Мутантные полипептиды суаа и производные полипептидов, подходящие для доставки иммуногенных молекул в клетку

Мутантные полипептиды суаа и производные полипептидов, подходящие для доставки иммуногенных молекул в клетку

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые можно применять для доставки одной или более молекулы в клетку.

В частности, настоящее изобретение относится к полипептидам, которые можно применять для доставки одной или более молекулы, способной вызывать иммунный ответ у хозяина, главным образом за счет направленного воздействия на клетки, экспрессирующие рецепторы CD11b/CD18 (которые также упоминаются в настоящей заявке как "клетки, экспрессирующие CD11b").

В частности, настоящее изобретение направлено на полипептиды, полученные на основе белка аденилатциклазы (СуаА), при этом указанные полипептиды применяют либо в форме токсина, либо в форме обезвреженного белка, либо в форме анатоксина, который представляет собой мутантный вариант полипептида. Указанные мутантные полипептиды способны сохранять активность связывания с клетками-мишенями, характерную для природной формы СуаА, и также, предпочтительно, сохраняют способность к транслокации в клетки-мишени с помощью N-концевого домена, характерную для природной формы СуаА, и, кроме того, их порообразующая способность уменьшена или подавлена, по сравнению с природным вариантом токсина СуаА.

Настоящее изобретение относится, в частности, к применению указанных полипептидов в качестве белковых векторов. Соответственно, указанные мутантные варианты полипептидов дополнительно комбинируют с отличными от СуаА молекулами, и таким образом получают производные полипептидов, при этом указанные молекулы важны для превентивной вакцинации и/или терапии при введении хозяину.

Полипептиды согласно настоящему изобретению можно применять в качестве белковых векторов для доставки молекулы, в частности полипептидной молекулы, которая имеет аминокислотную последовательность, включающую один или более эпитоп, в частности антигенов, в клетку, в частности, в клетку, экспрессирующую CD11b.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к полипептидному производному (производному мутантного полипептида согласно настоящему изобретению), которое содержит или состоит из мутантного полипептида согласно настоящему изобретению, объединенного посредством рекомбинации с одной или более молекулами, в частности, с одной или более молекулами, которые способны вызывать иммунный ответ, и таким образом представляет собой рекомбинантный полипептид или слитый полипептид. Изобретение также относится к производным полипептидов, полученным путем химического переноса указанных молекул на мутантные полипептиды.

Согласно одному варианту реализации изобретения, производные полипептидов в соответствии с настоящим изобретением можно применять для профилактического воздействия, в частности, при вакцинации и при терапии, в том числе при иммунотерапии, в частности, для индукции иммунного ответа у пациента.

Природная СуаА, применимая в контексте настоящего изобретения для конструирования полипептидов согласно настоящему изобретению, представляет собой аденилатциклазу, продуцируемую главным образом организмами Bordetella, и в частности Bordetella pertussis, и которая имеет характеристики и свойства, описанные в настоящей заявке с целью охарактеризовать указанный белок в контексте настоящего изобретения.

Бифункциональный токсин-гемолизин RTX семейства аденилатциклаз (обозначаемый в настоящей заявке как токсин аденилатциклазы (СуаА, ACT или AC-Hly) является одним из ключевых факторов вирулентности Bordetella pertussis, которая является возбудителем коклюша (1). Данный полипептид длиной 1706 остатков представляет собой продукт слияния N-концевого домена фермента аденилатциклазы (АЦ, англ. АС) или его части (~400 остатков) с порообразующим гемолизином RTX (Repeat in ToXin cytolysin) размером ~1306 остатков, составляющим С-конец или домен (2). Последний несет сайты активации ргоСуаА с образованием СуаА путем ковалентного посттрансляционного пальмитоилирования ε-аминогруппы Lys⁸⁶⁰ и Lys⁹⁸³, a также многочисленные повторы RTX, формирующие ~40 кальций-связывающих сайтов, загрузка которых необходима для цитотоксической активности СуаА (3, 4). Белок СуаА синтезируются в виде неактивного протоксина, который преобразуется в активный токсин в результате посттрансляционного пальмитоилирования двух внутренних остатков лизина (лизины 860 и 983). Для такой посттрансляционной модификации наряду с экспрессией гена суаА необходима экспрессия вспомогательного гена, а именно суаС, который расположен рядом с суаА на хромосоме B. pertussis.

