Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых

Применение cry1ab в комбинации с cry1be для управления резистентностью насекомых

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Уровень техники

Люди выращивают кукурузу для получения продуктов питания и энергии. Люди также возделывают многие другие сельскохозяйственные культуры, включая соевые бобы и хлопчатник. Ежегодно миллиарды долларов тратятся на борьбу с насекомыми-вредителями, и еще миллиарды долларов теряются за счет ущерба, который они наносят. Синтетические органические химические инсектициды были основными инструментами, которые использовались для борьбы с насекомыми-вредителями, но биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), в некоторых областях сыграли весьма важную роль. Возможность получения устойчивых к насекомым растений посредством трансформации генов инсектицидных Bt-белков, привела к революционным преобразованиям в современном сельском хозяйстве, и подчеркнула важность и значение инсектицидных белков и их генов.

Некоторые Bt-белки использовали для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени были успешно зарегистрированы и стали промышленно доступными. Они включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fа и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Aс и Cry2Ab в хлопчатнике и Cry3A в картофеле.

Промышленно-доступные продукты, экспрессирующие данные белки, экспрессируют один белок, за исключением тех случаев, когда желателен комбинированный спектр 2 инсектицидных белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в комбинации в кукурузе для обеспечения устойчивости соответственно к чешуекрылым вредителям и корневым нематодам), или когда независимое действие белков делает их пригодными в качестве инструмента для задержки развития резистентности у чувствительных популяций насекомых (например, Cry1Aс и Cry2Аb в комбинации в хлопчатнике для обеспечения управления резистентностью у табачной листовертки). Смотри также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, которая относится к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для борьбы с Helicoverpa zea или armigerain. Международная заявка WO 2009/132850 относится к Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для борьбы с Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США № 2008/0311096 частично относится к Cry1Ab для борьбы с кукурузным стеблевым мотыльком, резистентным к Cry1F (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)).

То есть, некоторые свойства устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широкому внедрению данной технологии, также дали основание полагать, что в популяциях насекомых будет развиваться резистентность к инсектицидным белкам, продуцированным такими растениями. Было предложено несколько стратегий для того, чтобы сохранить применение Bt-признаков устойчивости к насекомым, которые включают применение действующих белков в высокой дозе в комбинации с «убежищем» и альтернативно с совместным размещением других токсинов (McGaughey et al. (1998) «B.t. Resistance Management», Nature Biotechnol., 16:144-146).

Для белков, выбранных для применения в стеках управления резистентностью насекомых (IRM), требуется проявлять их инсектицидный эффект независимо, так, чтобы резистентность, возникшая к одному белку, не придавала резистентности ко второму белку (т.е. отсутствовала перекрестная резистентность к белкам). Если, например, популяция вредителей, выбранная за счет наличия резистентности к «белку А», одновременно является восприимчивой к «белку В», то заявители утверждают, что отсутствует перекрестная резистентность и что комбинация белка А и белка В будет эффективной в задержке развития резистентности к одному белку А.

При отсутствии резистентных популяций насекомых можно провести прогностические оценки, основанные на других характеристиках, предположительно связанных с механизмом действия и возможностью развития перекрестной резистентности. Было предложено использовать опосредованное рецептором связывание для идентификации инсектицидных белков, для которых, вероятно, не характерна перекрестная резистентность (van Mellaert et al., 1999). Ключевым прогностическим показателем отсутствия перекрестной резистентности в данном подходе является тот факт, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у восприимчивых видов насекомых.

В том случае, когда два Bt-токсина конкурируют у насекомых за один и тот же рецептор, и если рецептор мутирует у этого насекомого таким образом, что один из токсинов больше не связывается с рецептором и в результате больше не проявляет инсектицидной активности против этого насекомого, то это может быть случаем, когда у насекомого также будет развиваться резистентность ко второму токсину (который конкурентно связан с тем же рецептором). То есть, насекомое обладает перекрестной резистентностью к обоим Bt-токсинам. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это может быть показателем того, что насекомое не будет одновременно обладать резистентностью к этим двум токсинам.

