Регуляция метаболизма с помощью mir-378

Регуляция метаболизма с помощью mir-378

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США с серийным номером 61/351683, поданной 4 июня 2010, которая включена в данный документ ссылкой в ее полноте.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДОСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[002] Содержание текстового файла, предоставленного в электронном виде вместе с данным документом, включено в данный документ ссылкой в его полноте: копия перечня последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: MIRG_022_01WO_SeqList_ST25.txt, дата записи: 6 июня 2011, размер файла 5 килобайт).

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[003] Настоящее изобретение относится к лечению и предотвращению сердечных и метаболических расстройств путем введения средств, которые модулируют активность или экспрессию микроРНК (миРНК). В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или предотвращения сердечных и метаболических расстройств путем ингибирования экспрессии или активности miR-378/miR-378* в клетках субъекта. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ регуляции метаболизма жирных кислот в клетке путем приведения клетки в контакт с модулятором экспрессии или активности miR-378/miR-378*.

ПРЕДПОСЫЛКИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[004] Заболевание сердца и его проявления, включая болезнь коронарной артерии, инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность и гипертрофию сердца, на сегодняшний день явно представляет основной риск для здоровья в Соединенных Штатах. Стоимость диагностики, лечения и поддержки пациентов, страдающих от этих заболеваний, оценивается в миллиарды долларов. Два особенно тяжелых проявления заболевания сердца представляют собой инфаркт миокарда и гипертрофию сердца.

[005] Инфаркт миокарда, широко известный как сердечный приступ, вызывается внезапным и длительным недостатком кровотока к ткани сердца, что обычно приводит к сужению или окклюзии коронарной артерии. Без достаточного кровоснабжения ткань становится ишемической, что ведет к гибели кардиомиоцитов (например, клеток сердечной мышцы) и сосудистых структур. Некротическая ткань, образующаяся в результате гибели кардиомиоцитов, как правило, замещается рубцовой тканью, которая не является сократительной, не может вносить вклад в сердечную функцию и часто играет пагубную роль при функционировании сердца, например, из-за расширения во время сердечного сокращения или из-за увеличения размера и эффективного радиуса желудочка, становясь гипертрофическим.

[006] Гипертрофия сердца представляет собой адаптационную реакцию сердца на практически все формы заболевания сердца, включая таковые, являющиеся результатом гипертензии, механической нагрузки, инфаркта миокарда, сердечных аритмий, эндокринных расстройств и генных мутации в генах сократительных белков сердца. Хотя гипертрофическая реакция изначально представляет собой компенсаторный механизм, который увеличивает сердечный выброс, длительная гипертрофия может привести к дилатационной кардиомиопатии (DCM), сердечной недостаточности и внезапной смерти. В Соединенных Штатах у приблизительно полумиллиона людей диагностируют сердечную недостаточность каждый год с уровнем смертности, достигающим 50%.

[007] Различные пути передачи сигнала, особенно таковые, включающие нарушенную передачу сигнала с помощью кальция, управляют гипертрофией сердца и патологическим ремоделированием (Heineke & Molkentin, 2006). Гипертрофический рост в ответ на стресс включает другие пути передачи сигнала и паттерны генной экспрессии, нежели физиологическая гипертрофия, которая возникает в ответ на физическую нагрузку. Опосредованная стрессом миокардиальная гипертрофия представляет собой сложное явление, связанное с многочисленными неблагоприятными последствиями с отчетливыми молекулярными и гистологическими характеристиками, вызывая фиброз, расширение и декомпенсацию сердца, что при дегенерации и гибели кардиомиоцитов часто завершается сердечной недостаточностью. В связи с этим наблюдается повышенный интерес к расшифровыванию молекулярных механизмов и к обнаружению новых терапевтических мишеней для подавления неблагоприятного роста сердца и, в конечном счете, недостаточности. Понимание этих механизмов является необходимым для разработки новых видов терапии для лечения гипертрофии сердца и сердечной недостаточности.

