Модификация рекомбинантного аденовируса иммуногенными эпитопами белка circumsporozoite плазмодия

Модификация рекомбинантного аденовируса иммуногенными эпитопами белка circumsporozoite плазмодия

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИОРИТЕТ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет и представляет собой частичное продолжение международной заявки № PCT/US09/054212 от 18 августа 2009 года, которая полностью включена, как если бы она была полностью приведена в настоящем описании.

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ИССЛЕДОВАНИИ, ФИНАНСИРУЕМОМ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА

[0002] Настоящее изобретение было сделано при поддержке государства в рамках Гранта №1R01AI081510-01A1 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), учреждения, которое входит в состав Национальных институтов здоровья. Государство обладает определенными правами на настоящее изобретение.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] Настоящее изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Более конкретно, изобретение относится к применению векторов на основе аденовирусов с модифицированным капсидом для индукции эффективного иммунного ответа на антиген малярийных плазмодиев, такой как белок circumsporozoite плазмодия, который пригоден для получения вакцин от малярии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Малярия - тяжелое заболевание, которое входит в число наиболее распространенных инфекций в тропических областях. Ежегодно инфицируется приблизительно 300-500 миллионов людей, и относительно высок процент заболеваемости и смертности. Протекание с осложнениями и смертность особенно характерны для молодых людей и взрослых, попадающих в эндемические области малярии и ранее не переносивших малярию. По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) 2-3 миллиона детей ежегодно умирает от малярии в одной только Африке. Широкое распространение и возрастающая во многих странах частота возникновения малярии, вызываемой резистентными к лекарственным препаратам плазмодиями (Plasmodium falciparum, а в последнее время также Plasmodium vivax) и устойчивыми к инсектицидам переносчиками (малярийный комар), указывают на необходимость разработки новых способов борьбы с данным заболеванием (Nussenzweig and Long 1994).

[0005] Малярийные плазмодии отличаются сложным жизненным циклом, который включает преэритроцитарные, эритроцитарные и половые формы паразитов; их жизненный цикл является потенциальной мишенью для разработки вакцин от малярии. Преэритроцитарные и эритроцитарные формы обнаруживаются в организме хозяина, а половые формы существуют в организме переносчика инфекции. Было показано, что вакцинация живыми, ослабленными облучением спорозоитами (IrSp) вызывает стерильную защиту (например, полная резистентность в отношении инфицирования плазмодиями) у мышей (Nussenzweig et al. 1967), приматов, не являющихся человеком (Gwadz et al. 1979), и у людей (Clyde et al. 1973, Edelman et al. 1993). Защита, обеспечиваемая IrSp, обусловлена нейтрализацией спорозоитов за счет развития как гуморального (В-лимфоциты), так и клеточного (Т-лимфоциты) иммунного ответа (Tsuji et al. 2001). Хотя вакцинация IrSp являет собой привлекательное решение, единственный способ получения спорозоитов - это вскрытие слюнных желез комара, и к настоящему времени технология выращивания большого количества спорозоитов in vitro не известна. Следовательно, требуется альтернативный вектор для вакцинации, который может обеспечивать такой же сильный защитный иммунитет против малярии.

[0006] Одной из перспективных мишеней для создания такого вектора вакцины является белок circumsporozoite (CS), который экспрессируется на поверхности спорозоита. Эффективные нейтрализующие антитела направлены против иммунодоминантных, видоспецифичных повторяющихся доменов белка circumsporozoite (CS). У Plasmodium falciparum (паразит, вызывающий малярию у человека), повторы (NANP)_n являются консервативными в изолятах из всех регионов мира. Этот центральный повтор содержит множественные повторы эпитопов, распознаваемых В-лимфоцитами, и, соответственно, белок CS может вызывать сильный гуморальный иммунный ответ, запуская реакцию В-лимфоцитов (Tsuji et al. 2001). В области С-конца белка CS имеется несколько эпитопов, распознаваемых Т-лимфоцитами, которые могут вызывать сильный клеточный иммунный ответ (Tsuji et al. 2001). Гуморальный ответ (антитела) может приводить к уничтожению паразитов в результате взаимодействия и нейтрализации инфицирующей способности спорозоитов (внеклеточного плазмодия) до попадания в гепатоцит, а клеточный ответ (ответ Т-лимфоцитов) может быть направлен на EEF (внутриклеточные формы плазмодия) за счет секреции интерферона-гамма. Указанные виды иммунного ответа предотвращают созревание и быстрое деление EEF, в ходе которых образуются тысячи спорозоитов, возвращающихся в кровь и инфицирующих эритроциты, вызываемое заболевание, определяемое как малярия.

