Терапевтическое применение белка β2m

Терапевтическое применение белка β2m

Реферат

Настоящая патентная заявка касается области медицины, в частности области лечения аутоиммунных заболеваний.

Настоящее изобретение более конкретно относится к применению белка бета2-микроглобулина (β2m) в качестве активного ингредиента, в частности в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как, например, множественный склероз или болезнь Крона.

ВВЕДЕНИЕ

Белок β2m представляет собой белок, имеющий среднюю молекулярную массу, равную приблизительно 11,6 кДа, обычно образованный из 99 аминокислот, который входит в состав главного комплекса гистосовместимости (MHC-I или HLA-I) [Cunningham B.A. et al. The complete amino acid sequence of beta-2-microglobulin (1973) Biochemistry 12:4811-4821].

Следует напомнить о том, что комплекс гистосовместимости MHC-I играет центральную роль в распознавании "своего" и "не своего" иммунной системой. Эти комплексы присутствуют на поверхности большинства человеческих клеток, за исключением эритроцитов. На их поверхности они презентируют большое количество антигенов, на основании чего T-лимфоциты (CD8) способны отличать клетки индивидуума от клеток, чужеродных ему, больных или подверженных процессу опухолевой трансформации.

Комплексы MHC-I состоят из гликозилированной тяжелой цепи (HC), приблизительно в 44 кДа, и из легкой цепи, β2m, которая нековалентно связана с внеклеточным доменом тяжелой цепи. α-цепь MHC-I состоит из трех внеклеточных доменов (α1, α2 и α3) и из трансмембранного сегмента, как показано на фигуре 1A. β2m связан с последовательностью аминокислот, расположенной в области, в которой конец α1 домена и начало домена α3 в HC расположены в непосредственной близости [Gussov, D. et al. (1987), The human beta-2-microglobulin gene: primary structure and definition of transcriptional unit (1987) Journal of Immunology 139:3132-3138]. Гены, кодирующие молекулы MHC-I, были пронумерованы в порядке их открытия и классифицированы по группам (A, B и C) и комплексам (D, H и G).

Антиген-презентирующие клетки (APC) используют комплексы типа MHC-I в качестве презентаторов антигенов T-клеткам (CD8) иммунной системы. Антигены, представляемые MHC-I, обычно состоят из множества полипептидов, содержащих от 8 до 10 аминокислот, которые получаются благодаря расщеплению эндогенных белков протеасомой. Эти антигены занимают пептидные полости, присутствующие на поверхности субъединиц (HC и β2m) комплексов MHC-I во время их образования в эндоплазматическом ретикулуме. После загрузки антигенов MHC комплексы экспортируются на поверхность клетки. Затем обеспечивается фиксация комплекса MHC-I к плазматической мембране трансмембранным доменом тяжелой цепи, расположенным у домена α3.

Субъединица, образованная белком β2m, отличается от тяжелых цепей практически не изменяющейся последовательностью и тем, что его полипептидная цепь не гликозилирована.

Даже при том, что его физиологическая роль не полностью выяснена, было показано, что белок β2m играет доминирующую роль по отношению к другому белку, образующему комплексы MHC-I, с одной стороны при образовании комплекса MHC-I/антиген [Androlewicz MJ., et al. (1994) MHC class I/p2-microglobulin complexes associate with TAP transporters before peptide binding, Nature 368, 864-867], в котором белок β2m специфически связывается с белком TAP-1 [Corr et al. 1992. Endogenous peptides of a soluble major histocompatibility complex class I molecule H-2Lds: sequence motif, quantitative binding and molecular modeling of the complex, JEM, 176(6):1981-92], позволяя обеспечить поддержание конформации антигенсвязывающего участка [Ljunggren, H-G. (1990) Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346, 476-480], и, с другой стороны, когда комплекс MHC-I/антиген экспортируются на поверхность клетки. β2m участвует в фолдинге тяжелой цепи, а также обнаружено, что он участвует в представлении антигена T-клеткам (CD8). β2m также вносит вклад в стабильность комплекса MHC-I/антиген [Neefjes, F.F. et al. (1993) Selective and ATP-dependent translocation of peptides by the MHC-encoded transporter. Science. 261 (5122):769-771].

Трансгенные животные без β2m оказываются жизнеспособными, но демонстрируют ослабленный иммунный ответ, что делает их более восприимчивыми к вирусным и паразитическим инфекциям. Уменьшение иммунного ответа у этих животных коррелирует, как оказалось, с тем фактом, что их клетки представляют очень немногие антигены относительно их комплекса MHC-I, и что большинство их T-лимфоцитов не функциональны [Pereira P., et al. (1992) Blockade of transgenic gamma delta T cell development in beta 2-microglobulin deficient mice, EMBO Journal 11:25-31].