[008] Метаболический синдром представляет собой комбинацию медицинских расстройств, которые повышают риск развития сердечнососудистого заболевания и диабета. Он поражает каждого пятого человека, и распространенность возрастает с возрастом. Некоторые исследования оценивают распространенность в США как достигающую 25% населения (Ford et al. (2002) JAMA, Vol.287:356-359). Люди, пораженные метаболическим синдромом, являются, как правило, тучными, малоподвижными и имеют определенную степень резистентности к инсулину. Ожирение является ведущей предотвращаемой причиной смерти во всем мире с возрастающей распространенностью у взрослых и детей, и авторитетные источники рассматривают его как одну из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения 21-го века (Barness et al. (2007) Am. J. Med. Genet. A, Vol.143A: 3016-34). Ожирение может приводить к уменьшенной предполагаемой продолжительности жизни и повышенным проблемам со здоровьем, включая заболевание сердца, диабет типа 2, приступы апноэ во сне, определенные типы рака и остеоартрит. Современные виды терапии для метаболического синдрома и ожирения фокусируются на соблюдении диеты и физической нагрузке с очень небольшим количеством доступных эффективных вмешательств с применением фармацевтических средств. Эффективность диеты и физической нагрузки при улучшении этих состояний сильно варьирует среди пациентов и имеет тенденцию к обеспечению лишь средней степени потери веса и улучшения симптомов. Следовательно, существует потребность в новых терапевтических подходах к лечению метаболических расстройств и предотвращению последующего развития сердечнососудистого заболевания и сердечной недостаточности.

[009] Недавно было установлено, что микроРНК вовлечены в ряд биологических процессов, включая временную регуляцию периодов развития, апоптоз, метаболизм жиров и дифференцировку гемопоэтических клеток, среди прочего. МикроРНК (миРНК) представляют собой малые не кодирующие белок РНК длиной от приблизительно 18 до приблизительно 25 нуклеотидов, которые происходят из отдельных генов миРНК, из интронов кодирующих белок генов или из полицистронных транскриптов, которые часто кодируют множественные примыкающие миРНК. Смотри обзор Carrington et al. (Science, Vol.301(5631):336-338, 2003). МиРНК действуют как репрессоры целевых мРНК путем стимулирования их деградации, если их последовательности являются полностью комплементарными, или путем ингибирования трансляции, если их последовательности содержат несовпадения.

[0010] МиРНК транскрибируются РНК-полимеразой II (pol II) или РНК-полимеразой III (pol III; смотри Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology, Vol.3:411-419) и происходят из исходных транскриптов, называемых первичными транскриптами миРНК (при-миРНК), которые, как правило, имеют длину в несколько тысяч оснований. При-миРНК подвергаются процессингу в ядре РНКазой Drosha в от приблизительно 70- до приблизительно 100-нуклеотидные предшественники в форме шпильки (пре-миРНК). После транспортировки в цитоплазму шпилечная пре-миРНК дополнительно подвергается процессингу Dicer с получением двухцепочечной миРНК. Зрелая цепь миРНК затем встраивается в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC), где она связывается с ее целевыми мРНК вследствие комплементарности пар оснований. В относительно редких случаях, когда основания миРНК полностью спариваются с целевой мРНК, она стимулирует деградацию мРНК. Чаще миРНК образуют несовершенные гетеродуплексы с целевыми мРНК, либо отрицательно воздействуя на стабильность мРНК, либо ингибируя трансляцию мРНК.

[0011] Недавно были определены характерные паттерны экспрессии миРНК, связанные с патологической гипертрофией сердца, сердечной недостаточностью и инфарктом миокарда у людей и в мышиных моделях заболевания сердца (van Rooij et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.103(48):18255-60; van Rooij et al., (2007) Science, Vol.316: 575-579). Исследования с использованием мутаций, приводящих к приобретению или потери функций, у мышей выявили сложные и неожиданные функции для этих миРНК в многочисленных аспектах биологии сердца, включая контроль роста миоцитов, сократительную способность, энергетический обмен, фиброз и ангиогенез, обеспечивая некоторые представления о новых регуляторных механизмах и возможных мишени для терапевтического воздействия при заболевании сердца. Удивительно, что нокаутные мыши, у которых отсутствуют индуцирующие заболевание миРНК, являются нормальными, но проявляют искаженные реакции на сердечный стресс, что позволяет предположить ориентированность этих миРНК скорее на связанные с заболеванием процессы, нежели на тканевой гомеостаз, и указывает на их потенциал в качестве терапевтических мишеней. Таким образом, миРНК представляют потенциальные новые терапевтические мишени для разработки видов лечения для ряда заболеваний, включая сердечнососудистые заболевания, ожирение, диабет и другие метаболические расстройства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗБРЕТЕНИЯ

[0012] Настоящее изобретение основано, частично, на том открытии, что экспрессия miR-378 даунрегулируется в ткани сердца после перегрузки давлением и что сверхэкспрессия miR-378 специфическим для сердца образом усиливает сердечную гипертрофическую реакцию, индуцированную стрессом. Сверхэкспрессия miR-378/miR-378* в скелетной мышце приводит к увеличенной массе тела, что является результатом увеличенной массы эпидидимальных жировых подушечек вследствие гипертрофии адипоцитов и, возможно, гиперплазии адипоцитов. Таким образом, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что miR-378/miR-378* регулирует метаболические процессы в различных тканях, включая сердечную и жировую ткань. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения или предотвращения сердечнососудистого заболевания и других метаболических расстройств, таких как ожирение и диабет, путем модулирования экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378* в клетках у субъекта, нуждающегося в этом.

[0013] В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или предотвращения патологической гипертрофии сердца, ремоделирования сердца, инфаркта миокарда или сердечной недостаточности у субъекта, нуждающегося в этом, при котором вводят субъекту ингибитор miR-378 и/или miR-378*. В определенных вариантах осуществления экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* понижается в клетках сердца субъекта после введения. В других вариантах осуществления индуцированный стрессом метаболический сдвиг от окислительного к гликолитическому метаболизму предотвращается или уменьшается в клетках сердца субъекта после введения ингибитора miR-378 и/или miR-378*.

[0014] Настоящее изобретение также включает способ лечения или предотвращения метаболического расстройства у субъекта, нуждающегося в этом. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту ингибитора miR-378 и/или miR-378*, где экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* понижается в клетках субъекта после введения. Метаболическое расстройство, подлежащее лечению, может включать метаболический синдром, ожирение, сахарный диабет, диабетическую нефропатию, резистентность к инсулину, атеросклероз, нарушение обмена липидов, гликогеноз, недостаточность среднецепочечной ацил-коэнзим A дегидрогеназы, окисление липидов или нарушенное поглощение и/или утилизация глюкозы. Вторичные заболевания или состояния, являющиеся результатом этих метаболических расстройств, можно также предотвращать или лечить с помощью способов настоящего изобретения. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения вторичных заболеваний или расстройств, являющихся результатом ожирения, таких как приступы апноэ во сне, рак и остеоартрит, путем введения ингибитора miR-378 и/или miR-378*.

[0015] Ингибиторы miR-378 и miR-378*, пригодные для применения в способах настоящего изобретения, могут быть антисмысловыми олигонуклеотидами. В одном варианте осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере частично комплементарна зрелой последовательности miR-378 или miR-378*. В определенных вариантах осуществления антисмысловые олигонуклеотиды содержат одну или несколько модификаций сахара или остова, такие как «закрытые» нуклеиновые кислоты, бициклические нуклеозиды, фосфоноформиаты, 2'-O-алкильные модификации и фосфоротиоатные связи. В других вариантах осуществления ингибитор miR-378 или miR-378* представляет собой антисмысловой олигонуклеотид длиной от приблизительно 7 до приблизительно 18 нуклеотидов.

[0016] В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ регуляции метаболизма жирных кислот в клетке, при котором приводят в контакт клетку с модулятором экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*. Модулятор может быть ингибитором или агонистом экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*. В определенных вариантах осуществления метаболизм жирных кислот в клетке повышается после контакта с ингибитором miR-378 и/или miR-378* по сравнению с клеткой, не подвергнутой воздействию ингибитора. В других вариантах осуществления метаболизм жирных кислот в клетке понижается после контакта с агонистом miR-378 и/или miR-378* по сравнению с клеткой, не подвергнутой воздействию агониста. Клетка может находиться in vitro или in vivo. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой кардиомиоцит, клетку скелетной мышцы, преадипоцит, адипоцит, гепатоцит или клетку поджелудочной железы.

[0017] Настоящее изобретение также включает способ регуляции метаболизма сердца. В одном варианте осуществления способ включает приведение в контакт кардиомиоцита с модулятором экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*. Кардиомиоцит может находиться in vitro или in vivo. В другом варианте осуществления метаболизм углеводов в кардиомиоците понижается после контакта с ингибитором miR-378 и/или miR-378*. В еще одном варианте осуществления метаболизм жирных кислот в кардиомиоците повышается после контакта с ингибитором miR-378 и/или miR-378*.