Например, белок Cry1Fa используется для борьбы со многими чешуекрылыми насекомыми, включая кукурузного стеблевого мотылька (Hübner) и кукурузную листовую совку (FAW; Spodoptera frugiperda), и белок активен против огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцированный в трансгенных растениях кукурузы, содержащий событие TC1507, ответственен за ведущий в отрасли признак резистентности насекомых в мероприятиях для борьбы с FAW. Белок Cry1Fa также входит в состав продуктов Herculex^®, SmartStax^TM и WideStrike^TM.

Возможность проводить исследования, основанные на связывании (конкурентном или гомологичном) с рецептором с использованием белка Cry1Fa была ограничена, поскольку доступный обычный метод введения метки в белки для детектирования в тестах связывания с рецептором приводил к инактивации инсектицидной активности белка Cry1Fa.

Дополнительные Cry-токсины приводятся на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al., lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время известно почти 60 основных групп «Cry»-токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt- и VIP-токсинами и тому подобное. Многие из каждой нумерационной группы подразделяются на подгруппы под заглавной буквой, и подгруппы под заглавной буквой подразделяются на подподгруппы, обозначенные строчной буквой (например, Cry1 имеет A-L, и Cry1A имеет a-i).

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют за сайты связывания в мембранных препаратах клеток кишечника кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Как это будет понятно специалистам в данной области с помощью данного раскрытия, растения, которые продуцируют два эти белка (включая инсектицидные фрагменты полноразмерных белков), могут задерживать или предупреждать развитие резистентности к любому одному из данных инсектицидных белков. Кукуруза и соевые бобы являются только некоторыми предпочтительными растениями. ECB представляет предпочтительный вредитель-мишень для данной пары токсинов.

Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Cry1Ab в комбинации с белком Cry1Be. Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют оба таких белка, включены в объем настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых белки Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает три сайта действия против ECB. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя местами действия» включают основную пару белков по настоящему изобретению плюс Cry2A, Cry1I и DIG-3 в качестве третьего белка для целенаправленного действия на ECB. Такие конкретные тройные стеки будут, по настоящему изобретению, преимущественно и поразительно обеспечивать три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать необходимость в территориях-«убежищах».

Несмотря на то, что настоящее изобретение раскрывается в данном документе в виде пары токсинов Cry1Ab и Cry1Be, которые по отдельности или в «пирамиде» из трех или более токсинов, которые обеспечивают устойчивость кукурузы к ECB, очевидно, понятно, что комбинации Cry1Ab и Cry1Be, описанные в данном документе, также можно использовать с дополнительными белками для целенаправленного воздействия на FAW на соевых бобах и кукурузе.

Также по настоящему изобретению можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa подвергают стекингу с парой белков по настоящему изобретению (Cry1Fa и Cry1Be оба активны против FAW и ECB), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечивать три сайта действия против FAW, и три сайта действия против ECB. Такой добавленный белок (четвертый белок для направленного действия против FAW) можно выбрать из группы, состоящей из Cry1Fa, Vip3Ab и Cry1E. Это будет приводить к обеспечению стека из четырех белков, имеющего три сайта действия против двух насекомых (ECB и FAW).

Краткое описание таблиц

Таблица 1: приводятся примеры аминокислот из четырех классов аминокислот.

Краткое описание фигур

Фиг.1: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с ECB BBMV по сравнению с Cry1Be.

Фиг.2: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с FAW BBMV по сравнению с Cry1Be.

Фиг.3: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Be с FAW BBMV по сравнению с Cry1Ab.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют друг с другом за сайты связывания в кишечнике кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Cry1Ab можно использовать в комбинации с белком Cry1Be в трансгенной кукурузе (и других растениях, например, хлопчатнике и соевых бобах) для задержки и предупреждения развития резистентности у ECB к любому одному из данных белков. Пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в защите растений (таких как растения кукурузы) от повреждения ECB с резистентностью к Cry. То есть, одним применением настоящего изобретения является зашита кукурузы и других экономически важных видов сельскохозяйственных культур от повреждения и потерь урожая, вызванных популяциями ECB, у которых может развиться резистентность к Cry1Ab или Cry1Be.

Таким образом, настоящее изобретение относится к стеку для управления резистентностью у насекомых (IRM), включающему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения или подавления развития резистентности ECB к одному или обоим данным белкам.

