Фармацевтическая композиция, включающая микрорнк-100, и ее применение в модулировании роста кровеностых сосудов и воспаления эндотелия

Фармацевтическая композиция, включающая микрорнк-100, и ее применение в модулировании роста кровеностых сосудов и воспаления эндотелия

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Молекулы микроРНК представляют класс малых не кодирующих белки РНК, которые могут ингибировать трансляцию. Такие типы РНК, которые экспрессируются со специализированных генов, играют важную роль в регуляции экспрессии генов в клетке, включая регуляцию развития, дифференциацию стволовых клеток кроветворения, апоптоз и развитие рака. МикроРНК транскрибируются индивидуально или в комбинации в виде длинных первичных транскриптов (primary - pri-микроРНК) с помощью РНК-полимеразы II или III. Принято считать, что геном человека содержит по меньшей мере 500 разных генов микроРНК, которые первоначально экспрессируются в виде 5'-кэпированных и полиаденилированных транскриптов РНК полимеразы II. Они экспрессируются или в качестве отдельно регулируемых генов, или в качестве кластеров микроРНК, и затем процессируются с одного первичного транскрипта, который может содержать несколько микроРНК. Фермент Drosha расщепляет pri-микроРНК на предшественников микроРНК (precursor - рге-микроРНК) длиной 70-100 нуклеотидов, формируя вторичные структуры шпилька-петля. Затем происходит цитоплазматический процессинг, в ходе которого под действием фермента Dicer образуются зрелые одноцепочечные формы длиной примерно 16-29 нуклеотидов. Сформированные таким образом молекулы двухцепочечной РНК, которые содержат зрелую микроРНК и ее антисмысловую цепь, затем раскручиваются геликазой и зрелая микроРНК загружается на заглушающий комплекс (комплекс сайленсинга), индуцированный РНК (RNA induced silencing complex - RISC), а антисмысловая цепь разрушается.

Глушение трансляции (сайленсинг) вызывается или подавлением синтеза белка после связывания через неполное спаривание оснований с 3'-нетранслируемыми областями (3' untranslated region - 3'-UTR) целевых мРНК, и/или за счет связывания с мРНК с безупречной комплементарностью, что приводит к расщеплению целевых мРНК. Таким образом, опосредованное микроРНК подавление генной экспрессии потенциально может регулировать много клеточных мишеней, и на отдельные гены могут нацеливаться множественные микроРНК.

Краткое описание изобретения

Адаптивный рост кровеносных сосудов является важным защитным механизмом при сердечно-сосудистом заболевании, однако лежащие в основе регуляторные механизмы этого процесса поняты лишь частично. Ранее были обнаружены малые эндогенные молекулы РНК, которые играют важную роль в эмбриональном и постнатальном развитии кровеносных сосудов. Транскриптомный анализ микроРНК применяют для скрининга miRNA, дифференциально экспрессирующихся после индукции ишемии задней конечности у мышей, для идентификации miRNA, участвующих в ангиогенной и артериогенной регуляции. Установлено, что микроРНК-100 с пониженной регуляцией модулирует пролиферацию, формирование трубочек и активность по прорастанию эндотелиальных клеток и функционирует в качестве эндогенного репрессора сериновой/треониновой протеинкиназы mTOR. Сверхэкспрессия miR-100 ослабляет пролиферацию клеток, и это нарушение может быть преодолено путем одновременной трансфекции с конструкцией mTOR, утратившей сайт связывания miRNA. Ингибирование miR-100 специфическими антагомирами in vivo приводит к индукции ангиогенеза после окклюзии бедренной артерии у мышей, а лечение рапамицином - ингибитором mTOR, приводит к противоположному эффекту. Снижение регуляции miR-100 в клетках эндотелия индуцируется повышенными уровнями про-артериогенного цитокина TNF-альфа, экспрессия которого обратно коррелирует с уровнями miR-100 в ишемической ткани.

Показана анти-ангиогенная функция miR-100, которая по меньшей мере частично осуществляется через репрессию mTOR-передачи сигнала. Соответственно, подавление или повышение miR-100 представляет новый подход к положительному или отрицательному моделированию роста кровеносных сосудов и других mTOR-зависимых процессов.

Кроме того, установлено, что олигонуклеотидные соединения, основанные на последовательности микроРНК-100, могут применяться для подавления по меньшей мере трех молекул эндотелиальной адгезии. Таким образом, такая микроРНК сильно ослабляет адгезию циркулирующих лейкоцитов на стенках сосудов, которая является принципиальной составляющей широкого круга воспалительных заболеваний. Соединения, основанные на последовательности микроРНК-100, могут применяться для ослабления сосудистого воспалительного ответа на различные стимулы.