[0018] Настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие ингибиторы и агонисты miR-378 и miR-378*, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит ингибитор miR-378 и/или miR-378* и фармацевтически приемлемый носитель, где ингибитор представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию сахара и/или остова. В других вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид имеет длину от приблизительно 7 до приблизительно 18 нуклеотидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0019] Фигура 1. A. Местоположение miR-378 в геноме внутри гена-хозяина PPARGC1β (сверху). Иллюстрация с помощью геномного браузера UCSC консервативности участка генома, окружающего miR-378 (внизу). B. Количественный анализ ПЦР в реальном времени показывает, что miR-378, miR-378*, и PPARGC1β (PGC-1β), ген-хозяин miR-378/miR-378* специфически экспрессируются в сердце, скелетной мышце и бурой жировой ткани. C. miR-378 является более высоко экспрессированным в кардиомиоцитах, чем в сердечных фибробластах. D. Экспрессия miR-378 понижается при обработке HIB1B клеток стеариновой кислотой. E. Экспрессия miR-378 и PPARGC1β (PGC-1β) в ходе индукции дифференцировки адипоцитов. CMC: кардиомиоциты, BAT: бурая жировая ткань, WAT: белая жировая ткань.

[0020] Фигура 2. A. MiR-378 даунрегулируется в сердце после торакальной операции по сужению аорты (TAB) по сравнению с необработанным сердцем (контроли с симуляцией), как показано с помощью количественной ПЦР в реальном времени. B. Миокардиальная сверхэкспрессия miR-378 индуцирует усиленную гипертрофическую реакцию при TAB.

[0021] Фигура 3. Сверхэкспрессия miR-378 в скелетной мышце приводит в результате к увеличенной массе тела и массе эпидидимального жира. На верхних секциях показан гистологический анализ белой жировой ткани из мышей дикого типа (wt) и сверхэкспрессирующих miR-378 под контролем промотора MCK (мышечной креатинкиназы) мышей (MCK-miR-378 Tg). Мутантные животные показывают гипертрофированные адипоциты. На нижних секциях показана увеличенная масса тела и увеличенная массу белого жира у MCK-miR-378 трансгенных мышей по сравнению с мышами дикого типа.

[0022] Фигура 4. Сверхэкспрессия miR-378 в 3T3-L1 клетках усиливает адипогенез и липогенез. 3T3-L1 клетки индуцировали к дифференцировке в зрелые адипоциты в течение 4 суток. Трансфекция miR-378 повышала накопление липидов в клетках, что демонстрируется окрашиванием масляным красным O.

[0023] Фигура 5. MCK-miR-378 трансгенные мыши проявляют пониженную толерантность к глюкозе. Экспрессирующим miR-378 под контролем промотора мышечной креатинкиназы (MCK) мышам (Tg) или однопометным животным дикого типа (wt) вводили инъекцией внутрибрюшинно 1,5 г/кг глюкозы после голодания в течение 16 часов. Уровни глюкозы в крови оценивали в указанные моменты времени.

[0024] Фигура 6. Инъекция antimiR-378 MCK-miR-378 трансгенным мышам улучшает клиренс глюкозы. Экспрессирующим miR-378 под контролем промотора мышечной креатинкиназы (MCK) мышам (Tg) вводили инъекцией внутривенно в течение трех последовательных дней 10 мг/кг антисмыслового олигонуклеотида (antimiR), имеющего последовательность, комплементарную зрелой последовательности miR-378. Мышам дикого типа (wt) вводили инъекцией солевой раствор. Как Tg, так и wt мышам впоследствии вводили инъекцией внутрибрюшинно 1,5 г/кг глюкозы после голодания в течение 16 часов. Уровни глюкозы в крови оценивали в указанные моменты времени (левая секция). Анализ ПЦР в реальном времени для экспрессии miR-378 у Tg и wt мышей, которым вводили инъекцией antimiR-378 или солевой раствор (правые секции).

[0025] Фигура 7. AntimiR-378 инъекция ob/ob мышам улучшает клиренс глюкозы. Страдающим ожирением мышам (ob/ob) вводили инъекцией внутривенно в течение трех последовательных дней 10 мг/кг антисмыслового олигонуклеотида (antimiR), имеющего последовательность, комплементарную зрелой последовательности miR-378. Не получавшим лечение и получавшим лечение с применением antimiR ob/ob мышам вводили инъекцией внутрибрюшинно 1,5 г/кг глюкозы после голодания в течение 16 часов. Уровни глюкозы в крови оценивали в указанные моменты времени.

