 23-26 лет (контроль) составляют менее 20%, что может быть объяснено естественными колебаниями данных величин в пределах биологических норм. В целом, полученные результаты подтверждают гипотезу о зависимости скорости старения от активности внешних воздействий, постулируемую в литературе.

Таким образом, наиболее близкими по своим параметрам к показателям фибробластов, выделенных из кожи молодых доноров, были клетки, полученные из области ягодиц. Данная область отличается и наибольшей толщиной дермального слоя, что при равной площади эксплантации (10 мм²) дает возможность получить больше клеток фибробластического дифферона, чем с других участков. Это позволяет ускорить процесс получения необходимой клеточной массы. Наряду с этим некоторый косметологический дефект ягодичной области, обусловленный эксплантацией, с эстетической точки зрения менее заметен, чем, например, передней брюшной стенки. Все перечисленное определило и обосновало использование клеток из эксплантата с ягодичной области в предложенном способе.

Следует отметить также и то, что фибробласты с ягодичной области в большей степени, чем клетки с других участков кожи, экспрессируют гены Cj11. Синтезируемый коллаген данного типа играет роль своеобразного пептидного скелета дермы и определяет механическую прочность и упругость данной области тела [Chang H.Y., et al. Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002 Oct. - vol. 1.99.(20). - p. 12877-12882;. 2(7), что принципиально важно для обеспечения эффективности заместительной терапии возрастных изменений кожи с использованием клеток самого пациента.

После обоснования области взятия образцов кожи была отработана методика стимуляции синтеза коллагена XI в клеточной культуре.

Исследовались параметры 46 суточных культур фибробластов (7-8 пассаж), полученных из кожных эксплантатов, взятых с ягодичной области 21 донора, возрастом 39-65 лет. В культуральную среду клеток опытной группы с первого дня культивирования дополнительно вносили интерлейкин 6 (1 нг/мл среды, Sigma), фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 (6 нг/мл среды, Sigma) и ингибитор циклооксигеназы 2 - индометацин (1,33 мкг/мл, Sigma). В качестве контроля использовали клетки тех же доноров, культивированные в аналогичных условиях в отсутствие дополнительных факторов.

Степень экспрессии генов коллагена различных типов исследовали с использованием наборов TaqMan® Gene Expression Assays (Invitrogen). Полученные данные усредняли и выражали в процентах по отношению к данным контрольной группы.

Количество синтезируемых коллагенов различных типов определяли методом иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител к эпитопам коллагенов человека (BlueGene Biotech Co., Ltd). Вторичные антитела, конъюгированные с ALEXA FLUOR 350, получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури).

Цветные изображения иммунофлюоресценции были получены с использованием флюоресцентного микроскопа Zeiss Axiophot и затем оцифрованы с использованием программы Metamorph (West Chester) и пересчетом в проценты относительно уровня флюоресценции клеток, не обработанных стимуляторами синтеза коллагена XI [Morris P., Julia Т., Gillian В.М. et al. Developmentally Regulated Alternative Splicing of the al (XI) Collagen Chain: Spatial and Temporal Segregation of Isoforms in the Cartilage of Fetal Rat ong Bones. // J. Histochem. Cytochem. June 2000 vol. 48 no. 6725-741].

Полученные результаты представлены в Таблице 5, показывающей отличия экспрессии генов, кодирующих белковые цепи коллагенов различных типов в результате внесения в культуральную среду интерлейкина 6, фактора хемотаксиса моноцитов МСР-1 и индометацина в клетках опытной группы в процентах к величине экспрессии в культурах клеток тех же доноров, культивированных без дополнительных индукторов. В Таблице 6 показано изменение содержания белковых цепей коллагенов различных типов в результате внесения в культуральную среду интерлейкина 6, фактора хемотаксиса моноцитов МСР-1 и индометацина в клетках опытной группы в процентах к величине содержания белковых цепей в клетках тех же доноров, в культуры которых интерлейкин 6, фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 и индометацин не вносились.

Анализ экспрессии генов культивированных фибробластов продемонстрировал, что наличие в культуральной среде интерлейкина 6, фактора хемотаксиса моноцитов и индометацина не сопровождается сколько-нибудь значимым изменением экспрессии генов большинства коллагенов по сравнению с клетками тех же доноров, культивированных в отсутствие дополнительной комбинации факторов. При этом синтез коллагена XI типа в клетках опытной группы достоверно выше (Таблица 6).

Усиление экспрессии генов COLL11 на 43,2% сопровождается увеличенным синтезом коллагена данного типа на 48% в опытной группе по сравнению с контрольной, что было показано с использованием конъюгированных с красителем антител к различным типам коллагена.

После детальной отработки в лабораторных условиях методик забора эксплантата, подготовки к культивированию и наращиванию массы фибробластов были проведены клинические испытания предложенного способа.

Основные показатели и ограничивающие параметры заявляемого способа, такие как содержание дополнительных компонентов при культивировании фибробластов, хранение плазмы, полученной их крови пациента, количество культивированных клеток, вводимых в кожу пациента от 10×10⁶ до 30×10⁶, разовый объем вводимого препарата 1-3 мл - определены и обоснованы практическим путем в результате многочисленных лабораторных опытов с учетом теоретической проработки аналогов, прототипов и опыта предыдущих исследований и клинических испытаний.