Указанный токсин, в первую очередь, целенаправленно воздействует на миелоидные фагоциты, экспрессирующие рецептор интегрина α_Mβ₂, известный также как CD11b/CD18, CR3 или Мас-1 (5). Указанный токсин, в частности, связывается с рецептором CD11b/CD18 клеток, экспрессирующих CD11b/CD18, через сайт связывания с рецептором, расположенный в его C-концевой части. Такие клетки, соответственно, представляют собой клетки-мишени для нативного токсина, а также для полипептидов согласно настоящему изобретению. СуаА встраивается в цитоплазматическую мембрану клеток и транслоцирует ферментативный домен АЦ в цитозоль указанной клетки-мишени (6, 7). Внутри клетки АЦ активируется кальмодулином и катализирует неконтролируемое превращение клеточного АТФ в цАМФ, молекулу, представляющую собой ключевой вторичный посредник, в результате чего нарушается бактерицидная функция фагоцитов (1). При высоких дозах (>100 нг/мл) катализируемое СуаА превращение АТФ в цАМФ оказывается цитотоксическим и приводит к апоптозу или даже к быстрой некротической гибели и лизису CD11b⁺ моноцитов (8, 9).

Недавно авторы настоящего изобретения показали, что СуаА связывается с N-связанными олигосахаридами на рецепторе CD11b/CD18 (10). Это факт позволяет предположить, что низкая специфичность взаимодействия с гликанами убиквитарных белков или гликолипидов клеточной поверхности может объяснять сниженную примерно на два порядка, но легко детектируемую способность СуаА проникать также в клетки, не несущие CD11b/CD18. Действительно, как было показано, вследствие чрезвычайно высокой удельной каталитической активности домена АЦ, СуаА существенно увеличивает уровень цАМФ также и в эритроцитах млекопитающих и птиц, в лимфоцитах, в клетках лимфомы, нейробластомы, СНО или в трахеальных эпителиальных клетках (1, 11).

Ранее в данной области техники был предложен обезвреженный токсин, также называемый анатоксином, у которого снижена, в частности, в существенной степени, активность аденилатциклазы. Такой анатоксин СуаА/АС можно применять для получения полипептидов согласно настоящему изобретению.

Помимо увеличения уровня цАМФ, токсин также демонстрирует умеренную гемолитическую активность по отношению к эритроцитам млекопитающих и птиц. Такая активность обусловлена способностью к образованию небольших катион-селективных пор, диаметром, по оценкам, от 0,6 до 0,8 нм, которые пермеабилизируют клеточную мембрану и в конечном итоге приводят к коллоидно-осмотическому лизису клеток (12). Недавно авторами настоящего изобретения и другими исследователями был показан синергетический эффект между порообразующей активностью СуаА и клеточно-инвазивной ферментативной активностью АЦ этого белка, что вносит вклад в общую цитолитическую активность СуаА по отношению к CD11b+ клеткам (13, 14). Благодаря интактной порообразующей (гемолитической) активности, в отсутствие осмопротекторов, таких как сыворотка, ферментативно неактивный анатоксин СуаА/АС^- (15) сохраняет полную гемолитическую активностью по отношению к эритроцитам и остаточную, сниженную примерно в десять раз, цитолитическую активность по отношению к моноцитам, экспрессирующим CD11b (8), что накладывает ограничения на его применение в терапии.

Гемолитическая (порообразующая) активность и способность АЦ к транслокации через мембрану (клеточно-инвазивная активность) СуаА, как было показано ранее, могут быть разобщены при низкой концентрации кальция, низкой температуре (16), а также при определенной степени и характере ацилирования СуаА (4, 12, 17). Более того, эти две активности существенно различаются по чувствительности к заменам глутамата, которые изменяют заряд или являются нейтральными, в положениях 509, 516, 570 и 581 в гидрофобной области (8, 13, 18). Таким образом, было высказано предположение, что клеточно-инвазивная и порообразующая активность СуаА являются независимыми друг от друга и осуществляются параллельно в мембране клеток-мишеней. Модель, показанная на Фигуре 5А, предполагает, что два различных конформера СуаА встраиваются в мембрану клетки-мишени параллельно, при этом один из них является транслоцируемым предшественником, обуславливающим доставку домена АЦ через клеточную мембрану, что сопровождается притоком ионов кальция в клетку, другой является порообразующим предшественником, который определяет формирование олигомерных пор (13, 18, 19).