Также описано, что белок β2m участвует в гликозилировании тяжелых цепей в аппарате Гольджи [Sege et al. (1981) Role of beta2-microglobulin in the intracellular processing of HLA antigens. Biochemistry. 20 (16), pp 4523-4530].

Белок β2m также участвует в других процессах, таких как регуляция внутриклеточной сигнализации и правильный фолдинг ключевых белков, таких как HFE (человеческий белок гемохроматоза), который регулирует поток железа в клетке.

С конца 1980-х также установлено, что β2m может успешно улучшать ответ на антиген и применяться в качестве вакцинного адъюванта для стимуляции иммунного ответа, связанного с T-лимфоцитами (CD8).

Многочисленные документы указывают на то, что β2m может быть благодаря этому включен в вакцинные композиции в комбинации с молекулами, имеющими задачу индуцировать иммунную реакцию, такими как специфические вирусные или опухолевые антигены.

В таких вакцинных композициях β2m может присутствовать в различных формах, очищенный или рекомбинантный. Так, например, описаны генетические конструкции, в которых ген, кодирующий β2m, слит с генетическими последовательностями, кодирующими иммуногенные пептиды, с целью экспрессирования белков слияния, предназначенных для вызывания специфической иммунной реакции in vivo [WO 99/64957].

Сам по себе белок β2m очень слабо иммуногенен, поскольку он не гликозилирован. По этой причине в вышеуказанных вакцинных композициях β2m всегда применяется в качестве адъюванта, а не в качестве активного ингредиента.

Это несомненно обусловлено тем фактом, что к настоящему времени не был обнаружен терапевтический эффект β2m, позволяющий обосновать его применение в фармацевтических композициях.

Помимо вакцинации, некоторые документы известного уровня техники указывают на инактивированные или модифицированные формы белка β2m в терапевтических композициях.

Так, например, международная заявка WO 02/102840 описывает β2m, приведенный в нефункциональное состояние, предназначенный для образования неактивных комплексов MHC-I, которые больше не способны активировать CD8 T-лимфоциты. Образованные таким образом комплексы MHC применяют в качестве "приманки" для иммунной системы с целью получения иммунодепрессантного эффекта.

Другая международная заявка WO 02/24929 описывает терапевтические композиции, в которых β2m конъюгирован с белком HFE в качестве вектора для доставки препаратов (активных ингредиентов этих композиций) во внутриклеточное пространство.

Следует заметить, что в заявках этого типа белок β2m не применяется в его функциональной форме дикого типа в качестве активного ингредиента, но в качестве фармацевтической поддержки или вектора в присутствии активных ингредиентов, не направленных на MHC.

Более того, в противоположность какому-либо терапевтическому применению, белок β2m часто используют в качестве маркера различных патологий, в частности, в качестве средства диагностики.

Так, например, синдром иммунодефицита при заболевании СПИДом, который может проявиться через много лет после инфицирования ВИЧ, предваряется резким повышением концентрации β2m в крови.

Некоторые публикации [Wu C.H. et al. (2001) Oncogene 20:7006-20] акцентируют внимание на том, что повышение концентрации β2m коррелирует и, возможно, связано с развитием некоторых раков, в частности, рака костей и рака простаты [Gross M. et al. (2007) Clin. Cancer Res., 13:1979-1986]. Для других раков наблюдается падение концентрации β2m в сыворотке, как например при раке толстой кишки [Kaklamanis L. et al. (1992) Int. J. Cancer 57:379-385].

Количество β2m в крови (и, более конкретно, в сыворотке крови), спинномозговой жидкости или слюне часто используют в диагностике некоторых инфекционных или паразитических заболеваний, но также, в первую очередь, для диагностики некоторых заболеваний почек, лимфатической системы, ревматизма, воспалительных заболеваний и неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и лобно-височная деменция [Davidsson P. et al. (2002), Proteome analysis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients Clinical Neuroscience and Pathology 13:611-615 ; Hansson S.F. et al. (2004), Validation of a prefractionation method followed by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients Proteome Science 2:1-11].

У лиц, считающихся здоровыми, средняя концентрация β2m в крови остается относительно постоянной, меньшей или равной 2 мг/л, в отличие от вышеупомянутых заболеваний, при которых данная концентрация может достигаться значений вплоть до 4,0 мг/л.