[0007] Было показано, что одна из вакцин от малярии, которая в настоящее время проходит клинические испытания и представляет собой химерный белок RTS, S «GlaxoSmithKline», составленный из поверхностного антигена вируса гепатита В и части белка circumsporozoite плазмодия falciparum (PfCSP) в форме вирусоподобной частицы (Заявка на Международный патент № РСТ/ЕР 1992/002591 для компании «SmithKline Beecham Biologicals S.A.» от 11 ноября 1992 г.), уменьшает инфицирование малярией в клинических исследованиях (Alonso et al. 2004, Alonso et al. 2005, Bejon et al. 2008). RTS, S вызывает развитие анти-PfCSP гуморального иммунного ответа, но относительно слабый PfCSP-специфичный клеточный ответ (CD8+) (Kester et al. 2008), что может послужить причиной относительно слабой защиты, обеспечиваемой RTS, S. Напротив, вакцины от малярии на основе аденовируса могут вызывать защитный клеточный иммунный ответ (Заявка на Международный патент № РСТ/ЕР2003/051019, от 16 декабря 2003 г., Rodrigues et al. 1997). Однако в настоящее время существуют два препятствия, ограничивающие применение системы на основе аденовируса в качестве вакцины против малярии: (1) неспособность вызывать эффективный гуморальный ответ на трансгенный продукт, и (2) предсуществующий иммунитет на аденовирусы, в частности, на аденовирус серотипа 5, который снижает иммуногенность вакцины на основе аденовируса.

[0008] Один из подходов, которые недавно были взяты на вооружение работах по повышению вызываемого аденовирусом иммунного ответа, состоит во встраивании эпитопа антигена, распознаваемого В-лимфоцитами (например, эпитопа бактерии или вируса) в белки капсида аденовируса, такие как гексон, белок нити, пентон и pIX (Worgall et al. 2005, McConnell et al. 2006, Krause et al. 2006, Worgall et al. 2007).

[0009] Кроме того, чтобы обойти проблему предсуществующего иммунитета на аденовирус серотипа 5 (Ad5), в качестве платформы для вакцины исследовали аденовирусы других, менее распространенных серотипов, такие как 11, 35, 26, 48, 49 и 50, и было показано, что они вызывают иммунный ответ на трансген, несмотря на наличие анти-Ad5 иммунитета (Заявка на Международный патент № РСТ/ЕР2005/055183 Crucell Holland B.V., от 12 октября 2005 г., Abbink et al. 2007). Также, чтобы обойти проблему предсуществующего анти-Ad5-иммунитета была разработана замена гексона Ad5, который является целевым белком капсида для нейтрализующих антител, на гексоны других серотипов (Wu et al. 2002, Roberts et al. 2006).

[0010] Однако сведений об улучшенном векторе на основе аденовируса, который позволял бы преодолеть оба указанных препятствия одновременно при применении вектора на основе аденовируса для получения вакцины против малярии, в настоящее время нет. В связи с высоким распространением серотипа Ad5 высоко в областях, эндемических по малярии (Ophorst et al. 2006), возникает потребность в противомалярийной вакцине на основе аденовируса, которая вызывает защитный гуморальный и клеточный иммунный ответ, даже при наличии предсуществующего иммунитета к аденовирусу.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Настоящее описание относится к различным модификациям белков аденовируса, направленным на увеличение иммунного ответа на трансген рекомбинантной аденовирусной вакцины и на преодоление предсуществующего иммунитета к аденовирусу.

[0012] Более конкретно, один вариант реализации относится к рекомбинантному аденовирусу, полученному из плазмидного вектора на основе рекомбинантного аденовируса, причем плазмидный вектор на основе рекомбинантного аденовируса содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую (i) белок circumsporozoite плазмодия или его антигенную часть, функционально связанную с гетерологичным промотором; и (ii) модифицированный белок капсида или сердцевины, причем иммуногенный эпитоп circumsporozoite плазмодия встроен по меньшей мере в часть одного белка капсида и/или сердцевины или замещает указанную часть.