Авторы настоящего изобретения проверили данную модель и улучшили ее, показав, что порообразующая активность не вовлечена в транслокацию АЦ домена в клетки-мишени.

В настоящем изобретении авторы первоначально разработали мутантные варианты полипептидов СуаА на основе, в частности, аденилатциклазы из Bordetella pertussis, либо в виде токсина, либо анатоксина, несущие комбинации замен в порообразующем домене (E570Q), либо в домене, содержащем сайт ацилирования (K860R), и показали, что данная конкретная комбинация замен специфичным образом устраняет пермеабилизирующую клетки активность СуаА, что приводит к исчезновениюостаточной цитолитической активности анатоксинов СуаА/АС- в отношении клеток CD11b+. В то же время, конструкция E570Q+K860R сохраняет в полной мере способность к транслокации домена АЦ в цитозоль, приводящей к увеличению уровня цАМФ в клетке, и анатоксин на его основе в полной мере способен осуществлять доставку содержащих эпитопы молекул, встроенных в указанную конструкцию, в цитозоль дендритных клеток для опосредованной белками ГКГС I класса презентации и индукции специфических цитотоксических Т-клеточных ответов in vivo.

Мутантный вариант CyaA/233OVA/E570Q+K860R, разработанный авторами настоящего изобретения, со встроенным антигенным пептидом OVA, как описано в примерах, представляет собой первую конструкцию, которая иллюстрирует способность мутантного варианта СуаА обеспечивать значимое снижение способности пермеабилизировать клетки с сохранением при этом в полной мере способности транслоцировать домен АЦ через клеточную мембрану.

Авторы настоящего изобретения разработали конкретные конструкции, например, такие как анатоксин CyaA/E570Q+K860R/AC^-, и показали, что, несмотря на значительное снижение активности по пермеабилизации клеток (цитолитической активности), такой анатоксин в полной мере сохраняет способность доставлять антиген в антигенпрезентирующие клетки (АПК) CD11b⁺. Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что общая цитолитическая активность такого анатоксина, как например, CyaA/E570Q+K860R/AC^- является очень низкой. Таким образом, он лишен остаточной токсичности по отношению к клеткам животного или человека, и поэтому его легко можно применять в терапии.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает новые полипептиды, представляющие собой анатоксины, которые имеют повышенный профиль безопасности и которые можно применять в качестве белковых векторов для доставки представляющих интерес молекул, в частности иммуногенных пептидных последовательностей, в клетки нуждающегося в лечении пациента, и, в частности, в клетки, экспрессирующие CD11b.

На основании экспериментов, проведенных авторами настоящего изобретение, таким образом, стало возможным выявление и получение полипептида, который является мутантным вариантом белка аденилатциклазы (мутантный полипептид), и аминокислотная последовательность которого представляет собой или включает одну из следующих последовательностей:

a) аминокислотную последовательность аденилатциклазы (СуаА) из Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis или Bordetella hinzii, в которую внесены следующие мутации:

(i) замена остатка глутаминовой кислоты в положении 570 на остаток глутамина (E570Q) или консервативный аминокислотный остаток, а также

(ii) замена остатка лизина в положении 860 на остаток аргинина (K860R) или консервативный аминокислотный остаток, или;

b) аминокислотную последовательность фрагмента аденилатциклазы из Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis или Bordetella hinzii, причем указанный фрагмент обладает способностью белка СуаА из Bordetella pertussis связываться с клеткой-мишенью и способностью транслоцировать N-концевой домен фермента аденилатциклазы или его часть в указанную клетку, при этом указанный фрагмент также содержит следующие измененные аминокислотные остатки, расположенные в положениях 570 и 860 в указанной аденилатциклазы: E570Q и K860R, или

c) аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, определенной в пункте а) или b), заменой и/или вставкой одной или более аминокислоты, и которая обладает способностью белка СуаА из Bordetella pertussis связываться с клеткой-мишенью и способностью транслоцировать N-концевой домен фермента аденилатциклазы или его часть в указанную клетку, при этом указанная аминокислотная последовательность также содержит следующие измененные аминокислотные остатки, расположенные в положениях 570 и 860 в указанной аденилатциклазе: E570Q и K860R, или

d) аминокислотную последовательность аденилатциклазы (СуаА) из Bordetella parapertussis, в которую внесены следующие мутации:

(i) замена остатка глутаминовой кислоты в положении 569 на остаток глутамина (E569Q) или консервативный аминокислотный остаток, а также

(ii) замена остатка лизина в положении 859 на остаток аргинина (K859R) или консервативный аминокислотный остаток, или;

e) аминокислотную последовательность фрагмента аденилатциклазы из Bordetella bronchisepticai, причем указанный фрагмент обладает способностью белка СуаА из Bordetella pertussis связываться с клеткой-мишенью и способностью транслоцировать N-концевой домен фермента аденилатциклазы или его часть в указанную клетку, при этом указанный фрагмент также содержит следующие измененные аминокислотные остатки, расположенные в положениях 569 и 859 в указанной аденилатциклазе: E569Q и K859R, или

f) аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности, определенной в пункте d) или е), аменой и/или вставкой одной или более аминокислоты, и которая обладает способностью белка СуаА из Bordetella pertussis связываться с клеткой-мишенью и способностью транслоцировать N-концевой домен фермента аденилатциклазы или его часть в указанную клетку, при этом указанная аминокислотная последовательность также содержит следующие измененные аминокислотные остатки, расположенные в положениях 569 и 859 в указанной аденилатциклазе: E569Q и K859R.

Для целей настоящего изобретения, N-концевой домен описанного фрагмента представляет собой аминокислотную последовательность фрагмента, которая включает в себя последовательно расположенные аминокислотные остатки N-концевой части природного белка СуаА, например, N-концевая часть фрагмента представляет собой полностью или частично последовательные остатки, составляющие последовательность из 400 аминокислотных остатков N-концевого домена белка СуаА Bordetella pertussis.

В настоящей заявке "E570Q" охватывает замену остатка глутаминовой кислоты в положении 570 нативной СуаА из Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis или Bordetella hinzii на остаток глутамина или на другой консервативный остаток, в частности, остаток, размер боковой цепи которого и гидрофильные свойства близки таковым у глутаминовой кислоты. Остаток глутаминовой кислоты в положении 570 предпочтительно замещен аминокислотным остатком, выбранным из Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp.

В настоящей заявке "K860R" охватывает замену остатка лизина в положении 860 нативной СуаА из Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis или Bordetella hinzii на остаток аргинина или на другой консервативный остаток, в частности, остаток, размер боковой цепи которого и гидрофильные свойства близки таковым у лизина. Указанный остаток лизина в положении 860 предпочтительно замещен аминокислотным остатком, выбранным из Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, Ile.

В настоящей заявке "E569Q" охватывает замену остатка глутаминовой кислоты в положении 569 нативной СуаА из Bordetella bronchiseptica на остаток глутамина или другой консервативный остаток, в частности, остаток, размер боковой цепи которого и гидрофильные свойства близки к таковым у глутаминовой кислоты. Указанный остаток глутаминовой кислоты в положении 569 предпочтительно замещен аминокислотным остатком, выбранным из Gln, Asn, Met, Thr, Ser, Gly, Arg, Lys, Val, Leu, Cys, Ile, Asp.

В настоящей заявке "K859R" охватывает замену остатка лизина в положении 859 нативной СуаА из Bordetella bronchiseptica на остаток аргинина или другой консервативный остаток, в частности, остаток, размер боковой цепи которого и гидрофильные свойства близки к таковым у лизина. Указанный остаток лизина в положении 859 предпочтительно замещен аминокислотным остатком, выбранным из Arg, Asn, Gln, Met, Thr, Ser, Gly, Val, Leu, Cys, Ile.

В вариантах реализации, описанных ниже, мутантные белки СуаА Bordetella pertussis или фрагменты таких белков, несущие замены "E570Q" и "K860R", могут быть заменены мутантными белками СуаА Bordetella parapertussis или Bordetella hinzii или фрагментами таких белков, несущими замены, эквивалентные "E570Q" и "K860R", или мутантными белками СуаА Bordetella bronchiseptica или фрагментами таких белков, несущих замены, эквивалентные "E569Q" и "K859R".