Для некоторых патологий возрастание сывороточного β2m может быть вызвано повышенным "слущиванием" (высвобождением белков клеточной поверхности) β2m [Bellotti V., et al. (1999) Cell. Mol. Life Sci., 55-977-991].

Плазматический β2m, циркулирующий в крови, в норме фильтруется клубочками в почках, затем реабсорбируется и катаболизируется в канальцах.

Исследования показали, что половина плазматического β2m (свободная форма β2m), который обновляется каждый день, приходит, в основном, из кругооборота комплексов MHC-I. Оказалось, что это обновление само по себе вносит вклад в высокую выработку сывороточного β2m, составляющую приблизительно 150 мг за 24 часа для лица среднего размера. Тем не менее, данный "оборот", по-видимому, стабилизирует сывороточную концентрацию при 2 мг/л.

У пациентов на диализе, у которых β2m не удаляется почками, накопление β2m в жидкостях организма ведет к вредным последствиям. В частности, оно вызывает артропатии и нейропатии через образование амилоидных бляшек в некоторых соединительных тканях (нервной и суставной) [Ohshi K., et al. Pathogenesis of beta2-microglobulin amyloidosis (2001) Pathol. Int. 51:1-10].

Описано, что при остеоартрите (артрозе) β2m обладает ингибирующим эффектом на пролиферацию хондроцитов, последствием чего является усиление разрушения хрящей [WO 2004/020586].

В случае некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как множественный склероз (МС), обычным является отслеживание изменений концентрации β2m у пациентов, для того чтобы предопределить начало воспалительных эпизодов [Bagnato, F., (2003), beta-2 microglobulin and neopterin as markers of disease activity in multiple sclerosis Neurol. Sci. 24:51301-51304]. При этом концентрацию β2m предпочтительно измеряют в спинномозговой жидкости, поскольку концентрация β2m в крови считается слишком изменчивой [Caudie C. et al. (2005), Valeurs usuelles et utilite diagnostique de la β2-microglobuline dans le liquide cephalorachidien Ann. Biol. Clin. 63(6):631-637; Ryu O.H., et al. (2006) Rheumatology, 45:1077-1086].

Участие β2m в аутоиммунных заболеваниях остается неясным и требует дальнейшего изучения.

Аутоиммунные заболевания образуют большой ряд заболеваний, симптомы которых можно объяснить гиперактивностью иммунной системы, с присутствием или отсутствием аутоантител, направленных на вещества или ткани, которые обычно присутствуют в организме.

Несомненно, что иммунный ответ на "свое" при аутоиммунных заболеваниях является результатом активации T-лимфоцитов через систему MHC, и это может быть вызвано несколькими механизмами.

- В иммунной системе:

- Посредством индуцирования аутоантител с применением T-клеток посредством представления антигенов, известных упомянутым аутоантителам. Это имеет место при системной красной волчанке (SLE), тиреоидите Хашимото, множественном склерозе (МС), инсулинозависимом диабете (I тип) и т.д.

- В клетках:

- Индуцирование аутоиммунного ответа посредством активации T-клеток, специфических к вирусному антигену;

- Изменение в отношении распознавания APC-MHC-I/TcR (T-клеточный рецептор) и в отношении сигнального каскада(ов) активированного T-лимфоцита.

- Неправильная сборка компонентов системы MHC-I в APC.

- Нарушение(я) работы регуляторных клеток.

- На молекулярном уровне:

- Молекулярная мимикрия или толерантность;

- MHC-I в качестве аутоантигена.

Обычно считают, что аутоиммунные заболевания являются результатом совпадения генетической предрасположенности и инфекционного эпизода, во время чего в организме развивается иммунная реакция на его собственные антигены. Тем не менее точные причины данных заболеваний точно идентифицированы не были.

Наиболее широко распространенными аутоиммунными заболеваниями являются ревматоидный полиартрит, синдром Шегрена, тиреоидит Хашимото, болезнь Аддисона, системная красная волчанка, склеродермия, фибромиалгия, миозит, анкилозирующий спондилит, инсулинозависимый диабет I типа, болезнь Крона, целиакия и множественный склероз (МС).

Среди заболеваний, называемых "орфанными", существуют многочисленные другие нарушения, которые, как полагают, также являются аутоиммунными заболеваниями. Амиотрофический боковой склероз (ALS) является одним из этих заболеваний, для которого в настоящее время эффективное лечение не доступно.

Следует различать два типа аутоиммунных заболеваний: специфические аутоиммунные заболевания и неспецифические аутоиммунные заболевания.