[0026] Фигура 8. A. Стратегия нацеливания miR-378. Нацеливающий конструкт вводили в геномный локус miR-378 с получением гомологичной рекомбинации. B. Саузерн-блоттинг анализ клеток дикого типа (wt) и нацеленных ES-клеток (MUT). C. Нозерн-блоттинг анализ, проведенный с применением общей РНК от мышей дикого типа (+/+), гетерозиготных (+/-) и нокаутных (-/-) мышей показывает, что экспрессия miR-378 (стрелка) прекращается в полученной мутантной мышиной линии. H: сердце, BAT: бурая жировая ткань, Sk.M: скелетная мышца. D. ПЦР в реальном времени (левая секция) и вестерн-блоттинг анализ (правая секция) ткани сердца, выделенной из мышей WT и нокаутных по miR-378 мышей (KO), показывает, что экспрессия гена-хозяина miR-378, PPARGC1β (PGC-1 β), не изменяется существенно у нокаутных по miR-378 животных.

[0027] Фигура 9. Нокаутные по MiR-378 животные проявляют пониженную гипертрофию сердца в ответ на торакальную операцию по сужению аорты (TAB).

[0028] Фигура 10. Эхокардиографию проводили у мышей дикого типа (WT) и нокаутных по miR-378 мышей (KO) через 21 день после торакальной операции по сужению аорты (TAB) для определения фракциональное укорочение (A), фракция выброса (B), систолический диаметр (C) и диастолический-систолический диаметр (DD-SD) (D).

[0029] Фигура 11. Экспрессия индуцированных стрессом генов, BNP (A), Myh7 (B) и Myh6 (C), в ткани сердца мышей дикого типа (WT) и нокаутных по miR-378 мышей (KO) после торакальной операции по сужению аорты (TAB), которая оценена с помощью ПЦР в реальном времени.

[0030] Фигура 12. Страдающих ожирением мышей (ob/ob) скрещивали с нокаутными по miR-378 животными с получением страдающих ожирением мышей, у которых отсутствует экспрессия miR-378 (ob/ob KO). Страдающим ожирением мышам и ob/ob KO мышам вводили инъекцией внутрибрюшинно 1,5 г/кг глюкозы после голодания в течение 16 часов. Уровни глюкозы в крови оценивали в указанные моменты времени.

[0031] Фигура 13. A. Нокаутные по miR-378 мыши (KO) проявляют меньшую прибавку массы тела, чем животные дикого типа (WT) через несколько недель на рационе с высоким содержанием жиров. B. Через пять недель на рационе с высоким содержанием жиров как нокаутным по miR-378 мышам, так и мышам дикого типа вводили инъекцией внутрибрюшинно 1,5 г/кг глюкозы после голодания в течение 16 часов. Уровни глюкозы в крови оценивали в указанные моменты времени.

[0032] Фигура 14. Нокаутные по miR-378 мыши (KO) имеют уменьшенные жировые подушечки и накопление липидов в печени, чем животные дикого типа (WT) через шесть недель на рационе с высоким содержанием жиров. WAT: белая жировая ткань.

[0033] Фигура 15. Нокаутные по miR-378 мыши (KO) имеют уменьшенную массу жира через шесть недель на рационе с высоким содержанием жиров по сравнению с животными дикого типа (WT). BAT: бурая жировая ткань; WAT: белая жировая ткань.

[0034] Фигура 16. Гистологический анализ белой жировой ткани (WAT), бурой жировой ткани (BAT) и печени из мышей дикого типа (WT) и нокаутных по miR-378 мышей (KO) после шести недель режима питания с рационом с высоким содержанием жиров. Увеличение: 40X.

[0035] Фигура 17. Мыши, сверхэкспрессирующие miR-378/miR-378* в ткани сердца под контролем промотора тяжелой цепи альфа-миозина (α-MHC TG), имеют увеличенную массу тела (A) и проявляют большее увеличение массы тела на рационе с высоким содержанием жиров (B и C) по сравнению с однопометными животными дикого типа (WT).

[0036] Фигура 18. A. Вестерн-блоттинг анализ бурой жировой ткани, выделенной из мышей дикого типа (WT) и нокаутных по miR-378 мышей (KO) через шесть часов после голодания. Блоты зондировали с помощью антител, специфичных к фосфорилированным и нефосфорилированным формам AMPK (АМФ-активируемая протеинкиназа) и AKT (протеинкиназа В). Альфа-тубулин использовали в качестве контроля. B. Схематическое изображение, показывающее регуляцию метаболизма с помощью сигнальных путей, опосредованных AMPK и AKT.