Последовательность аминокислот и нуклеотидная последовательность нативной СуаА из Bordetella pertussis также была описана в работе Glaser, P. et al., 1988, Molecular Microbiology 2(1), 19-30. Данная последовательность обозначена как SEQ ID №1, как показано на фигуре 6. Соответственно, при упоминании аминокислотных остатков или последовательностей или нуклеотидов или нуклеотидных последовательностей белка СуаА В. pertussis в настоящем изобретении, их положения указаны относительно последовательностей, описанных в упомянутой публикации Glaser et al. 1988.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения аминокислотная последовательность аденилатциклазы Bordetella pertussis представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID №1.

Следует подчеркнуть, что при упоминании в настоящей заявке SEQ ID №1 или SEQ ID №2, если это уместно с технической точки зрения, описываемые характеристики аналогичным образом относятся к последовательности, модифицированной в результате вставки остатков в SEQ ID №1 и SEQ ID №2 с целью детоксикации (обезвреживания) белка СуаА. В таком случае, нумерацию аминокислотных остатков необходимо откорректировать (в частности, когда речь идет о положениях 570 и 860 нативной последовательности).

Предпочтительно, белок СуаА или его фрагмент представляет собой белок или его фрагмент, который является результатом совместной экспрессии в клетке, в частности, в рекомбинантной клетке, обоих генов - суаА и суаС. Действительно, было показано, что для приобретения инвазивных свойств по отношению к клеткам-мишеням белок СуаА должен пройти посттрансляционные модификации, для осуществления которых необходима экспрессия как суаА, так и суаС гена (WO 93/21324).

В конкретном варианте реализации изобретения белок СуаА представляет собой бактериальный белок. В предпочтительном варианте реализации изобретения белок СуаА получен из вида Bordetella.

Одним из видов Bordetella, представляющих интерес в соответствии с настоящим изобретением, является Bordetella pertussis. Другими штаммами Bordetella, представляющими интерес, являются Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii или Bordetella bronchiseptica. Последовательность белка СуаА из В. parapertussis, в частности, описана под номером доступа NC 002928.3 (в виде последовательности из 1740 аминокислот) и в работе Parkhill J. et al. (Nat. Genet. DOI, 10 (2003)), последовательность из В. hinzii описана в работе Donate G.M. et al. (J. Bacteriol. 2005 Nov. 187(22):7579-88), a последовательность из В. bronchiseptica - в работе Betsou F. et al (Gene 1995, August 30; 162(1):165-6). Последовательность из Bordetella parapertussis описана под номером доступа САВ76450 и обозначена в настоящей заявке как SEQ ID №7, как показано на Фигуре 14. Последовательность из Bordetella hinzii описана под номером доступа AAY57201 и обозначена в настоящей заявке как SEQ ID №8, как показано на Фигуре 15. Последовательность из Bordetella bronchiseptica описана под номером доступа САА85481 и обозначена в настоящей заявке как SEQ ID №9, как показано на Фигуре 16. Соответственно, при упоминании в настоящем изобретении аминокислотных остатков или последовательностей белка СуаА из Bordetella parapertussis, Bordetella hinzii или Bordetella bronchiseptica, их положения указаны относительно последовательностей, представленных в SEQ ID №7, 8 и 9, соответственно.

Выражение "мутантный пептид белка аденилатциклазы" не охватывает нативную аденилатциклазу, экспрессируемую Bordetella. Как указано выше, упомянутый мутантный полипептид характеризуется основным отличием от природного белка, которое заключается в комбинированной замене двух конкретных аминокислотных остатков. Такой мутантный полипептид может быть дополнительно модифицирован, по сравнению с указанным нативным белком, и, в частности, может представлять собой фрагмент такого мутантного белка, например, укороченный вариант указанного мутантного белка, в котором удалены остатки на одном или на обоих концах. В частности, могут быть удалены остатки на С-конце, при условии, что такая делеция не затрагивает сайт узнавания и сайт связывания клеточного рецептора CD11b/CD18. В качестве альтернативы или дополнения, могут быть удалены остатки на N-конце, при условии, что такая делеция не влияет на транслокационную способность полученного мутантного полипептида Также фрагмент может быть получен после удаления одного или более внутренних остатков мутантного варианта нативного белка СуаА.

Если изобретение относится к мутантному полипептиду, который представляет собой фрагмент, как указано в настоящем описании, указанный фрагмент, который обязательно включает в себя измененные остатки E570Q и K860R (при отсылке на аминокислотную последовательность белка СуаА из Bordetella pertussis), также сохраняет способность мутантного полноразмерного белка СуаА связываться с клетками и транслоцировать N-концевой домен в цитозоль клеток-мишеней, в частности, клеток, экспрессирующих CD11b/CD18.