При неспецифических заболеваниях поражаются различные органы, что вызывает системные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена и склеродермия.

Специфические заболевания ограничены главным образом определенными органами. Наиболее распространенными являются инсулинозависимый диабет, заболевания щитовидной железы, болезнь Аддисона, некоторые заболевания почек, легких, пищеварительной системы и, особенно, множественный склероз.

Современные способы лечения включают диапазон подходов от противовоспалительных средств до иммунодепрессантов, включая антиметаболиты и противораковые препараты. Например, применяют следующие: нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС), гликокортикоиды, антиметаболиты (метотрексат, азатиоприн), циклофосфамид, сульфасалазин, соли золота, циклоспорин A, микофенолат и лефлуномид.

Недавно для МС был рекомендован интерферон β, а для лечения эритематозной волчанки и ревматоидного полиартрита рекомендованы производные хлорохина (применяемого против малярии).

Данные способы лечения, применяемые для лечения других заболеваний, не очень хорошо адаптированы и обладают многочисленными нежелательными побочными эффектами, в частности когда их применяют в течение долгого времени. Кроме того, хотя они могут позволить по меньшей мере частично ослабить симптомы данных заболеваний, они не позволяют получить ремиссию заболеваний.

Изобретатели, указанные в настоящей заявке, проявили особенный интерес к ситуации четырех пациентов, страдающих четко различающимися аутоиммунными заболеваниями:

- Первый пациент (P1), страдающий неспецифическим аутоиммунным заболеванием, то есть не поражающим определенный орган, но также страдающий тиреоидитом Хашимото и первичным синдромом Шегрена;

- Второй пациент (P2), страдающий изначально МС, впоследствии с дуоденальной лимфоцитарной инфильтрацией;

- Третий пациент (P3), страдающий целиакией;

- Четвертый пациент (P4), страдающий тиреоидитом Хашимото и целиакией.

Для данных пациентов настоящие изобретатели попытались установить отношение количеств HC(MHC-ABC)/β2m, полученное из лимфоцитов, выделенных из крови пациентов с применением обычных способов, указанных далее.

Неожиданно оказалось, что данное отношение HC/β2m растет у этих четырех пациентов по сравнению с контрольными донорами, тогда как концентрация сывороточного β2m была средней: приблизительно 1,9 мг/л для P1, 1,8 мг/л для P2, 1,1 мг/л для P3 и 1,1 мг/л для P4 (ср. с таблицей 1).

Таблица 1Определение различных форм β2m у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями
Пациенты	Сывороточный β2m(а)	HC/β2m в белках(b)	HC/β2m в мембранах(с)
P1	1,9	1,3	1,8
P2	1,8	1,1	1,7
P3	1,1	1,6	1,5
P4	1,1	1,2	2,1
HC: тяжелые цепи MHC-I(a) концентрация β2m в мг/л;(b) HC/β2m, вычисленное по всем лимфоцитарным белкам.(c) HC/β2m, вычисленное по плазматическим мембранам, выделенным из очищенной лимфоцитарной фракции.

Результаты из таблицы 1 выше демонстрируют дисбаланс в отношении ΗC/β2m. Эти результаты выявили неожиданную ситуацию, при которой мембранные комплексы MHC-I, присутствующие у данных четырех пациентов, очевидно значительно дефицитны по β2m по отношению к концентрации HC, при отсутствии повышения концентрации свободного β2m в крови.

Данные наблюдения следует сравнить с представителями контрольной группы с хорошим здоровьем, которые демонстрируют отношение ΗC/β2m, приблизительно равное 1. Напротив, оказалось, что β2m секвестрируется во внутриклеточном пространстве у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.

Эти результаты удивили настоящих авторов и привели их к формулировке гипотезы, что для четырех аутоиммунных заболеваний, которыми страдали данные пациенты, дефицит β2m в мембранных комплексах MHC-I может быть общей причиной. В более общем смысле, дисбаланс ΗC/β2m в комплексах MHC, по-видимому, вносит вклад в появление нарушений, встречающихся при многих аутоиммунных заболеваниях.

В соответствии с данной гипотезой, изложенной далее, аутоиммунная реакция в контексте патологий, которыми страдали четыре пациента, не является, вероятно, следствием общего повышения свободного β2m в крови, но, напротив, происходит от локального дефицита β2m в мембранных комплексах MHC-I, который является причиной изменения представления антигенов T-клеткам (CD8).

Следует заметить, что данная гипотеза никоим образом не исключает участие β2m в активации T-лимфоцитов и в воспалительном процессе, как это могло быть описано в известном уровне техники.