[0037] Фигура 19. A. Схематическое изображение 3'-UTR (нетранслируемая область) MED13, изображающее предполагаемые сайты связывания для miR-378/miR-378*. B. Уровни экспрессии MED13 у животных дикого типа (WT), трансгенных по miR-378 животных (αMHC Tg), сверхэкспрессирующих miR-378 под контролем промотора αMHC, и нокаутных по miR-378 животных (KO). C. COS1 клетки трансфицировали люциферазным конструктом 3'-UTR MED13, вместе с плазмидами экспрессии для miR-378 и контрольной миРНК. Показанные значения представляют собой кратность изменения экспрессии люциферазы (±SEM) по сравнению с репортером отдельно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗБРЕТЕНИЯ

[0038] Хронический и острый стресс в отношении сердца приводит в результате к патологической реакции ремоделирования, сопровождаемой гипертрофией, фиброзом, апоптозом миоцитов и возможной смерти от недостаточности нагнетательной функции сердца и аритмий. Хотя классические стратегии фармакологического лечения (например, бета-блокаторы и ACE-ингибиторы) могут продлевать срок жизни пациентов с сердечной недостаточностью, эти виды терапии являются, в конечном счете, неэффективными при предотвращении развития заболевания, подчеркивая потребность в новом понимании механизмов действия и терапевтических подходах.

[0039] Сердечная недостаточность представляет собой прогрессирующее длительное заболевание, которое, как оценено, поражает 5,7 миллионов американцев с возрастающими связанными затратами на здравоохранение (Lloyd-Jones et al. (2009) Circulation, Vol.119:21-181). МиРНК недавно выступили в качестве важных молекулярных компонентов при гипертрофии и ремоделировании в сердце, таким образом, представляя перспективную мишень при профилактике и лечении заболевания сердца. Так как отдельные миРНК часто регулируют экспрессию множества целевых генов со связанными функциями, модулирование экспрессии одной миРНК может, в принципе, влиять на целую генную сеть и, тем самым, модифицировать сложные фенотипы заболевания.

[0040] Настоящее изобретение основано, отчасти, на открытии того, что миРНК высоко экспрессируется в богатых митохондриями тканях сердца, скелетных мышц и бурой жировой ткани и регулируется при различных болезненных состояниях сердца. В частности, авторы настоящего изобретения неожиданно открыли, что miR-378 и его соответствующая минорная последовательность, miR-378*, являются регуляторами общего метаболизма. MiR-378 играет роль в индуцированной стрессом гипертрофической реакции сердца через регуляцию метаболизма сердца и вовлечена в утилизацию глюкозы и метаболизм жирных кислот в скелетной мышце. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения различных сердечных и метаболических расстройств у субъекта путем ингибирования экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378* в клетках субъекта.

[0041] Как используется в данном документе, выражение «субъект» или «пациент» относится к любому позвоночному, включая, без ограничения, людей и других приматов (например, шимпанзе и другие виды высших и низших приматов), сельскохозяйственных животных (например, крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади), домашних млекопитающих (например, собаки и кошки), лабораторных животных (например, грызуны, такие как мыши, крысы и морские свинки) и птиц (например, домашние, дикие и пернатая дичь, такие как цыплята, индюки и другие куриные, утки, гуси и подобное). В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее. В других вариантах осуществления субъект представляет собой человека.

[0042] MiR-378 кодируется на мышиной хромосоме 18, в пределах первого интрона гена коактиватора 1-бета гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, (PPARGC1β). У людей miR-378 (ранее имеющая название miR-422b) экспрессируется из первого интрона гена PPARGC1β на хромосоме 5. Последовательность пре-миРНК для miR-378 подвергается процессингу в зрелую последовательность и последовательность со сзвездочкой (т.е. минорную). Последовательность со звездочкой подвергается процессингу из другой ветви структуры «стебель-петля». Пре-миРНК (например, последовательности «стебель-петля»), зрелые последовательности и последовательности со звездочкой для miR-378 мыши и человека представлены ниже:

Зрелая miR-378 человека (SEQ ID NO: 1)

5'-ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G-3'

MiR-378* человека (SEQ ID NO: 2)

5'-CUCCUGACUC CAGGUCCUGU GU-3'

Пре-miR-378 человека (SEQ ID NO: 3)