[0013] Согласно некоторым вариантам реализации белок circumsporozoite плазмодия также включает белок circumsporozoite Plasmodium falciparum или Plasmoclium yoelii. Белок circumsporozoite также может включать белок с оптимизацией кодонов circumsporozoite Plasmodium falciparum или Plasmodium yoelii, и согласно некоторым аспектам может кодироваться последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:1, соответственно.

[0014] Согласно другим вариантам реализации иммуногенный эпитоп также включает эпитоп circumsporozoite плазмодия, распознаваемый В-лимфоцитами. Эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, может быть встроен в модифицированный белок капсида, и согласно некоторым аспектам белок капсида может включать гипервариабельный участок гексона (HVR). HVR может также включать HVR1 или HVR5, в которых часть HVR1 или HVR5 заменена эпитопом, распознаваемым В-лимфоцитами. Согласно другим аспектам белок капсида может также включать белок нити капсида, в котором эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, встроен в белок нити. Согласно некоторым аспектам эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, представляет собой белок circumsporozoite Plasmodium falciparum, в котором эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, представляет собой последовательность повтора, например, (NANP)_n (SEQ ID NO:60), причем последовательностью повтора может представлять собой (NANP)₄, (NANP)₆, (NANP)₈, (NANP)₁₀, (NANP)₁₂, (NANP)₁₄, (NANP)₁₆, (NANP)₁₈, (NANP)₂₀, (NANP)₂₂ или (NANP)₂₈. Согласно другому аспекту эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, представляет собой эпитоп белка circumsporozoite Plasmodium yoelii, в котором эпитоп, распознаваемый В-лимфоцитами, представляет собой последовательность повтора, например, (QGPGAP)_n (SEQ ID NO:59), причем последовательностью повтора может представлять собой (QGPGAP)₃, (QGPGAP)₄, (QGPGAP)₅, (QGPGAP)₆, (QGPGAP)₇, (QGPGAP)₈, (QGPGAP)₉, (QGPGAP)₁₁, или (QGPGAP)₁₂.

[0015] Согласно другим вариантам реализации иммуногенный эпитоп также включает эпитоп circumsporozoite плазмодия, распознаваемый CD4+ или CD8+Т-лимфоцитами. Эпитоп, распознаваемый CD4+ или CD8+Т-лимфоцитами, может быть встроен в модифицированный белок капсида или сердцевины. Согласно некоторым аспектам белок капсида может включать гипервариабельный участок гексона (HVR). HVR может также содержать HVR1, в котором часть HVR1 замещена эпитопом, распознаваемым CD4+ или CD8+Т-лимфоцитами. Согласно другим аспектам белок капсида может также включать белок pVII, и эпитоп, распознаваемый CD4+ или CD8+Т-лимфоцитами, введен в белок pVII. Согласно некоторым аспектам эпитоп, распознаваемый CD4+Т-лимфоцитами, представляет собой белок circumsporozoite Plasmodium falciparum, причем эпитоп, распознаваемый CD4+Т-лимфоцитами, представляет собой EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:62). Согласно другим аспектам эпитоп, распознаваемый CD4+Т-лимфоцитами, представляет собой эпитоп белка circumsporozoite Plasmodium yoelii, причем эпитоп, распознаваемый CD4+Т-лимфоцитами, представляет собой YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK (SEQ ID NO:61).

[0016] Другие варианты реализации относятся к фармацевтической композиции или композиции вакцины против малярии, включающей рекомбинантный аденовирус в соответствии с вариантами реализации, перечисленными выше. Дополнительные варианты реализации включают способ лечения, профилактики или диагностики малярии, включающий введение терапевтического количества фармацевтической композиции или композиции вакцины против малярии в соответствии с вариантами реализации, перечисленными выше.