Принимая во внимание эти первые наблюдения, настоящие авторы осуществили анализ HC/β2m во всех лимфоцитарных белках, присутствующих у других пациентов, страдающих МС или болезнью Крона, и смогли обнаружить, что отношение HC/β2m, полученное из лимфоцитов этих пациентов, оказалось также выше, чем у контрольных пациентов.

На основании этих результатов настоящие авторы разработали фармацевтические композиции, главным активным ингредиентом которых являлся белок β2m в функциональной форме.

Целью данных композиций является уменьшение дефицита β2m в мембранных комплексах MHC-I у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.

Фигура 1: Схематическое представление комплекса MHC I типа на плоскости (A) и в пространстве (B). Тяжелая цепь (HC) образована 3 внеклеточными доменами (α1, α2 и α3) и одним трансмембранным доменом. Легкая цепь (β2m), которая является внеклеточной, помещается между мембраной и местом, в котором α1 и α3 тяжелой цепи находятся в непосредственной близости. Фигура B показывает местоположение пептидов (антигенов), представляемых тяжелой цепью.

Фигура 2: Фотография (×630) лимфоцитов, приведенных в контакт с липосомами в соответствии с настоящим изобретением. Липосомы были получены в соответствии со способом диализа, описанном в примере 2. Липосомы (светлые пятна) адсорбированы на мембране лимфоцитов (HLA-ABC). Клеточное ядро остается нетронутым (серое).

Фигура 3: Фотография (×630) лимфоцитов, приведенных в контакт с липосомами в соответствии с настоящим изобретением, содержащими альбумин. Белок (альбумин) сделан флуоресцирующим с помощью DAPI. Он образует более темные пятна, детектируемые с помощью иммунофлуоресценции, внутри более светлых лимфоцитов (HLA-ABC положительных).

Фигура 4: Фотография (×630) липосом, полученных с применением экструзионного способа (зеленые) и содержащих флуоресцирующий β2m (TRITC). A: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. B: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с β2m. C: Суперпозиция двух флуоресценций A и B.

Фигура 5: Фотография (×630) лимфоцитов, полученных от пациента (P1) и инкубированных с липосомами, полученными в соответствии с экструзионным способом и содержащими флуоресцирующий β2m (TRITC). A: Флуоресценция, испускаемая маркером Хехст 33342, который окрашивает ядра лимфоцитов в голубой цвет. B: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с β2m. Такая окраска показывает включение β2m в лимфоциты, которые становятся красного цвета. C: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим зеленым липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. Такая окраска показывает связь липосом с лимфоцитами. D: Суперпозиция окрасок B и C (желтый цвет) - масштабная метка: 10 мкм.

Фигура 6: Микроскопическое исследование флуоресценции липосом, содержащих альбумин (TRITC), после 30 дней хранения при двух различных температурах (25°C и 37°C). По наблюдениям нельзя обнаружить значительных отличий между различными типами получения и хранения. A и B: Партия 30 (30 мг белка на 150 мл). C и D: Партия 60 (60 мг белка на 150 мл). Нижняя часть: Флуоресценция, испускаемая флуоресцирующим липидом NBD-PC-Oleyl, содержащимся в липосомах. Верхняя часть: Флуоресценция, испускаемая флуорофором (родамин B изотиоцианат), связанным с альбумином. Масштабная метка: 200 нм. Увеличение ×630.

Фигура 7: Распределение по размерам (%) липосом (<50 нм, между 50 и 100 нм, >100 нм), содержащих альбумин, в зависимости от времени (2, 30 и 60 дней) и температуры хранения (25°C и 37°C). A и B: Партия 30 (30 мг белка на 150 мл), C и D: Партия 60 (30 мг белка на 150 мл).

Фигура 8: Распределение по размерам (%) липосом (<50 нм, между 50 и 100 нм, >100 нм), содержащих высокую концентрацию β2m (партия 80 мг белка на 150 мл), в зависимости от времени хранения при 25°C в течение 6 и 40 дней.

Фигура 9: Профили деградации чистого или покрытого липосомой β2m сыворотками пациентов или здоровых доноров с течением времени. A и B: чистый/липосомный препарат β2m (сыворотка пациента 1: женщины в возрасте 51 года, страдающей заболеванием Хашимото). C и D: чистый/липосомный препарат β2m (сыворотка пациента 2: женщины в возрасте 73 лет, ревматоидный полиартрит). E и F: контрольный пациент, здоровый мужчина в возрасте 62 лет.

