Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

Реферат

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящий пункт формулы изобретения свидетельствует в пользу предварительной заявки U.S. № 61/289692, которая была подана 23 декабря 2009 года и включена сюда в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам активации дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, настоящее изобретение относится к способам увеличения экспрессии генов NGN3 и NKX6.1 в популяциях клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса для трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.

Во время эмбрионального развития позвоночных плюрипотентные клетки порождают группу клеток, создающих три зародышевых листка (эктодерма, мезодерма и эндодерма) в процессе, известном как гаструляция. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из эндодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией данного процесса является образование дефинитивной эндодермы. Дефинитивные эндодермальные клетки экспрессируют множество маркеров, таких как HNF-3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.

Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной эндодермы в панкреатическую эндодерму. Клетки панкреатической эндодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, Pdx1. При отсутствии Pdx1 развитие поджелудочной железы не идет дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической эндодермы.

Клетки, несущие черты островковых клеток, как сообщается, были получены in vitro из эмбриональных клеток мышей. Например, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщил о дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в продуцирующие инсулин структуры, схожие с островками поджелудочной железы. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщил о инсулинпродуцирующих клетках, полученных из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые могли нормализовать содержание сахара в крови при их имплантации мышам со стрептозотоцин-индуцированным диабетом.

В одном примере Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) описывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.

В другом примере Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщил о создании инсулинпродуцирующих клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши, которые постоянно экспрессировали Pax4.

В публикации Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать Pdx1-положительную панкреатическую эндодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию PDX1 при добавлении в культуру на четвертый день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).

В публикации Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией Pdx1. Их результаты показали, что экспрессия экзогенного Pdx1 несомненно повышает экспрессию инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в полученных дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).

В публикации Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (Pdx1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Они также наблюдали, что уровень экспрессии инсулина и мРНК Pdx1 не зависел от ретиноевой кислоты; однако обработка 3nM FGF7 привела к повышению содержания транскриптов Pdx1 (Biochem. j. 379: 749, 2004).

В работе Shiraki et al. изучались эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в Pdx1-положительные клетки. Эти авторы наблюдали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли Pdx1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16.).

Gordon et al. показали индукцию brachyury [положительных ]/ HNF3 бета [положительных] эндодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши при отсутствии сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнального пути Wnt (США 2006/0003446A1).

Gordon et al. (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) сообщил, что “Сигнальные пути Wnt и TGF-бета/nodal/активина одновременно были необходимы для формирования передней первичной полоски.”

Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах может не имитировать в точности программу развития у высших млекопитающих, например у человека.

В работе Thomson et al. эмбриональные стволовые клетки выделяли из человеческих бластоцист (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцировке которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека должны культивироваться в очень специфических условиях (патент США № 6200806, WO 99/20741, WO 01/51616).

D'Amour et al. описывают производство обогащенных культур дефинитивной эндодермы, производной от человеческих эмбриональных стволовых клеток, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцировке в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной эндодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, могут подвергаться дальнейшей дифференцировке в Pdx1-положительные клетки после добавления FGF-10 (US 2005/0266554A1).

D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) сообщили: “Мы разработали процесс дифференцировки, который позволяет превращать человеческие эмбриональные клетки (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать такие гормоны поджелудочной железы, как инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный процесс имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через фазы, напоминающие образование дефинитивной эндодермы, эндодермы кишечной трубки, панкреатической эндодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны”.

В другом примере, в публикации Fisk et al., сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (US2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала человеческие эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы до эндодермы с помощью сочетания бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировались с антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином с получением Pdx1-положительных клеток. Окончательное дифференцировка запускалось никотинамидом.

В одном примере Benvenistry et al. сообщили: “Мы считаем, что чрезмерная экспрессия PDX1 усиливает экспрессию различных генов поджелудочной железы, индукция экспрессии инсулина может требовать дополнительных сигналов, которые присутствуют только in vivo” (Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930).