Изобретение обеспечивает, таким образом, мутантные полипептиды, которые можно применять для разработки средств доставки одной или более молекул в клетки, в частности, в клетки-мишени, экспрессирующие рецептор CD11b/CD18.

В частности, изобретение обеспечивает мутантные полипептиды на основе белка СуаА, где указанный белок либо получен на основании токсина СуаА или предпочтительно получен на основании его анатоксина, в частности, анатоксина СуаА/АС^-. Мутантные полипептиды, способные связываться с клеткой, в частности, с клеткой-мишенью, в частности, с клеткой-мишенью, экспрессирующей рецептор CD11b/CD18, способны траснлоцировать свой N-концевой домен или молекулы, встроенные в указанный домен, или пересаженные на него, в клетку, и при этом порообразующая активность таких мутантных полипептидов полностью или частично подавлена, по сравнению с токсином или анатоксином СуаА.

Способность мутантного полипептида целенаправленно воздействовать на клетки CD11b/CD18 можно проанализировать, в частности, с помощью методики, описанной в ЕР 03291486.3, в работе EI-Azami-EI-Idrissi M. et al., J. Biol. Chem., 278 (40) 38514-21 или в международной публикации WO 02/22169. Кроме того, способность мутантного полипептида транслоцировать эпитоп (эпитопы) или полипептид (полипептиды), содержащий указанный эпитоп (эпитопы), в цитозоль клетки-мишени может быть проанализирована с помощью методики, описанной в WO 02/22169.

Полное или частичное подавление порообразующей активности или клеточно-пермеабилизирующей способности токсина или анатоксина СуаА следует понимать как полное или частичное подавление способности образовывать поры, в частности, катион-селективные поры диаметром по оценкам от 0,6 до 0,8 нм, которые пермеабилизируют клеточную мембрану и в конечном итоге вызывают коллоидно-осмотический лизис клеток. Порообразующую активность можно измерить с помощью исследования методом локальной фиксации потенциала ("пэтч-кламп") всей клетки, как описано в примерах.

Порообразующая активность токсина СуаА вносит свой вклад в общую цитолитическую или гемолитическую активность по отношению к клеткам. Действительно, в контексте настоящего изобретения, под общей цитолитической или гемолитической активностью СуаА (или его "общей цитотоксической активностью") следует понимать результирующую активность, включающую, по меньшей мере, аденилатциклазную и порообразующую активность токсина СуаА. Таким образом, полное или частичное подавление порообразующей активности токсина СуаА обеспечивает, по меньшей мере, частичное подавление его цитолитической активности.

В предпочтительном варианте реализации общая цитолитическая активность полипептида согласно настоящему изобретению, в частности, по отношению к клеткам, которые экспрессируют рецепторы CD11b/CD18, полностью или частично подавлена, по сравнению с токсином СуаА из Bordetella pertussis. Цитолитичесую активность полипептида согласно настоящему изобретению можно определить путем измерения количества гемоглобина (для эритроцитов) или лактатдегидрогеназы (для моноцитов), высвобождаемых клетками при инкубации с тестируемым полипептидом, как описано в примерах.

В предпочтительном варианте реализации общая цитолитическая активность полипептида согласно настоящему изобретению по отношению к клеткам, которые экспрессируют рецептор CD11b/CD18, снижена по меньшей мере на 75%, желательно по меньшей мере на 80%, 85%, 90% или 95%снижена, по сравнению с активностью токсина СуаА из Bordetella pertussis или белка СуаА Bordetella pertussis, аденилатциклазная активность которого частично или полностью подавлена (или "анатоксин СуаА"). В предпочтительном варианте реализации общая цитолитическая активность полипептида согласно настоящему изобретению по отношению к клеткам, которые экспрессируют рецептор CD11b/CD18, снижена по меньшей мере на 75%, желательно по меньшей мере на 80% или 85% по сравнению с активностью анатоксина СуаА из Bordetella pertussis, аминокислотная последовательность которого представлена на фигуре 2 (SEQ ID №2).