Фигура 10: Электрофорезный гель белка, демонстрирующий связь между β2m (липосомный препарат) и тяжелыми цепями MHC-I на клеточной поверхности лимфоцитов, полученных от пациентов. A: В присутствии глутаральдегида комплексы HLA-β2m видны при 55 кДа, а свободный β2m при 12 кДа. Полоска 12 кДа на дорожке без глутаральдегида представляет клеточный β2m (дорожка 3). B: Количественное определение мембранной экспрессии β2m. Этот контроль делает возможным обоснование применения глутаральдегида для получения комплексов HLA-β2m. C: Сравнение лимфоцитов пациента, страдающего множественным склерозом, (женщина, 39 лет) и здорового донора (мужчина, 67 лет) после инкубации с липосомным препаратом β2m в течение 90 минут. β2m, содержащийся в липосомах, в больших количествах связывается с лимфоцитами, полученными от пациента (в присутствии глутаральдегида), чем это имеет место в контроле.

Фигура 11: Анализ токсичности β2m, свободного или в липосомах, "in vitro" на человеческих клетках печени и почек.

A, C и E: анализ на клетках печени HH после 24, 48 и 72 часов воздействия. B, D и F: клетки почек HREpic после 24, 48 и 72 часов воздействия. 1. контроль. 2. контроль и ненагруженные липосомы. 3. 3 мкг свободного β2m. 4. 3 мкг β2m в липосомной форме (партия 66 мкг на 150 мл). 5. 6 мкг свободного β2m. 6. 6 мкг β2m в липосомной форме (партия 132 мкг на 150 мл). Общее содержание белка определяли способом с BCA.

Фигура 12: Анализ токсичности β2m, свободного или в липосомах, "in vitro" на человеческих клетках печени и почек. Те же самые обозначения, что и на фигуре 11. Результат MTT-теста на жизнеспособность.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению белка β2m в качестве активного ингредиента, в частности, для получения лекарственного средства.

Белок β2m предпочтительно представляет собой человеческую форму белка, очищенного или рекомбинантного, референсная полипептидная последовательность, а также генетические детерминанты которого описаны в базе данных GENEBANK под номером доступа CAG33347.

В случае очищенного β2m, он может быть получен из сывороток здоровых доноров.

Также может быть предусмотрено обращение к химическому синтезу, поскольку белок может применяться в не гликозилированной форме.

Настоящее терапевтическое применение β2m распространяется на функциональные варианты этого белка, то есть на его изоформы, на видоизмененные копии или на фрагменты этого белка, отличительной особенностью которых является то, что они обладают той же функциональностью, что и белок дикого типа, то есть тем же терапевтическим эффектом, описанным в настоящей заявке, причем, однако, возможно, что интенсивность этого эффекта уменьшается или возрастает по отношению к упомянутому белку дикого типа.

Функциональный вариант более конкретно обозначает полипептид, способный связываться с комплексами MHC, присутствующими на поверхности клеток, полипептидная последовательность которого по меньшей мере на 70%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична полипептидной последовательности человеческого белка β2m (сравнение последовательности осуществляют, например, с применением программного приложения ClustalW).

Функциональный вариант β2m, предпочтительно, состоит из фрагмента белка β2m, демонстрирующего тот же терапевтический эффект или даже ту же биологическую активность.

Такие функциональные варианты могут также быть результатом экспрессии нуклеотидных последовательностей, клонированных в векторе экспрессии или в генно-терапевтическом векторе.

Многочисленные публикации описывают, например, присутствие изоформ β2m в грызунах [Goding J.W. and Walker I.D. Allelic forms of β2-microglobulin in mouse (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7395-7399] и в людях [Davidsson P. et al., Proteome analysis of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer patients (2002) Clinical Neuroscience and Pathology 13:611-615; Hansson S.F. et al., Validation of a prefractionation method followed by two-dimensional electrophoresis-Applied to cerebrospinal fluid protein from frontotemporal dementia patients (2004) Proteome Science 2:1-11]. Эти изоформы, которые более точно различаются различными изоэлектрическими точками (pI), рассматриваются как функциональные варианты β2m.

Такие функциональные варианты могут обладать определенными преимуществами с точки зрения эффективности продукта или его составления по отношению к очищенному человеческому белку (растворимость, большая стабильность, уменьшенная протеолитическая деградация).

Настоящее изобретение касается фармацевтических композиций, содержащих β2m или один из функциональных вариантов β2m в качестве активного ингредиента.

Предпочтительно, β2m или его функциональный вариант образуют единственный активный ингредиент упомянутых композиций.