[0017] Согласно еще одному варианту реализации предложен способ лечения, включающий проведение первичной-поддерживающей вакцинации, при которой субъекту вводят серию возрастающих доз или одинаковых доз через заданные периоды времени. Периоды времени могут быть любой продолжительности, достаточной для того, чтобы вызвать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Например, как описано ниже, период времени может составлять 3 недели, но не ограничивается этим.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0018] На Фиг.1 приведена структурная схема рекомбинантного аденовируса с модифицированным капсидом в соответствии с вариантами реализации настоящего изобретения.

[0019] На Фиг.2 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК HVR1-модифицированного аденовируса, составляющей рекомбинантный плазмидный вектор на основе HVR1-модифицированного аденовируса.

[0020] На Фиг.3 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК HVR5-модифицированного аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе рекомбинантного HVR5-модифицированного аденовируса.

[0021] На Фиг.4 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК модифицированного по белку нити аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе модифицированного по белку нити рекомбинантного аденовируса.

[0022] На Фиг.5 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК модифицированного по HVR1 и белку нити аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе модифицированного по HVR1 и белку нити аденовируса.

[0023] На Фиг.6 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК модифицированного по белку нити и pVII аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе модифицированного по белку нити и pVII аденовируса.

[0024] На Фиг.7 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК HVR1- и pVII-модифицированного аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе HVR1- и pVII-модифицированного аденовируса.

[0025] На Фиг.8 приведена структурная схема, иллюстрирующая конструкцию ДНК модифицированного по HVR1, белку нити и pVII аденовируса, составляющей плазмидный вектор на основе модифицированного по HVR1, белку нити и pVII аденовируса.

[0026] На Фиг.9 приведена последовательность нуклеиновой кислоты белка circumsporozoite Plasmodium yoelii с оптимизированными кодонами (PyCS, SEQ ID NO:1) и соответствующая последовательность аминокислот (SEQ ID NO:30).

[0027] На Фиг.10 приведена последовательность нуклеиновой кислоты белка circumsporozoite Plasmodium falciparum с оптимизированными кодонами (PfCSP, SEQ ID NO:2) и соответствующая последовательность аминокислот (SEQ ID NO:43).

[0028] На Фиг.11 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего три повтора последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)_n, (SEQ ID NO:59; n=3) в HVR1(SEQ ID NO:3, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:31, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₃ подчеркнута.

[0029] На Фиг.12 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего четыре повтора последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=4) в HVR1(SEQ ID NO:4, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:32, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₄ подчеркнута.

[0030] На Фиг.13 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего пять повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=5) в HVR1(SEQ ID NO:5, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:33, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)5 подчеркнута.

[0031] На Фиг.14 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего шесть повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=6) в HVR1(SEQ ID NO:6, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:34, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₆ подчеркнута.

[0032] На Фиг.15 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего семь повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=7) в HVR1(SEQ ID NO:7, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:35, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₇ подчеркнута.

[0033] На Фиг.16 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего восемь повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=8) в HVR1(SEQ ID NO:8, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:36, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₈ подчеркнута.

[0034] На Фиг.17 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего девять повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=9) в HVR1(SEQ ID NO:9, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:37, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₉ подчеркнута.

[0035] На Фиг.18 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего одиннадцать повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=11) в HVR1(SEQ ID NO:10, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:38, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₁₁ подчеркнута.

[0036] На Фиг.19 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего двенадцать повторов последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=12) в HVR1(SEQ ID NO:11, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:39, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₁₂ подчеркнута.

[0037] На Фиг.20 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего четыре повтора последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=4) в HVR1(SEQ ID NO:12, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:44, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₄ подчеркнута.

[0038] На Фиг.21 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего шесть повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=6) в HVR1(SEQ ID NO:13, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:45, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₆ подчеркнута.

[0039] На Фиг.22 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего восемь повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=8) в HVR1(SEQ ID NO:14, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:46, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₈ подчеркнута.

[0040] На Фиг.23 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего десять повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=10) в HVR1(SEQ ID NO:15, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:47, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₁₀ подчеркнута.

[0041] На Фиг.24 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего двенадцать повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=12) в HVR1 (SEQ ID NO:16, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:48, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₁₂ подчеркнута.

[0042] На Фиг.25 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего четырнадцать повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=14) в HVR1 (SEQ ID NO:17, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:49, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₁₄ подчеркнута.