В другом примере Grapin-Botton et al. сообщили: “Ранняя активация Ngn3 почти исключительно индуцирует глюкагон [положительные] клетки, что истощает пул клеток-предшественниц поджелудочной железы. Начиная с E11.5, PDX-1 предшественницы получили возможность дифференцироваться в инсулин [положительные] и PP [положительные] клетки” (Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457-465, March 2007).

Экспрессия NGN3 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы, может снизить способность клеток к дальнейшей дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Предыдущие исследования показали, что эти клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальной клеточной линии поджелудочной железы и NGN3, при последующей дифференцировке более склонны к преобразованию в глюкагонпродуцирующие клетки, чем в инсулинпродуцирующие. Однако экспрессия NGN3 требуется для формирования эндокринных клеток поджелудочной железы или их предшественниц (клеток, которые могут превращаться, например, в глюкагон- или инсулинпродуцирующие клетки). Поэтому временная регуляция NGN3 важна для определения дальнейшей судьбы предшественниц эндокринных клеток поджелудочной железы с целью их преобразования в инсулинпродуцирующие клетки.

Поэтому все еще существует существенная необходимость в разработке условий для создания линий плюрипотентных стволовых клеток, которые могут быть использованы для удовлетворения текущих клинических потребностей, сохраняя при этом возможность к дифференцировке в инсулинпродуцирующие клетки. Настоящее изобретение предлагает альтернативный подход к повышению эффективности дифференциации человеческих эмбриональных стволовых клеток в инсулинпродуцирующие клетки при помощи способа усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:

a) культивирование плюрипотентных стволовых клеток,

b) дифференциация плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий,

c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивных эндодермальных клеточных линий, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, при помощи добавления в среду, используемую для дифференциации клеток, экспрессирующих маркеры, характерныедля дефинитивных эндодермальных клеточных линий, соединений, выбранных из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и

d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеточных линий поджелудочной железы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в среду, используемую для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндодермальных клеточных линий поджелудочной железы, добавляется соединение, выбранное из группы, состоящей из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для ясности описания, а не в ограничение изобретения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.

Определения

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из нескольких зародышевых листков (эндодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от нескольких зародышевых листков, и вносить существенный вклад в формирование большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

Стволовые клетки классифицируются по своему потенциалу развития на: (1) тотипотентные, способные к порождению всех эмбриональных и экстраэмбриональных видов клеток; (2) плюрипотентные, способные к порождению всех эмбриональных видов клеток; (3) мультипотентные, способные к порождению субпопуляций клеточных линий в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтическая стволовая клетка (HSC) может образовывать предшественниц, которые могут включать HSC (в целях самообновления), олигопотентных предшественниц клеток крови и все виды клеток и элементов крови (например, тромбоциты), которые являются нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, способные порождать более ограниченные субпопуляции клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные породить одну клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).

Дифференцировка представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцировкам представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцировки до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или набора типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцировкой называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцировки. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцировки клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркером, специфичным для линии дифференцировки, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцировки, которая может использоваться для оценки дифференцировки некоммитированных клеток в клетки данной линии дифференцировки.

Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF-3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-одобный гомеобокс белок типа Mix, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, относятся клетки-предшественники первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезэндодермы и клетки дефинитивной эндодермы.

Используемый в настоящей заявке термин «клетки с экспрессией маркеров, характерных для линии панкреатической эндодермы» относится к клеткам с экспрессией по меньшей мере одного из следующих маркеров: PDX1, HNF1-бета, PTF1-альфа, HNF6, NKX6.1 или HB9. К клеткам, экспрессирующим маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, относятся клетки панкреатической эндодермы, клетки первичной кишечной трубки и клетки поздней передней кишки.

Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная эндодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной эндодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 beta, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.

Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.

Использованные здесь термины “эндокринная клетка поджелудочной железы”, или “экспрессирующая гормоны клетка поджелудочной железы "относятся к клеткам, способным экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.

Выделение, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток

Характеристика плюрипотентных стволовых клеток

Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадийно-специфичных эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначенными как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференциация плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспресии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при их наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которая может быть обнаружена путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, Burlingame Calif.). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ПЦР в реальном времени.

Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Полипотентность полипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида, и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В качестве альтернативы плюрипотентность можно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа их на предмет присутствия маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.

Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза (G-banding) и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т. е. эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.

Источники плюрипотентных стволовых клеток

К типам полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся стабильные линии полипотентных клеток, получаемых из ткани, образующейся после беременности, в том числе, из преэмбриональной ткани (такой, как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в ходе беременности, как правило, но не обязательно, до срока около 10-12 недель беременности. Примерами, не ограничивающими настоящее изобретение, являются стабильные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток или человеческих эмбриональных зародышевых клеток, например, клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке составов в ходе первоначального установления или стабилизации таких клеток, в этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей- источников. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Также соответствуют целям настоящего изобретения клетки мутантных линий эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Атенс, Джорджия, США).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются в соответствии с методикой, описанной Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).

Культивирование плюрипотентных стволовых клеток

В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные клетки в различных отношениях. Как вариант, полипотентные стволовые клетки культивируются в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию полипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. В качестве альтернативы рост плюрипотентных стволовых клеток в свободной от питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.

Например, Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) and Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) открыли культуру клеточной линии плюрипотентных стволовых клеток из человеческой бластоцисты при помощи слоя питающих фибробластов эмбриона мыши.

Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценил набор из 11 различных зрелых, фетальных и неонатальных питающих клеток человека по их способности поддерживать жизнедеятельность клеточной культуры плюрипотентных стволовых клеток. Richards et al, сообщил: “клеточные линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированные на зрелых питающих фибробластах кожи, сохраняют морфологию человеческих эмбриональных стволовых клеток и остаются плюрипотентными”.

В заявке на патент США № 20020072117 описываются линии клеток, продуцирующие среду, осуществляющую поддержку полипотентных стволовых клеток приматов в культуре, не содержащей питающих клеток. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимо- и фибробластоподобные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США № 20020072117 также описывается использование этих клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.

В другом примере Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005) описывают способы длительного выращивания человеческих плюрипотентных стволовых клеток на слоях питающих клеток, полученных из человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005) описывают систему питающих клеток, получаемую в результате спонтанного дифференцирования человеческих эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004) описывают получение питающих клеток из человеческой плаценты.

Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческой крайней плоти.

В другом примере Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005) описывают слой питающих клеток, полученных из человеческих фибробластов постнатальной крайней плоти.

В патенте США № 6642048 описывается среда, поддерживающая рост полипотентных стволовых клеток приматов (пПС) в среде, не содержащей питающих клеток, и клеточные линии, которые могут использоваться для производства такой среды. В патенте США № 6642048 сообщается: “Это изобретение включает мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В документе описываются и иллюстрируются способ получения таких клеточных линий, обработки среды и выращивания стволовых клеток с применением кондиционированной среды”.

В другом примере, заявке на патент WO2005014799, описывается кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В патенте WO2005014799 сообщается: “Культуральная среда, произведенная в соответствии с настоящим изобретением, обуславливает секреторную активность клеток мыши; В частности, эти дифференцированные и иммортализованные трансгенные гепатоциты, названные MMH (Met-гепатоциты мыши)”.

В другом примере, Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004) описывают кондиционированную среду, полученную из производных человеческих эмбриональных стволовых клеток, генетически модифицированных для увеличения экспрессии обратной транскриптазы человеческой теломеразы.

В другом примере, заявке на патент США № 20070010011, описывается культуральная среда определенного химического состава для поддержания полипотентных стволовых клеток.

В альтернативной культуральной системе используется не содержащая сыворотки среда, обогащенная факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, Cheon et al (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описывают не содержащую питающих клеток и сыворотки культуральную систему, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток.

В другом примере Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006) описывают способы длительного культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды, с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF).