Как это понимается в настоящем изобретении, активный ингредиент представляет собой вещество, которое входит в композицию лекарственного средства, и которое ответственно за его фармакодинамические или терапевтические свойства. Адъювант не считается активным ингредиентом, как это понимается в настоящем изобретении.

Более предпочтительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, состоящей из β2m или функционального варианта β2m, содержащегося в фармацевтически приемлемом носителе или основе, причем упомянутые фармацевтически приемлемые носитель или основа предпочтительно представляют собой липосому.

В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения β2m вводят отдельно, с упомянутым фармацевтически приемлемым носителем или физиологическим раствором, в соответствии с регламентирующими рекомендациями и требованиями.

В соответствии с настоящим изобретением β2m применяется в первую очередь из-за его способности восстанавливать нормальное отношение HC/β2m в мембранных комплексах MHC-I у пациента.

Отношение HC/β2m предпочтительно рассматривается по отношению к лимфоцитам, в частности, B клеткам. Отношение HC/β2m соответствует молярному отношению субъединиц HC и β2m в очищенных комплексах MHC-I.

Предпочтительно, данное отношение возвращают к уровню, сравнимому с уровнем у пациента, не страдающего заболеванием. Более предпочтительно, β2m применяют с целью уменьшения отношения HC/β2m у пациента, для того чтобы получить молярное отношение, близкое к 1.

Настоящее изобретение более конкретно направлено на предотвращение возникновения дефицита β2m в комплексах MHC-I у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.

Применение β2m в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, более конкретно предназначено для лечения аутоиммунных заболеваний.

Настоящие изобретатели смогли определить, что дефицит внутриклеточного или мембранного β2m может приводить к отношению HC/β2m большему, чем 1 или даже 2 у некоторых пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями. Настоящее изобретение, таким образом, направлено на возвращение упомянутого HC/β2m к значению, близкому к физиологическим значениям, т.е., предпочтительно, менее чем 2, более предпочтительно, менее чем 1,5 и еще более предпочтительно менее чем 1,2.

Настоящее изобретение может, конечно, применяться к любому заболеванию, связанному с дисбалансом в отношении HC/β2m в комплексах MHC-I, отличному от аутоиммунных заболеваний.

Как это понимается в настоящем изобретении, патологии, связанные с трансплантатами органов или отторжением трансплантата, не рассматриваются ни как аутоиммунные заболевания, ни как заболевания, вызванные нарушением распознавания "не своего" иммунной системой. Точнее говоря, отторжение трансплантата рассматривается здесь как следствие распознавания "не своего" иммунной системой, а не как нарушение распознавания "своего".

Анализы, осуществленные настоящими изобретателями у различных пациентов, указывают на то, что отношение HC/β2m, вычисленное исходя из общего лимфоцитарного белка, большее, чем 1,2, может наблюдаться по меньшей мере для следующих заболеваний: ревматоидный полиартрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, фибромиалгия, миозит, анкилозирующий спондилит, инсулинозависимый диабет I типа, тиреоидит Хашимото, болезнь Аддисона, болезнь Крона, целиакия, амиотрофический боковой склероз (ALS) и множественный склероз (МС). Хотя данный вопрос все еще остается предметом дискуссии в научном сообществе, ALS приравнивают к аутоиммунному заболеванию в виду полученных результатов.

Настоящее изобретение касается более конкретно разработки лекарственного средства для повышения количества β2m в крови до концентрации, лежащей между 2,5 и 12 мг/л, предпочтительно между 3 и 8 мг/л, более предпочтительно между 3 и 5 мг/л, для того чтобы уменьшить дефицит HC/β2m мембранного комплекса MHC-I.

Как описано ниже в экспериментальной части настоящего изобретения, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может состоять из липосомного препарата, содержащего β2m или его функциональный вариант. Липосомы можно изготовить с применением различных способов, известных специалисту в данной области техники, таких как изложенные в примерах в настоящей заявке. Можно применять различные липиды, образующие липосомы [Medical Application of Liposomes (1986) edited by Kunio Yagi, Japan Scientific Societies Press, Tokyo, Karger].

Предпочтительное лекарственное средство настоящего изобретения в связи с этим состоит из липосомы, нагруженной β2m.

Предпочтительно, β2m или функциональный вариант этого белка составляют единственные активные ингредиенты, содержащиеся в упомянутом липосомном препарате.