[0043] На Фиг.26 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего шестнадцать повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=16) в HVR1 (SEQ ID NO:18, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:50, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₁₆ подчеркнута.

[0044] На Фиг.27 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего восемнадцать повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=18) в HVR1 (SEQ ID NO:19, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:51, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₁₈ подчеркнута.

[0045] На Фиг.28 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего двадцать повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=20) в HVR1 (SEQ ID NO:20, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:52, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₂₀ подчеркнута.

[0046] На Фиг.29 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего двадцать два повтора последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=22) в HVR1 (SEQ ID NO:21, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:53, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₂₂ подчеркнута.

[0047] На Фиг.30 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего двадцать восемь повторов последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=28) в HVR1 (SEQ ID NO:22, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:54, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₂₈ подчеркнута.

[0048] На Фиг.31 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного гексона, содержащего три повтора последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=3) в HVR5 (SEQ ID NO:23, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:40, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₃ подчеркнута.

[0049] На Фиг.32 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка нити, содержащего три повтора последовательности эпитопа PyCS, распознаваемого В-лимфоцитами (QGPGAP)n, (SEQ ID NO:59; n=3) в последовательности белка нити (SEQ ID NO:24, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:41, аминокислоты). Встроенная последовательность (QGPGAP)₃ подчеркнута.

[0050] На Фиг.33 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка нити, содержащего четыре повтора последовательности эпитопа PfCSP, распознаваемого В-лимфоцитами (NANP)n, (SEQ ID NO:60; n=4) в последовательности белка нити (SEQ ID NO:25, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:55, аминокислоты). Встроенная последовательность (NANP)₄ подчеркнута.

[0051] На Фиг.34 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка pVII, содержащего последовательность эпитопа PyCS, распознаваемого CD4+-лимфоцитами, YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK, (SEQ ID NO:61) в N-конце pVII (SEQ ID NO:26, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:42, аминокислоты). Встроенная последовательность YNRNIVNRLLGDALNGKPEEK подчеркнута.

[0052] На Фиг.35 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка pVII, содержащего последовательность эпитопа PfCSP, распознаваемого CD4+-лимфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), в С-конце pVII (pVII-1; SEQ ID NO:27, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:56, аминокислоты). Встроенная последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT подчеркнута.

[0053] На Фиг.36 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка pVII, содержащего последовательность эпитопа PfCSP, распознаваемого CD4+-лимфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), перед первым клеточным сигналом внутриядерной локализации (NLS) pVII (pVII-2; SEQ ID NO:28, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:57, аминокислоты). Встроенная последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT подчеркнута.

[0054] На Фиг.37 приведены последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот модифицированного белка pVII, содержащего последовательность эпитопа PfCSP, распознаваемого CD4+-лимфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, (SEQ ID NO:62), между двумя NLS белка pVII (pVII-3; SEQ ID NO:29, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:58, аминокислоты). Встроенная последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT подчеркнута.

[0055] На Фиг.38 показана экспрессия белка PyCS в клетках AD293 после временной трансфекции вектором PyCS-GFP/pShuttle-CMV. Белок PyCS определяли методом вестерн-блоттинга с применением моноклональных анти-PyCS антител мыши (9D3).

[0056] На Фиг.39 показаны результаты окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (А) и твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (В) очищенных рекомбинантных аденовирусов PyCS-GFP с модифицированным капсидом, проводимых для подтверждения встраивания эпитопа (QGPGAP)3 (SEQ ID NO:59; n=3) в белки капсида аденовируса. При проведении ELISA планшеты для ELISA покрывали непосредственно очищенными аденовирусами и определяли встроенный эпитоп в частицах аденовируса при помощи анти-PyCS антитела.

[0057] На Фиг.40 показаны результаты окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (А) и ELISA (В) очищенных рекомбинантных аденовирусов PyCS с модифицированным капсидом, проводимых для подтверждения встраивания эпитопа (QGPGAP)_n (SEQ ID NO:59) в белки капсида аденовируса. При проведении ELISA планшеты для ELISA покрывали непосредственно очищенными аденовирусами, и определяли встроенный эпитоп в частицах аденовируса при помощи анти-PyCS антитела.