5'-AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUAGAAAUA GCACUGGACU UGGAGUCAGA AGGCCU-3'

Зрелая miR-378 мыши (SEQ ID NO: 4)

5'-ACUGGACUUG GAGUCAGAAG G-3'

MiR-378* мыши (SEQ ID NO: 5)

5'-CUCCUGACUC CAGGUCCUGU GU-3'

Пре-miR-378 мыши (SEQ ID NO: 6)

5'-AGGGCUCCUG ACUCCAGGUC CUGUGUGUUA CCUCGAAAUA GCACUGGACU UGGAGUCAGA AGGCCU-3'

[0043] Понятно, что все последовательности рибонуклеиновой кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть превращены в последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты путем замещения тимидинового основания на уридиновое основание в последовательности. Аналогично, все последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, раскрытые в данном документе, могут быть превращены в последовательности рибонуклеиновой кислоты путем замещения уридинового основания на тимидиновое основание в последовательности. Последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты, последовательности рибонуклеиновой кислоты и последовательности, содержащие смеси дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов всех последовательностей, раскрытых в данном документе, включены в настоящее изобретение.

[0044] В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ лечения или предотвращения патологической гипертрофии сердца, ремоделирования сердца, инфаркта миокарда или сердечной недостаточности у субъекта, нуждающегося в этом, при котором вводят субъекту ингибитор miR-378 и/или miR-378*. В некоторых вариантах осуществления экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* понижается в клетках сердца субъекта после введения ингибитора. «Клетки сердца», как используется в данном документе, включают кардиомиоциты, сердечные фибробласты и сердечные эндотелиальные клетки. В одном конкретном варианте осуществления экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* понижается в кардиомиоцитах субъекта после введения ингибитора miR-378 и/или miR-378*.

[0045] В другом варианте осуществления субъект, нуждающийся в этом, может иметь риск развития патологической гипертрофии сердца, ремоделирования сердца, сердечной недостаточности или инфаркта миокарда. Такой субъект может проявлять один или несколько факторов риска, включая без ограничения длительную неконтролируемую гипертензию, легочную артериальную гипертензию, некорректированный порок клапанов, хроническую ангину, недавний инфаркт миокарда, врожденную предрасположенность к заболеванию сердца или патологической гипертрофии. Субъект с таким риском может быть диагностирован, как имеющий генетическую предрасположенность к гипертрофии сердца, или может иметь семейную историю гипертрофии сердца. В некоторых вариантах осуществления у субъекта с риском может быть диагностировано ожирение, диабет типа II, гиперлипидемия или метаболический синдром.

[0046] Предпочтительно, введение ингибитора miR-378 и/или miR-378* субъекту приводит к облегчению одного или нескольких симптомов гипертрофии сердца, сердечной недостаточности или инфаркта миокарда у субъекта, или к задержке перехода от гипертрофии сердца к сердечной недостаточности. Один или несколько облегченных симптомов могут представлять собой, например, увеличенную способность к физической нагрузке, увеличенный объем сердечного выброса, пониженное конечно-диастолическое давление левого желудочка, пониженное давление заклинивания легочных капилляров, повышенный сердечный выброс, повышенный сердечный индекс, пониженные давления в легочной артерии, пониженные конечно-систолические и диастолические размеры левого желудочка, уменьшенный фиброз сердца, пониженное отложение коллагена в сердечной мышце, пониженное напряжение стенки левого и правого желудочков, пониженное растяжение стенки, повышенное качество жизни и пониженную распространенность болезни и смертность, связанные с заболеванием.