Применение липосомы в соответствии с настоящим изобретением в качестве лекарственного средства является предпочтительным, поскольку оно позволяет защитить β2m от протеолитических атак, которые могут иметь место, и поскольку оно позволяет доставлять β2m целевым образом в комплексы MHC-I, в частности посредством слияния липосомы с фосфолипидами, которые образуют клеточные мембраны.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения применяют генно-терапевтический вектор, кодирующий β2m или один из его функциональных вариантов, для того чтобы синтезировать данный белок in vivo, предпочтительно в окружении комплексов MHC. Такой генно-терапевтический вектор может содержаться в липосомах.

Настоящее изобретение, таким образом, также относится к генно-терапевтическому способу, содержащему стадию in vivo или ex vivo экспрессии β2m или его функционального варианта в качестве активного ингредиента. Различные типы вирусных или не вирусных векторов, описанные в литературе, можно адаптировать для экспрессии белка β2m для данной цели [Urnov et al. (2005) Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases, Nature, 435:577-579]. Предпочтительно, генно-терапевтический вектор в соответствии с настоящим изобретением делает возможной экспрессию в организме человека белка β2m (или его функционального варианта) без какого-либо другого активного ингредиента, и, предпочтительно, какого-либо другого полипептида.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения пациент может подвергаться лечению посредством перфузии раствора липосом, содержащих β2m или вектор, экспрессирующий этот белок, или посредством трансфузии лимфоцитов от пациентов, предварительно приведенных в контакт с β2m. Такое приведение в контакт можно осуществлять посредством инкубации "ex vivo" лимфоцитов, экстрагированных из образца крови, предварительно взятого у того же пациента.

В соответствии с предпочтительным аспектом настоящего изобретения лекарственное средство, содержащее β2m, получают в форме солевого раствора. Предпочтительный способ получения лекарственного средства состоит из инкубации β2m в форме солевого раствора, ex vivo, в контакте с сывороткой пациента, для которого предназначено это лекарственное средство.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением, описанные выше, могут принимать любую соответствующую форму, известную специалисту в данной области техники, для их перорального введения, посредством инъекции, перфузии или ингаляции.

Другой аспект настоящего изобретения касается диагностики аутоиммунных заболеваний, более конкретно диагностики заболеваний, перечисленных выше, посредством определения in vivo или in vitro отношения HC/β2m комплексов MHC-I.

Способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно содержит одну или несколько из следующих стадий, состоящих из:

i) забора клеток у пациента, у которого осуществляется скрининг аутоиммунного заболевания, предпочтительно лимфоцитов;

ii) экстрагирования комплексов MHC-I из этих клеток и при необходимости;

iii) определения относительных количеств HC и β2m, содержащихся в упомянутых комплексах;

iv) установления молярного отношения HC/β2m; и

v) сравнения полученного отношения HC/β2m с результатами, полученными ранее у других пациентов.

Отношение HC/β2m может быть установлено для всей клетки (клеточное отношение HC/β2m) или, предпочтительно, для мембраны (отношение HC/β2m мембранных комплексов MHC-I). Предпочтительно, способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением содержит стадию сравнения отношения HC/β2m с этим отношением в контроле, или, в контексте наблюдения за пациентом, с другими отношениями, определенными ранее.

Относительные количества белков HC и β2m можно определять стандартным способом в соответствии со способами, известными специалисту в данной области техники, например посредством количественного иммунологического анализа (например, ELISA, иммунодоттинга, "вестерн-блоттинга", микрочипов с аутоантигеном и т.д.). Экстракцию комплексов MHC-I осуществляют в соответствии с известными протоколами экстрагирования клеточных и мембранных белков.

Способ диагностики в соответствии с настоящим изобретением можно применять в контексте терапевтического наблюдения за пациентами, страдающими различными аутоиммунными заболеваниями.

Следующие примеры предназначены для дополнения описания настоящего изобретения без ограничения его объема.

ПРИМЕРЫ

1 - Анализ компонентов мембранного комплекса HLA-I лимфоцитов у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями.

Не ограничивая себя теорией, настоящие изобретатели разработали рабочую гипотезу, что повышение отношения HC/β2m может приводить к реакциям аутоиммунного типа. В частности, настоящие изобретатели предположили, что избыток HC, уменьшение β2m, на уровне комплексов MHC-I, или и то, и другое в одно и то же время, могут приводить к явлению "переэкспонирования" TcR "своего". Следует заметить, что β2m защищает некоторые участки HC и специфически определяет представление "не своего" CD8 T-клеткам [Hill, D.M. et al. (2003), A dominant negative mutant β2-microgobulin blocks the extracellular folding of major histocompatibility complex class I heavy chain. JBC. 278:5630-5638].

Для того чт