В другом примере, в патенте США № 20050148070 описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток на определенной среде без сыворотки и фибробластных питающих клеток, этот способ состоит из: культивирования стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минералы, по меньшей мере один трансферрин или его заменитель, по меньшей мере один инсулин или его заменитель; в культуральной среде фактически отсутствует эмбриональная сыворотка млекопитающих и она содержит по меньшей мере 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способствующего активации сигнального рецептора фактора роста фибробластов, в то время как этот фактор роста поступает не из слоя питающих фибробластов, а из другого источника; среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без использования питающих клеток или кондиционированной среды.

В другом примере, в патенте США № 20050233446 описывается среда, которая может использоваться для культивирования стволовых клеток, включая недифференцированные примордиальные стволовые клетки приматов. Клетки из раствора, представленного фактически изотонической средой, сравнивались с культивированными стволовыми клетками. В данной культуре указанная среда содержит основную среду и количество bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста зародышевых стволовых клеток без существенной дифференцировки.

В другом примере, патенте США № 6800480, говорится “В одном варианте осуществления предлагается культуральная среда для выращивания клеток зародышевых стволовых клеток приматов, в значительной степени в недифференцированном состоянии, включающая основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. Основная среда объединяется с питательной сывороткой, способной поддерживать рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, включающей питающие клетки и экстраклеточный матрикс, полученный из питающих клеток. Среда также содержит аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, содержащей нуклеозиды и соль-пируват”.

В другом примере, патенте США № 20050244962 сообщается: “В одной особенности изобретения предлагается методика культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируются в культуре, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки млекопитающих (предпочтительно, также, в основном, не содержащей эмбриональной сыворотки любых животных) и в присутствии фактора роста фибробластов, полученного из источника, иного чем просто питающие клетки-фибробласты. В предпочтительной форме, слой питающих фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится необязательным вследствие добавления достаточного количества фактора роста фибробластов”.

В еще одном примере, патенте WO2005065354 описывается определенная изотоническая культурная среда, в которой фактически отсутствуют питающие клетки и эмбриональная сыворотка, эта среда состоит из: a. базальной среды; b. основного фактора роста фибробластов в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; в. инсулина в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d. аскорбиновой кислоты в количестве, достаточном для поддержания роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.

В другом примере, в заявке на патент WO2005086845, описывается способ поддержания недифференцированных стволовых клеток, где упомянутый способ включает воздействие на стволовые клетки одним членом семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), одним членом семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клеток в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения желаемого результата.

Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном из вариантов осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL^® (Becton Dickenson). MATRIGEL^® является растворимым препаратом из опухолевых клеток Энгельбрет-Холм-Сварм, которые превращаются в гель при комнатной температуре с образованием воссозданной базальной мембраны.

В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, это может быть ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных сочетаниях.

Плюрипотентные стволовые клетки могут высеиваться на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживание, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.

Подходящая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco №10829-018, базовая среда Хэма F12/50% DMEM, 200 ммоль L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор заменимых аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco № 13256-029.

Образование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные эндокринной линии клеток поджелудочной железы, с усилением экспрессии NGN3 и NKX6.1.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ усиления экспрессии NGN3 и NKX6.1 в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для эндокринной линии клеток поджелудочной железы, которая состоит из следующих шагов:

a) культивирования плюрипотентных стволовых клеток,

b) дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии клеток дефинитивной эндодермы,

c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, с добавлением в среду, используемую для дифференцировки клеточной линии дефинитивной эндодермы, соединения, выбранного из группы, которая состоит из H-9, H-89, GF 109203X, HA-1004, PP2, PP1, LY 294002, вортманнина, SB-203580, SB-202190, тирфостина 25, тирфостина, AG1478, тирфостина 46, GW 5074, кенпауллона, HNMPA, AG490, Y27632 и ML-7, и

d) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринной клеточной линии поджелудочной железы.

Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеточной линии дефинитивной эндодермы

Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.

Полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации Shinozaki et al, Development 131, 1651-1662 (2004).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации McLean et al, Stem Cells 25, 29-38 (2007).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в соответствии со способами, описанными в публикации D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).

Например, полипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, путем культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A в отсутствие сыворотки, зат