[0047] Настоящее изобретение также включает способ лечения или предотвращения метаболического расстройства у субъекта, нуждающегося в этом. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту ингибитора miR-378 и/или miR-378*, где экспрессия или активность miR-378 и/или miR-378* в клетках субъекта после введения понижается. Метаболические расстройства, которые можно лечить с помощью способов настоящего изобретения, включают без ограничения метаболический синдром, ожирение, сахарный диабет, диабетическую нефропатию, резистентность к инсулину, атеросклероз, нарушение липидного обмена (например, болезнь Ниманна-Пика, болезнь Гоше, болезнь Фарбера, болезнь Фабри, болезнь Вольмана и болезнь накопления сложных эфиров холестерина), синдром поликистозных яичников (PCOS) или нарушенные поглощение и/или утилизацию глюкозы. В одном варианте осуществления метаболическое расстройство представляет собой гликогеноз (GSD). Например, способы настоящего изобретения обеспечивают лечение или предотвращение любого из типов GSD (например, GSD типа 0 и GSD типа I до GSD типа XIII) у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения субъекту ингибитора miR-378 и/или miR-378*. GSD включают без ограничения болезнь фон Гирке, болезнь Помпе, болезнь Кори или болезнь Форбса, болезнь Андерсена, болезнь Мак-Ардла, болезнь Герса, болезнь Таруи, синдром Фанкони-Бикеля и недостаточность альдолазы в эритроцитах. В другом варианте осуществления метаболическое расстройство представляет собой недостаточность среднецепочечной ацил-коэнзим A дегидрогеназы (MCAD). Индивиды с недостаточностью MCAD показывают ухудшение окисления жирных кислот, которое может быть смертельным. В одном варианте осуществления настоящего изобретения метаболизм жирных кислот у субъекта, имеющего недостаточность MCAD, повышается после введения ингибитора miR-378 и/или miR-378*.

[0048] Настоящее изобретение также включает способ предотвращения или лечения вторичных заболеваний или состояний, которые являются результатом метаболических расстройств, таких как диабет и ожирение, путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, ингибитора miR-378 и/или miR-378*. Например, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения приступов апноэ во сне, при котором вводят субъекту, нуждающемуся в этом, ингибитор miR-378 и/или miR-378*. В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения рака путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, ингибитора miR-378 и/или miR-378*. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения остеоартрита путем введения субъекту, нуждающемуся в этом, ингибитора miR-378 и/или miR-378*.

[0049] В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ повышения поглощения и/или утилизации глюкозы у субъекта, нуждающегося в этом, при котором субъекту вводят ингибитор активности или экспрессии miR-378 и/или miR-378*. В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностируют резистентность к инсулину или сахарный диабет. В одном варианте осуществления уровень глюкозы в крови субъекта понижается после введения ингибитора miR-378 и/или miR-378* по сравнению с уровнем глюкозы в крови субъекта перед введением ингибитора. В другом варианте осуществления уровень глюкозы в крови субъекта понижается до пределов нормальных уровней, что измеряют с помощью пробы пероральной толерантности к глюкозе после введения ингибитора miR-378 и/или miR-378*. Например, в определенных вариантах осуществления уровень глюкозы в крови субъекта натощак составляет менее приблизительно 110 мг/дл. В других вариантах осуществления уровень глюкозы в крови субъекта через 2 часа после приема внутрь глюкозы составляет менее приблизительно 140 мг/дл.

[0050] Настоящее изобретение также обеспечивает способ регуляции метаболизма жирных кислот в клетке. В одном варианте осуществления способ включает приведение клетки в контакт с модулятором экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*. Как используется в данном документе, «модулятор» представляет собой молекулу, которая регулирует экспрессию или активность miR-378 и/или miR-378*. Модуляторы могут быть агонистами функции miR-378 и/или miR-378* (т. е. усиливать активность или экспрессию miR-378 или miR-378*), или они могут быть ингибиторами функции miR-378 и/или miR-378* (т. е. понижать активность или экспрессию miR-378 или miR-378*). Модуляторы могут включать белки, пептиды, полипептиды, полинуклеотиды, олигонуклеотиды или малые молекулы. Модуляторы экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378* включают ингибиторы и агонисты miR-378 и/или miR-378*, которые описаны в данном документе. В определенных вариантах осуществления модулятор представляет собой ингибитор экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*, и метаболизм жирных кислот в клетке повышается после контакта с ингибитором miR-378 и/или miR-378* по сравнению с клеткой, не подвергнутой воздействию ингибитора. В других вариантах осуществления модулятор представляет собой агонист экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*, и метаболизм жирных кислот понижается в клетке после контакта с агонистом miR-378 и/или miR-378* по сравнению с клеткой, не подвергнутой воздействию агониста. Клетка может присутствовать in vitro или in vivo. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой, но не ограничиваясь, кардиомиоцит, клетку скелетной мышцы, преадипоцит, адипоцит, гепатоцит или клетку поджелудочной железы.

[0051] В одном конкретном варианте осуществления клетка представляет собой кардиомиоцит. Таким образом, настоящее изобретение также включает способ регуляции метаболизма сердца путем приведения кардиомиоцита в контакт с модулятором экспрессии или активности miR-378 и/или miR-378*. В одном варианте осуществления приведение кардиомиоцита в контакт с ингиб