В предпочтительном варианте реализации настоящее изобретение относится к полипептиду, представляющему собой мутантный вариант аденилатциклазы, аминокислотная последовательность которого представляет собой или состоит из аминокислотной последовательности (последовательностей), измененной (мутированной), по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID N°1 таким образом, что аминокислотная последовательность указанного мутантного варианта содержит замены E570Q и K860R, при этом указанный полипептид способен связываться с клеткой-мишенью и способен транслоцировать свой N-концевой домен в клетку.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент, который содержит замену остатка глутаминовой кислоты в положении 570 из SEQ ID №1 на остаток глутамина (упоминаемую как "E570Q"), и замену остатка лизина в положении 860 из SEQ ID №1 на остаток аргинина (упоминаемую как "K860R"), включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность белка СуаА, которая начинается с первого N-концевого остатка или с одного из аминокислотных остатков, находящихся между положениями 1 и 400, предпочтительно, положениями от 1 до 380, и продолжается до остатков, формирующих сайт узнавания и сайт связывания клеточного рецептора CD11b/CD18, и при этом указанный фрагмент содержит остатки, соответствующие измененным остаткам E570Q и K860R, или состоит из указанной аминокислотной последовательности. В конкретном варианте реализации фрагмент, содержащий замены E570Q и K860R, не содержит последовательность аминокислот, начиная от аминокислоты в положении 1 из SEQ ID №1 до аминокислоты в положении 372 из SEQ ID №1.

В предпочтительном варианте реализации изобретения фрагмент, сконструированный таким образом, по существу лишен ферментативной активности аденилатциклазы (активности АЦ).

В предпочтительном варианте реализации мутантный полипептид согласно настоящему изобретению получен путем совместной экспрессии в рекомбинантных клетках измененного (мутантного) гена, кодирующего аминокислотную последовательность мутантной СуаА с заменами E570Q и R860R, и гена суаС с последующим выделением выбранных экспрессируемых фрагментов мутантной СуаА.

Предпочтительно мутантный полипептид согласно настоящему изобретению содержит остаток лизина, соответствующий остатку лизина в положении 983 аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1, который ацилирован, в частности, пальмитоилирован или пальмитолеилирован.

Предпочтительно мутантный полипептид соласно настоящему изобретению содержит остаток лизина, соответствующий остатку лизина в положении 983 из аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1, который не ацилирован.

В конкретном варианте реализации мутантный полипептид согласно изобретению имеет аминокислотную последовательность, полученную на основе аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1, в результате мутации остатков приводящей к заменам E570Q и K860R, и имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID №1.

В другом конкретном варианте реализации мутантный полипептид согласно настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности СуаА, соответствующей SEQ ID №1, в результате мутации остатков приводящей к заменам E570Q и K860R, и в результате дополнительных мутаций, приводящим к от 1 до 500, в частности, к от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 25, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10 или от 1 до 5 заменам, делециям и/или вставкам аминокислотных остатков, включая замены E570Q K860R.

В конкретном варианте реализации мутантный полипептид согласно настоящему изобретению не несет никаких замен, делеций и/или вставок остатков аминокислот, по сравнению с аминокислотной последовательностью СуаА из Bordetella pertussis, кроме замен E570Q и K860R. В конкретном варианте реализации мутантный полипептид имеет последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID №2, как показано на Фигуре 7. В другом конкретном варианте настоящего изобретения единственные дополнительные замены, делеций и/или вставки аминокислот, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID №2, включают замены, делеций и/или вставки аминокислот, которые полностью или частично подавляют ферментативную активность аденилатциклазы белка СуаА, например, в частности, вставка дипептида, например, дипептида "LQ", или "GS" между аминокислотами в положениях 188 и 189.

В конкретном варианте реализации мутантный полипептид согласно настоящему изобретению отличается от аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 заменами, делециями и/или вставками аминокислотных остатков в дополнение к заменам E570Q и K860R.

В конкретном варианте реализации в дополнение к заменам E570Q и K860R остаток лейцина в положении 247 нативного белка СуаА из Bordetella pertussis замещен на остаток глутамина (L247Q) или другой аминокислотный остаток, в частности, консервативный аминокислотный остаток.