[0058] Фиг.41 иллюстрирует режим однократной вакцинации аденовирусами PyCS с модифицированным капсидом, содержащими повторы (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=3, 4, 5, 6, 9, 12) (А), и CD8+-ответ, развивающийся через две недели после вакцинации (В).

[0059] Фиг.42 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации аденовирусами PyCS с модифицированным капсидом, содержащими повторы (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=3) (A), PyCS-специфичные гуморальные ответы к неделе 10 (В), и концентрацию малярийного плазмодия в печени через 42 часа после инфицирования спорозоитом (С).

[0060] На Фиг.43 показан титр антител против спорозоита, определяемый методом непрямого иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) (А) и по нейтрализующей активности в отношении спорозоита in vitro (В) в объединенных пробах сыворотки, полученных от мышей, подвергшихся вакцинации в соответствии с режимом на Фиг.42.

[0061] Фиг.44 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации аденовирусами PyCS с модифицированным капсидом, содержащими повторы (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=4,6) в HVR1(A), PyCS-специфичные гуморальные ответы к неделе 9 (В), концентрацию малярийного плазмодия в печени через 42 часа после инфицирования спорозоитом (С) и нейтрализующую активность в отношении спорозоита in vitro в объединенных пробах сыворотки (D). Мышей вакцинировали с адъювантом или без него.

[0062] Фиг.45 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации аденовирусами PyCS с модифицированным капсидом, содержащими повторы (QGPGAP)n (SEQ ID NO:59, n=6, 9, 12) в HVR1(A), PyCS-специфичные гуморальные ответы к неделе 9 (В), PyCS-специфичные клеточные ответы CD8+Т-лимфоцитовк неделе 9 (С) и концентрацию малярийного плазмодия в печени через 42 часа после инфицирования спорозоитом (D). Мышей вакцинировали с адъювантом или без него.

[0063] На Фиг.46 показана экспрессия белка PfCSP в клетках AD293 после временной трансфекции вектором PfCSP/pShuttle-CMV. Белок PfCSP определяли методом вестерн-блоттинга с применением моноклональных анти-NANP антител мыши (2А10).

[0064] На Фиг.47 показаны результаты окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (А) и ELISA (В) очищенных рекомбинантных аденовирусов PfCSP с модифицированным капсидом, проводимых для подтверждения встраивания эпитопа (NANP)4 (SEQ ID NO:60; n=4) в белки капсида аденовируса. Встроенный эпитоп (NANP)4 (SEQ ID NO:60; n=4) определяли с использованием моноклонального анти-NANP антитела мыши (2А10). При проведении ELISA планшеты для ELISA покрывали непосредственно очищенными аденовирусами.

[0065] На Фиг.48 показаны результаты окрашивания серебром и вестерн-блоттинга (А) и ELISA (В) очищенных рекомбинантных аденовирусов PfCSP с модифицированным капсидом, проводимых для подтверждения встраивания эпитопа (NANP)n (SEQ ID NO:60; n=4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22) в белки капсида аденовируса. При проведении ELISA планшеты для ELISA покрывали непосредственно очищенными аденовирусами, и определяли встроенный эпитоп в частицах аденовируса при помощи анти-PfCSP антитела (2А10).

[0066] Фиг.49 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации рекомбинантным аденовирусами PfCSP с модифицированным капсидом, содержащими (NANP)₄ (SEQ ID NO:60; n=4) (А), и PfCSP-специфичные гуморальные ответы к неделе 9 (В).

[0067] Фиг.50 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации рекомбинантным аденовирусами PfCSP с модифицированным капсидом, содержащими (NANP)_n (SEQ ID NO:60; n=10, 16, 22) в HVR1 (А) и PfCSP-специфичные гуморальные ответы к неделе 9 (В).

[0068] Фиг.51 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации рекомбинантным аденовирусами PfCSP с модифицированным капсидом, содержащими (NANP)n (SEQ ID NO:60; n=4, 6, 8, 10) в HVR1 (А) и PfCSP-специфичные гуморальные ответы к неделе 9 (В). Мышей вакцинировали с адъювантом или без него.