Кроме того, несмотря на то, что настоящее изобретение, раскрытое в данном документе, относится к стеку IRM, содержащему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения резистентности ECB к одному или обоим данным белкам, в объеме изобретения, раскрытого в данном документе, находится то, что один или оба Cry1Ab и Cry1Be можно адаптировать, самостоятельно или в комбинации, для предупреждения резистентности FAW к одному или обоим данным белкам.

Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с чешуекрылыми вредителями, содержащим клетки, которые продуцируют истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab и истинный токсин-содержащий белок Cry1Be.

Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для продукции как инсектицидного белка Cry1Ab, так и инсектицидного белка Cry1Be, где указанный хозяин является микроорганизмом или растительной клеткой. Полинуклеотид(ы) по настоящему изобретению предпочтительно находится в генетической конструкции под контролем не-Bacillus thuringiensis промотора(ов). Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать кодон, предпочтительный для применения в растениях для повышенной экспрессии.

Дополнительно предполагается, что изобретение относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или окружающей среды указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит инсектицидный белок Cry1Ab и дополнительно содержит инсектицидный белок Cry1Be.

Вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, содержащему экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, и семя такого растения.

Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, интрогрессированы в указанное растение кукурузы, и семени такого растения.

Как описано в примерах, опыты с конкурентным связыванием с рецептором с использованием меченных радиоактивной меткой белков Cry1Ab и Cry1Be показывают, что белок Cry1Be не конкурирует за связывание в тканях ECB или FAW, с которыми связывается Cry1Ab. Данные результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Ab и Cry1Be может быть эффективным средством для подавления развития резистентности в популяциях ECB и FAW к одному из двух данных белков. Таким образом, основываясь частично на данных, описанных в настоящем документе, полагается, что совместная продукция (стекинг) белков Cry1Ab и Cry1Be может использоваться для высокоэффективного стека IRM для ECB.

К этой паре можно добавить другие белки. Например, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против FAW. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя сайтами действия» включают основную пару по настоящему изобретению плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1C, Cry1D или Cry1E в качестве третьего белка для целенаправленного действия на FAW. Данные конкретные тройные стеки по настоящему изобретению будут преимущественно и поразительно обеспечивать три места сайта против FAW. Это поможет снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Под выражением «отдельные сайты действия» понимается, что любой из данных белков не вызывает перекрестной резистентности в другом.

К настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa входит в состав стека с парой белков по настоящему изобретению (оба Cry1Ab и Cry1Be активны против обоих FAW и кукурузного стеблевого мотылька (ECB)), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечиваться три сайта действия против FAW и три сайта действия против ECB. Данный добавленный белок (четвертый белок) можно выбрать из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I и DIG-3 (смотри заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223). Это будет приводить к получению стека из четырех белков, содержащего три сайта действия против насекомых (ECB и FAW).

Таким образом, одной возможностью внедрения является применение пары белков по настоящему изобретению в комбинации с третьим токсином/геном и применение данного тройного стека для подавления развития резистентности у ECB и/или FAW к любому из данных токсинов. Следовательно, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против ECB и/или FAW.

Среди возможностей внедрения по настоящему изобретению будет применение двух, трех или более белков из белков по настоящему изобретению в районах с возделыванием сельскохозяйственных культур, где могут развиться резистентные популяции ECB и/или FAW.

Руководство по применению Cry1Fa и Cry1Be (для борьбы с ECB и/или FAW) смотри в заявке на патент США № 61/284290 (поданной 16 декабря 2009). С Cry1Fa, активным против ECB (и FAW), Cry1Ab плюс Cry1Be, плюс Cry1Be по настоящему изобретению преимущественно и удивительно обеспечиваются три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах.

Белок Cry1Fa входит в состав продуктов Herculex^®, SmartStax^TM и WideStrike^TM. Пару генов по настоящему изобретению (Cry1Ab и Cry1Be) можно объединить, например, в продукте на основе Cry1Fa, таком как Herculex^®, SmartStax^TM и WideStrike^TM. Следовательно, пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в снижении давления отбора на данные и другие белки. Таким образом, пару белков по настоящему изобретению можно использовать в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и соевых бобов).

Как уже обсуждалось выше, к настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Для целенаправленного воздействия на ECB можно использовать Cry2A, Cry1I и/или DIG-3. Смотри, например, заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223. Информацию по комбинации Cry1F и Cry1Ab (для борьбы с ECB) смотри в публикации заявки на патент США № 2008/0311096.

Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют любую из комбинаций белков по настоящему изобретению, включаются в объем настоящего изобретения. Также можно добавить дополнительные токсины/гены, но конкретные стеки, обсужденные выше, преимущественно и поразительно обеспечивают многочисленные сайты действия против ECB и/или FAW. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Таким образом, поле площадью более 10 акров, засаженное такими растениями, включается в объем изобретения.

GENBANK также можно использовать для получения последовательностей любого из генов и белков, которые обсуждаются в данном документе. Смотри Приложение А ниже. Также можно использовать патенты. Например, в патенте США № 5188960 и патенте США № 5827514 описаны истинный токсин-содержащие белки Cry1F, подходящие для применения в осуществлении изобретения. В патенте США № 6218188 описаны ДНК-последовательности, оптимизированные для применения в растениях, кодирующие истинные токсин-содержащие белки Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении.

Комбинации белков, описанные в данном документе, можно использовать для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые насекомые, бабочки и мотыльки питаются, главным образом, нектаром цветов и являются основными эффекторами опыления. Почти все личинки чешуекрылых насекомых, т.е. гусеницы, питаются на растениях, и многие из них являются серьезными вредителями. Гусеницы питаются на поверхности и внутри листьев, или на корнях или стебле растений, тем самым лишая растение питательных веществ и часто разрушая физическую поддерживающую структуру растения. Кроме того, гусеницы питаются на фруктах, хлопке и хранящихся зернах, а также цветах, разрушая эти продукты, предназначенные для продажи, или серьезно снижают их качество. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «чешуекрылые вредители», он относится к различным стадиям развития вредителя, включая личиночные стадии.

Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению включают полный N-концевой фрагмент, соответствующий истинному токсину Bt-токсина, в той же точке после конца фрагмента истинного токсина белок имеет переход в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевой, активный в качестве инсектицида фрагмент токсина в Bt-токсине, далее относится к «истинному токсину». Переход сегмента истинного токсина в сегмент гетерологичного протоксина находится примерно в соединении токсина/протоксина, или альтернативно фрагмент нативного протоксина (простирающийся за фрагментом истинного токсина) может сохраниться, с переходом в гетерологичный протоксин, расположенным даунстрим.

В качестве примера один химерный токсин по настоящему изобретению имеет полный фрагмент истинного токсина белка Cry1Ab (аминокислоты 1-601) и/или гетерологичный протоксин (примерно аминокислоты 602 до С-конца). В одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.

Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что Bt-токсины, даже внутри определенного класса, такого как Cry1Be, до некоторой степени будут варьировать в длине и точном положении перехода от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина. Как правило, токсины Cry1Be имеют длину примерно от 1150 до примерно 1200 аминокислот. Обычно переход от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина составляет примерно от 50% до примерно 60% от полной длины токсина. Химерный токсин по настоящему изобретению будет включать полную экспансию данного N-концевого фрагмента истинного токсина. Таким образом, химерный токсин будет включать, по меньшей мере, примерно 50% от полной длины Cry1Be. Это будет составлять, по меньшей мере, примерно 590 аминокислот. В отношении фрагмента протоксина, то полная экспансия фрагмента протоксина Cry1Ab будет простираться от конца фрагмента истинного токсина до С-конца молекулы.

Гены и токсины. Гены и токсины, пригодные для применения по настоящему изобретению, включают не только раскрытые полноразмерные последовательности, но также фрагменты данных последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют специфическую пестицидную активность токсинов, конкретно приведенных в качестве примера. В том смысле, в котором в данном документе используются термины «варианты» или «вариации» генов, они относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидной активностью. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «эквивалентные токсины», он относится к токсинам, обладающим такой же или по существу такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и токсины по настоящему изобретению.

В том смысле, в котором в данном документе используется этот термин, границы представляют примерно 95% (Cry1Ab's и Cry1Be's), 78% (Cry1Ab's и Cry1Be's) и 45% (Cry1's) идентичность последовательностей согласно «Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol. 62:807-813. Эти пороги отсечения молекулярной массы также могут быть применимы только к истинным токсинам.

Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что гены, кодирующие активные токсины, можно идентифицировать и получить несколькими способами. Конкретные гены или фрагменты генов, приведенные в качестве примера, можно получить из изолятов, депозированных в коллекции культур, как описано выше. Данные гены или их фрагменты, или варианты, также можно сконструировать синтетическим путем, например, при использовании синтезатора генов. Вариации генов можно легко сконструировать с использованием обычных способов получения точечных мутаций. Также фрагменты данных генов можно получить с использованием промышленно доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз, следуя стандартным процедурам. Например, можно использовать ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез для методичного отсечения нуклеотидов от концов таких генов. Также гены, которые кодируют активные фрагменты, можно получить с использованием различных рестриктаз. Протеазы можно использовать для непосредственного получения активных фрагментов данных токсинов.

Фрагменты и эквивалентные варианты, которые сохраняют пестицидную активность приведенных в качестве примера токсинов, будут находиться в объеме настоящего изобретения. Также за счет вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотные последовательности, раскрытые в данном документе. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же или по существу одни и те же токсины. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «по существу одни и те же» последовательности, он относится к последовательностям, которые имеют аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые не оказывают существенного отрицательного влияния на пестицидную активность. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также входят в объем данного определения.

Дополнительным способом идентификации генов, кодирующих токсины, и фрагментов генов, пригодных для настоящего изобретения, является применение олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности можно детектировать с использованием соответствующей метки или их можно сделать изначально флуоресцентными, как описано в международной заявке WO 93/16094. Как хорошо известно в данной области, если молекула зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются с образованием сильной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что зонд и образец имеют значительную гомологию. Предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях с использованием методов, известных в данной области, описанных, например, Keller G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры концентраций солей и комбинаций температуры являются следующими (в порядке увеличения жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 65°С. Детектирование зонда обеспечивает способ определения известным путем того, имела ли место гибридизация. Такой анализ зонда обеспечивает быстрый способ идентификации генов, кодирующих токсины по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов по изобретению, можно синтезировать с использованием ДНК-синтезатора и стандартных методов. Такие нуклеотидные последовательности также можно использовать в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по настоящему изобретению.

Вариантные токсины. Некоторые токсины по настоящему изобретению конкретно приводятся в качестве примера в данном документе. Поскольку данные токсины являются только примерами токсинов по настоящему изобретению, то, очевидно, понятно, что настоящее изобретение включает вариантные или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же или аналогичной пестицидной активностью примерного токсина. Эквивалентные токсины должны обладать аминокислотной гомологией с примерным токсином. Как правило, такая аминокислотная гомология будет составлять более 75%, предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95%. Аминокислотная гомология будет наиболее высокой в наиболее важных областях токсина, которые отвечают за биологическую активность или принимают участие в определении трехмерной конфигурации, которая в конечном итоге ответственна за биологическую активность. В этом отношении приемлемы некоторые аминокислотные замены, и можно ожидать, что такие замены находятся в областях, которые не являются важными для проявления активности, или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают отрицательного влияния на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты можно разделить на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, посредством которых аминокислота одного класса замещается другой аминокислотой того же типа, находятся в объеме настоящего изобретения, при условии, что замена существенно не изменяет биологическую активность соединения. Ниже приводится перечень примеров аминокислот, относящихся к каждому классу.

Таблица 1
Примеры аминокислот в четырех классах аминокислот

В некоторых случаях также можно провести неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно снижать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, можно ввести в широкий ряд микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина, прямо или опосредованно, приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицида. Коньюгационный перенос и рекомбинантный перенос можно использовать для получения Bt-штамма, который экспрессирует оба токсина по настоящему изобретению. Также можно трансформировать другие микроорганизмы-хозяева одним или обоими генами токсинов для получения синергического эффекта. Относительно подходящих микроорганизмов-хозяев, например, Pseudomonas, то микробы можно применить в положение вредителя, где они будут пролиферировать и поглощаться. Результатом является борьба с вредителем. Альтернативно микроорганизм, содержащий ген токсина, можно обработать в условиях, которые пролонгируют активность токсина и стабилизируют клетку. Затем на обработанную клетку, которая сохраняет токсическую активность, можно воздействовать средой вредителя-мишени.