Мутантный полипептид согласно настоящему изобретению, который представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID №1, как описано в настоящей заявке, следует понимать как последовательность, включающую один или более фрагмент, имеющий по меньшей мере от примерно 350 аминокислотных остатков до примерно 1705 аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности SEQ ID №1, в частности, фрагмент, включающий участок по меньшей мере из 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 аминокислотных остатков из SEQ ID №1, содержащий остатки E570Q и K860R. Мутантный полипептид согласно настоящему изобретению можно также определить как фрагмент аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID №2, который включает один или более фрагмент, имеющий по меньшей мере от примерно 350 аминокислотных остатков до примерное 1705 аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности SEQ ID №2, в частности, фрагмент, включающий участок из по меньшей мере 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600 аминокислотных остатков из SEQ ID №2, содержащий остатки 570 и 860. Указанные фрагменты предпочтительно сохраняют способность связываться с рецептором CD11b/CD18 клеток и способностью транслоцировать свой N-концевой домен в клетки-мишени. Предпочтительно мутантный полипептид согласно настоящему изобретению, представляющий собой такой фрагмент, содержит участок из аминокислот, включающий аминокислотные остатки с 570, в виде E570Q по 860 в виде K860R, или с 1 по 860, или со 2 по 860 из SEQ ID №1, при условии, что мутации E570Q и K860R содержатся в исходной последовательности SEQ ID №1.

В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения указанный фрагмент дополнительно включает аминокислотные остатки с 1166 по 1281 или аминокислотные остатки с 1208 по 1243 из аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1 белка СуаА, для взаимодействия с клетками-мишенями CD11b/CD18.

Конкретный фрагмент, таким образом, включает весь С-концевой участок, или его часть, нативного белка, при этом указанный участок отвечает за связывание полипептида согласно настоящему изобретению с мембраной клетки-мишени и/или рецептором CD11b/CD18, а также за последующую доставку N-концевого домена полипептида в цитозоль клетки. Конкретный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой фрагмент белка СуаА, содержащий аминокислотные остатки с 373 до 1706 из белка СуаА, в частности, SEQ ID №1, при этом остатки 570 и 860 изменены как E570Q и K860R.

В другом предпочтительном варианте реализации мутантный полипептид, который представляет собой такой фрагмент, включает:

а) первую аминокислотную последовательность, которая соответствует участку по меньшей мере из 100 последовательных аминокислотных остатков из SEQ ID №1, включающему аминокислотный остаток 570 в виде E570Q, и дополнительно включающий 0, 1, 2, 3, 4 или 5 делеции, замены или вставки, по сравнению с SEQ ID №1 и

б) вторую аминокислотную последовательность, которая соответствует участку по меньшей мере из 100 последовательных аминокислотных остатков из SEQ ID №1, включающему аминокислотный остаток 860 в виде K860R, и дополнительно включающий 0, 1, 2, 3, 4 или 5 делеции, замены или вставки, по сравнению с SEQ ID №1 и

в) третью аминокислотную последовательность, включающую аминокислотные остатки с 1166 по 1281 или аминокислотные остатки с 1208 по 1243 из аминокислотной последовательности СуаА, представленной в SEQ ID №1 белка СуаА, для взаимодействия с клетками-мишенями CD11D/CD18.

Другой конкретный полипептид согласно настоящему изобретению представляет собой фрагмент, который соответствует мутантному белку СуаА с заменами E570Q и K860R, в котором удалены аминокислотные остатки с 225 по 234, в результате чего получен фрагмент, содержащий остатки с 1 по 224 и с 235 по 1706 из последовательности мутантного белка.

В особенно предпочтительном варианте реализации полипептидный фрагмент согласно настоящему изобретению связывается с клеткой, экспрессирующей рецепторы CD11D/CD18, посредством специфичного связывания с указанным рецептором.

В предпочтительном варианте реализации аденилатциклазная активность указанного полипептида в клетке полностью или частично подавлена, по сравнению с токсином СуаА из Bordetella pertussis. Как указано выше, термин "белок СуаА "относится к соответствующему белку либо в форме токсина, либо в форме анатоксина. Соответственно, каждый вариант реализации изобретения, относящийся к полипептиду, представляющему собой мутантный белок СуаА, относится к соответствующему белку либо в форме токсина, либо в форме анатоксина.

Полное или частичное подавление аденилатциклазной или ферментативной активности СуаА следует понимать как полное, или частичное подавление способности преобразовывать АТФ в цАМФ в клеточной среде, по сравнению с токсином СуаА, продуцируемым в результате совместной экспрессии генов суаА и суаС в клетке. Способность преобразования АТФ в цАМФ можно оценить с помощью измерения уровня внутриклеточного цАМФ, как описано в примерах.

Такое