[0069] На Фиг.52 показаны результаты окрашивания серебром очищенного аденовируса с белком нити и белком pVII-, модифицированным повторами (QGPGAP)₃ ((QGPGAP)₃-Fib/CD4-pVII-1/PyCS-GFP) (А) и титр анти-QGPGAP антител к неделе 10 у мышей, вакцинированных (QGPGAP)₃-Fib/PyCS-GFP и (QGPGAP)₃-Fib/CD4-pVII-1/PyCS-GFP, как описано на Фиг.49 (В). Результаты двух независимых экспериментов отложены на графике после нормировки с указанием медиан титров антител в B-Fib/PyCS-GFP-вакцинированной группе.

[0070] На Фиг.53 приведены схематические изображения структуры белков pVII аденовируса с последовательностью эпитопа PfCSP, распознаваемого CD4+-лимфоцитами, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:62), встроенными перед первым клеточным сигналом внутриядерной локализации (NLS) pVII (PfCD4-pVII-2; SEQ ID NO:29, нуклеиновая кислота; SEQ ID NO:58, аминокислоты) (А) и результат окрашивания серебром проводимых для подтверждения встраивания указанного эпитопа в pVII (В).

[0071] Фиг.54 иллюстрирует режим первичной и поддерживающей вакцинации рекомбинантными аденовирусами PfCSP, модифицированными по белкам HVR1 и pVII (А), PfCSP-специфичные гуморальные ответы к неделе 6 (В), PfCSP-специфичные клеточные ответы CD4+Т-лимфоцитов(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT; SEQ ID NO:62) к неделе 9 (С).

[0072] Фиг.55 иллюстрирует нейтрализацию рекомбинантного аденовируса in vitro пробами сыворотки человека. Клетки AD293 инфицировали рекомбинантными аденовирусами в присутствии разведенной сыворотки человека в течение ночи и измеряли экспрессию GFP (зеленого флуоресцентного белка) в качестве маркера инфицирования.

[0073] Фиг.56 иллюстрирует действие иммунитета против аденовируса на индукцию PyCS-специфичного Ответа Т-лимфоцитов на аденовирусы PyCS-GFP с модифицированным капсидом in vivo. На панели (А) приведено краткое описание дизайна исследования. На панели (В) показан PyCS-специфичный CD8+-Ответ Т-лимфоцитов у мышей, вакцинированных диким типом (wt)/«пустым» аденовирусом дважды, и в дальнейшем примированных аденовирусами PyCS-GFP с модифицированным капсидом.

[0074] Фиг.57 иллюстрирует действие иммунитета против аденовируса на индукцию PyCS-специфичного гуморального иммунного ответа на аденовирусы PyCS-GFP с модифицированным капсидом in vivo. На панели (А) приведено краткое описание дизайна исследования. На панели (В) показан PyCS-специфичный гуморальный иммунный ответ у мышей, вакцинированных диким типом (wt)/«пустым» аденовирусом дважды, и далее - двумя дозами аденовирусов PyCS-GFP с модифицированным капсидом.

ПУТИ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ

[0075] Авторы настоящего изобретения обнаружили новый рекомбинантный аденовирус, обладающий новой структурой с модифицированным капсидом, который получают из плазмидного вектора на основе рекомбинантного аденовируса. Указанный рекомбинантный аденовирус способен инфицировать клетки млекопитающих, что вызывает экспрессию белка circumsporozoite Plasmodium указанными клетками. Также указанный рекомбинантный аденовирус содержит один или более белков капсида, которые были модифицированы путем встраивания целевого иммуногенного антигена, такого как эпитоп белка circumsporozoite Plasmodium, распознаваемый В-лимфоцитами или Т-лимфоцитами. Указанный рекомбинантный аденовирус получают путем трансфекции клеток линеаризованным рекомбинантным плазмидным вектором на основе аденовируса. Авторы настоящего изобретения применили полученный рекомбинантный аденовирус для проведения расширенного исследования фармацевтических средств, содержащих в качестве активного ингредиента рекомбинантный аденовирус, обладающий профилактическим и лечебным действием в отношении малярии. В результате авторы настоящего изобретения показали, что полученный рекомбинантный аденовирус обладает желаемым фармацевтическим действием.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0076] В следующем описании приведены конкретные детали для всестороннего объяснения и описания вариантов реализации настоящего изобретения. Однако специалисты в данной области техники понимают, что настоящее изобретение может быть осуществлено без приведенных деталей. В других случаях хорошо известные структуры и функции не были подробно показаны или описаны, чтобы излишне не усложнять описание вариантов реализации настоящего изобретения.