В том случае, когда ген Bt-токсина вводят в микроорганизм-хозяин с помощью подходящего вектора, и на указанный хозяин воздействуют средой в живом состоянии, то важно, чтобы использовались определенные микроорганизмы-хозяева. Выбирают микроорганизмы-хозяева, о которых известно, что они обитают в «фитосфере» (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более интересующих культур. Данные микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они были способны успешно конкурировать в определенной окружающей среде (культура и другие насекомые-обитатели) с микроорганизмами дикого типа для обеспечения стабильного поддержания и экспрессии гена, экспрессирующего полипептид-пестицид, и желательно, обеспечения повышенной защиты пестицида от деградации и инактивации в окружающей среде.

Известно большое количество микроорганизмов, которые обитают в филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или ризосфере (в почве, окружающей корни растений) широкого ряда важных сельскохозяйственных культур. Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, родов Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophillius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc и Alacaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, родов Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий, которые обитают в фитосфере, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, и виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.

Имеется большое количество способов интродукции Bt-гена, кодирующего токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые обеспечивают стабильное сохранение и экспрессию гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в данный документ для сведения.

Обработка клеток. Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt-токсины, можно обработать для пролонгирования активности токсинов и стабилизации клетки. Пестицидная микрокапсула, которая образуется, содержит Bt-токсин или Bt-токсины в клеточной структуре, которая стабилизирована и будет защищать токсин, когда микрокапсула подвергается воздействию окружающей среды вредителя-мишени. Подходящие клетки-хозяева могут включать прокариоты или эукариоты, и обычно ограничиваются клетками, которые не продуцируют веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако можно использовать микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, в том случае, когда токсичные вещества являются нестабильными, или их содержание является достаточно низким для того, чтобы избежать проявления любой возможной токсичности для млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.

При обработке обычно клетки должны быть интактными и в основном находиться в пролиферативной форме, лучше не в форме спор, хотя, в некоторых случаях можно использовать споры.

Обработку клетки микроорганизма, например, микроорганизма, содержащего ген или гены Bt-токсина, можно проводить химическим или физическим методами, или комбинацией химического и/или физического методов, при условии, что метод не оказывает отрицательного влияния на свойства токсина и не снижает способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенированные соединения, в частности, галогенсодержащие соединения с 17-80 атомами. Конкретнее, можно использовать иод в мягких условиях и в течение достаточного периода времени для достижения желаемых результатов. Другие подходящие способы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными препаратами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридиний хлорид; спиртами, такими как изопропиловый и этиловый спирт; различными гистологическими фиксаторами, такими как иодный раствор Люголя, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Хелли (смотри Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967) или обработку комбинацией физического (нагревание) и химического агентов, которые сохраняют и пролонгируют активность токсина, продуцированного в клетке, когда клетку вводят в среду хозяина. Примерами физических методов являются коротковолновое облучение, такое как гамма-облучение, и рентгеновское облучение, УФ-облучение, лиофилизация и тому подобное. Способы обработки клеток микроорганизмов раскрыты в патентах США № 4695455 и 4695462, которые включены в данный документ для сведения.

Как правило, клетки имеют повышенную стабильность структуры, которая повышает устойчивость к воздействию условий окружающей среды. В тех случаях, когда пестицид находится в проформе, то метод обработки клеток следует выбрать таким образом, чтобы не ингибировать процессинг проформы в зрелую форму пестицида под действием патогена вредителя-мишени. Например, формальдегид будет поперечно сшивать белки и может ингибировать процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки должен сохранять, по меньшей мере, значительную часть биологической доступности или биологической активности токсина.

Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина для целей продукции, включают простоту введения Bt-гена или Bt-генов хозяину, доступность экспрессионных систем, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и наличие дополнительных генетических свойств. Характеристики, представляющие особый интерес для применения в качестве микрокапсулы пестицида, включают защитные свойства для пестицида, такие как толщина клеточных стенок, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включения; выживаемость в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для захвата вредителями; простота в индукции гибели и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Другие факторы включают простоту формуляции и обращения, экономические соображения, стабильность при хранении и тому подобное.

Рост клеток. Клетку-хозяин, содержащую инсектицидный Bt-ген или Bt-гены, можно культивировать в любой обычной питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает избирательное преимущество, обеспечивая селективную среду, в которой по существу все или все клетки сохраняют Bt-ген. Затем можно собрать такие клетки с использованием обычных методов. Альтернативно клетки можно обработать до сбора.

Bt-клетки, продуцирующие токсины по изобретению, можно культивировать с использовани