Клинические испытания и исследования способа проводили в лаборатории молекулярных и клеточных технологий Уральской госмедакадемии с привлечением баз косметологических салонов и лечебно-профилактических учреждений г. Екатеринбурга. Работа выполнялась при одобрении Этического комитета и в соответствии с решением Ученого совета Уральской госмедакадемии, утвердившего программу научно-исследовательских работ и протоколы доклинических и клинических испытаний.

Исследование осуществлялось с учетом международных норм GLP и GCP. В испытаниях принимали участие 83 пациента в возрасте от 43 до 65 лет.

Выбор зон введения клеток для терапевтической коррекции кожи осуществлялся на основании субъективного определения наиболее проблемной области лица самим пациентом и мнения врача-косметолога.

Количество однократно вводимых клеток варьировало в зависимости от объема проблемной зоны и составляло в среднем от 10×10⁶ до 30×10⁶. Разовый объем вводимого препарата - 1-3 мл. Клетки вводили пациентам методом «папулы» для крупных морщин, обкалывания мелких морщин или равномерно на площадь проблемной зоны с помощью микроинъекций; введения повторялись 2-4 раза с 7-10-дневными перерывами.

Изменения кожи после трансплантации отслеживались в динамике на протяжении 3^х лет. Степень внешней косметологической коррекции оценивалась как специалистами, так и самими испытуемыми. Пациенты с периодичностью в 3 месяца заполняли специальную анкету, в которой отмечали динамику, побочные эффекты, их выраженность и продолжительность.

Испытуемые оценивали общую степень своей удовлетворенности косметологическим эффектом по 10-балльной шкале. За «0» принималась субъективная оценка состояния кожи до начала испытаний.

Оценивались шесть признаков: 1. Увеличение тургора и эластичности кожи; 2. Улучшение цвета кожи; 3 . Разглаживание мелких морщин; 4. Разглаживание крупных морщин; 5. Коррекция косметологических дефектов; 6. Утолщение кожи. Полная, с субъективной точки зрения пациента, ликвидация признаков старения кожи в зоне введения клеток оценивалась 10 баллами.

Экспертная оценка производилась по аналогичной шкале двумя специалистами с усреднением результатов на завершающем этапе испытания.

Все испытуемые после введения аутофибробластов со стимуляцией синтеза коллагена XI отмечали положительный косметологических эффект в проблемной области, заключавшийся в уменьшении выраженности крупных и мелких морщин, кожных дефектов, а также в общем улучшении состояния кожи лица в области трансплантации фибробластов.

В таблице 7 представлена динамика косметологической эффективности в баллах, а на Фиг. 1 представлен график усредненной динамики эффективности способа по 6 признакам (субъективной оценки самого пациента и косметологов) по каждому пациенту с определением абсолютного диапазона колебаний показателей по всем пациентам в течение 3-х лет (3-36 месяцев).

Наблюдалась стойкая динамика прогрессирования положительного косметологического эффекта с течением времени (Таблица 7, Фиг. 1).

Наибольшая его выраженность отмечена к 15-18 месяцам после терапии с последующим снижением в течение 3^х лет. Примечательно, что 43 пациента обратились повторно, а 26 - более 2 раз с целью косметологической коррекции других зон тела (кисти рук, зона декольте, передняя брюшная стенка, колени), что свидетельствует об эффективности и перспективности предложенного способа клеточной терапии возрастных изменений кожи и востребованности его у пациентов в косметологических салонах и клиниках.

Достигаемый неочевидный лечебный эффект способа заключается в коррекции возрастных изменений кожи в течение меньшего времени по сравнению с описанными аналогами при более длительном эффекте коррекции ткани в области самого косметологического дефекта, причем при использовании культуры со стимулированным синтезом коллагена XI типа, фибробласты более полно восстанавливают все слои дермы и надлежащую ткань.

Предложенный способ для осуществления не требует больших дополнительных затрат и нового дополнительного оборудования, не нарушает принятой технологии культивирования, повышая эффективность терапии.

1. Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи, предусматривающий применение культивированных аутологичных фибробластов кожи путем внутрикожного введения, отличающийся тем, что количество однократно вводимых пациенту клеток варьирует от 10×10⁶ до 30×10⁶, при этом разовый объем вводимого препарата - 1-3 мл, а клетки вводят пациентам методом «папулы» для крупных морщин, обкалывания мелких морщин или равномерно на площадь проблемной зоны с помощью микроинъекций, причем введение повторяют 2-4 раза с 7-10-дневными перерывами.

2. Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи по п. 1, отличающийся тем, что в культивируемых клетках, предназначенных для терапии, стимулируют синтез формообразующего неупорядоченного минорного коллагена XI типа путем избирательного усиления экспрессии гена COLL11, причем для избирательного усиления экспрессии гена COLL11 в культуральную среду при выращивании клеток дополнительно вносят интерлейкин 6, фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 и ингибитор циклооксигеназы 2 - индометацин.

3. Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно вносят интерлейкин 6 в концентрации 1 нг/мл среды (Sigma), фактор хемотаксиса моноцитов МСР-1 в концентрации 6 нг/мл среды (Sigma) и ингибитор циклооксигеназы 2 - индометацин в концентрации 1,33 мкг/мл (Sigma).

4. Способ клеточной терапии возрастных изменений кожи по п. 1, отличающийся тем, что для культивирования фибробластов используют клетки, выделенные из участка кожи, взятого у пациента из области ягодицы с площади иссечения до 10 мм² на всю глубину кожи.