[0077] Сокращения, применяемые для аминокислот, пептидов, последовательностей оснований и нуклеиновых кислот в настоящем описании, основаны на сокращениях, указанных в Договоренности по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB (Международный союз теоретической и прикладной химии - Международный биохимический союз), Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984), "Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences" (Бюро по патентам и товарным знакам США), и соответствуют сокращениям, широко применяемым в данной области техники.

[0078] «Последовательность нуклеотидов», «полинуклеотид» или «молекула ДНК» в настоящем описании могут включать двухцепочечную ДНК или одноцепочечную ДНК (например, смысловую цепь и антисмысловую цепь, составляющие двухцепочечную ДНК) и не ограничены по своей полной длине. Последовательности нуклеотидов, кодирующие иммуногенный чужеродный ген, такой как ген, раскрываемый ниже в настоящей заявке, включают двухцепочечную ДНК, включая геномную ДНК, одноцепочечную ДНК (смысловую цепь), включая кДНК, одноцепочечную ДНК (антисмысловую цепь), обладающую последовательностью, комплементарной к смысловой цепи, и их фрагменты, если не указано другое.

[0079] В настоящем описании термины «последовательности нуклеотидов», «полинуклеотиды» или «молекулы ДНК» не ограничиваются функциональной областью, и могут включать по меньше мере одну область подавления экспрессии, кодирующую область, лидерную последовательность, экзон и интрон. Также примеры последовательностей нуклеотидов в полинуклеотидах могут включать РНК или ДНК. Полипептид, содержащий специфическую последовательность аминокислот, и полинуклеотид, содержащий специфическую последовательность ДНК, может включать фрагменты, гомологи, производные и мутанты полинуклеотида. Примеры мутантов последовательности нуклеотидов или полинуклеотида (такие как мутантная ДНК) включают существующие в природе аллельные мутанты; искусственные мутанты и мутанты, содержащие делеции, замены, присоединения и/или вставки. Очевидно, что такие мутанты кодируют полипептиды, обладающие по существу такой же функцией, что и полипептиды, кодируемые исходным немутированным полинуклеотидом.

[0080] Настоящее изобретение относится к рекомбинантному аденовирусу, который может экспрессировать антигенную детерминанту плазмодия Plasmodium и содержит один или более модифицированных белков капсида и/или сердцевины. Указанный рекомбинантный аденовирус получают из плазмидного вектора на основе рекомбинантного аденовируса. Применение аденовируса в качестве вектора подробно обсуждается далее. Плазмидные векторы на основе рекомбинантного аденовируса, описанные в настоящей заявке, можно применять в качестве вакцины против малярии или фармацевтической композиции, что обеспечивает индукцию как гуморального, так и клеточный иммунного ответа.

[0081] Из известных видов Plasmodium (P.) можно выбрать любой плазмодий вида Plasmodium, например, Р. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, Р. knowlesi, P. berghei, P. chabaudi и Р. yoelii. Согласно некоторым вариантам реализации антигенную детерминанту получают из специфичного для грызунов Plasmodium yoelii или из специфичного для человека Plasmodium falciparum.

[0082] Согласно одному варианту реализации вектор на основе рекомбинантного аденовируса с модифицированным капсидом (также называемый в настоящей заявке вектором на основе рекомбинантного аденовируса) представляет собой плазмиду, которая кодирует и воспроизводит рекомбинантный вирус с модифицированным капсидом и/или сердцевиной (также называемый в настоящей заявке рекомбинантным аденовирусом), обладающий структурой с одним или более модифицированных белков капсида и/или сердцевины. Согласно указанным вариантам реализации настоящего описания модификация белков капсида и/или сердцевины может сопровождаться встраиванием по меньшей мере одного иммуногенного эпитопа белка circumsporozoite Plasmodium. В качестве альтернативы, по меньшей мере часть белка капсида и/или сердцевины может быть делегирована и заменена по меньшей мере одним иммуногенным эпитопом белка circumsporozoi