Предшествующий уровень техники: адаптивный рост кровеносных сосудов

Адаптивный рост кровеносных сосудов является важным защитным механизмом у пациентов с хроническим окклюзионным поражением сосудов. Прогрессирующая окклюзия крупной артерии приводит к гемодинамическим изменениям и ишемии расположенных ниже по кровотоку тканей, что вызывает и пролиферацию малых ранее существовавших коллатеральных артерий (артериогенез), и прорастание капилляров в ишемическую ткань (ангиогенез). В недавнем прошлом профилирование транскрипции применяли для исследования принципов регуляции, что облегчает и ангиогенез, зависимый от напряжения сдвига, и индуцированный гипоксией ангиогенез, а также выявлено несколько ключевых регуляторов.

Первые исследования подтвердили важную регуляторную функцию микроРНК в эмбриональном и постнатальном развитии кровеносных сосудов. Мультидоменный белок Dicer ответственен за процессинг молекул-предшественниц микроРНК в зрелые микроРНК, и мыши с гомозиготной мутацией Dicer умирают на ранней стадии эмбрионального развития из-за дефектов сосудов, подтверждая принципиально важную роль микроРНК в эмбриональном процессе формирования сосудов. Dews и др., Nat. Genet., 38, 2006, сс.1060-1065, показывают, что трансдукция клеток карциномы miR-17-92 приводит к повышенной перфузии опухоли, и что модуляция молекул микроРНК может применяться для повышения (в данном случае физиологическом) перфузии ткани.

Несколько исследовательских групп по всему миру в настоящее время исследуют регуляцию молекулами микроРНК ангиогенеза опухолей, но профиль экспрессии микроРНК во время роста ненеопластических кровеносных сосудов в качестве компенсаторного механизма при сосудистых окклюзионных заболеваниях до настоящего времени мало изучен. Описаны изменения в экспрессии микроРНК при адаптивной неоваскуляризации после сосудистой окклюзии и функциональное участие молекул микроРНК в моделировании ангиогенеза и артериогенеза в модели периферического сосудистого окклюзионного заболевания у мышей.

Mowelatos и др., Genes Dev. 16, 2002, сс.720-728, описали miR-100 в качестве малой эндогенной РНК и затем установили ее дифференциальную регуляцию в нескольких исследованиях особенностей экспрессии в опухолях.

Последовательность микроРНК-100 локализована на хромосоме 11 в кластере с let7a-2 и формирует семейство микроРНК с последовательностью, близкой miR-99. В области сердечно-сосудистых исследований miR-100 был впервые упомянут в работе Sucharov и др., J. Mol. Cell Cardiol, 45, 2008, сс.185-192, показавшей существенное повышение регуляции miR-100 в образцах тканей пациентов с сердечной недостаточностью с идиопатической дилатационной кардиомиопатией. За исключением этих результатов по дифференциальной экспрессии, регуляция и функция miR-100 исследованы мало. Ранее Henson и др., Genes Chromosomes Cancer, 48, 2009, сс.569-582, описали пониженную экспрессию miR-100 при плоскоклеточной карциноме ротовой полости и впервые провели функциональные исследования этой микроРНК в культивируемых раковых клетках. Они сообщили о существенном снижении пролиферации клеток после трансфекции pre-miR-100, обнаруживая хорошее соответствие с результатами, представленными в настоящем изобретении.

Потенциальное функциональное значение miR-100 в биологии рака было дополнительно подтверждено предшествующим сообщением Shi и др.. Int. J. Cancer, 2009 (Int J Cancer. 2009 Sep 8. [Epub ahead of print], PMID: 19739117), показывая, что сниженные уровни экспрессии miR-100 в клетках карциномы носоглотки человека приводят к прогрессированию заболевания. Показано, что miR-100 коррелирует с повышенными уровнями митотического регулятора поло-подобной киназы 1; однако воздействие на другие потенциальные гены-мишени, например, mTOR, не исследовали.

Manegold и др., Clin. Cancer Res., 2008, сс.892-900, описывают антиангиогенную терапию, посредством которой ингибитор mTOR, обозначаемый RAD001 (эверолимус), комбинируют с радиотерапией.

Wang и др., Journal of Virology, 2008, сс.9065-9074, сообщают, что инфекция цитомегаловирусом человека может изменить экспрессию клеточных типов микроРНК, в связи с чем miR-100 исследовали более подробно.

В WO 2005/013901 описывают олигомерные соединения и композиции, применяемые для модулирования малых некодирующих РНК.

Предшествующий уровень техники относится к потенциальным эффектам, которые микроРНК-100 могут оказывать на рост опухолевых клеток. Однако настоящее изобретение относится к положительным или отрицательным модуляциям роста кровеносных сосудов, которые отличаются от опухолей.

Сосудистые воспаления

Воспаление является важным компонентом защитной реакции организма-хозяина от внешних патогенов и повреждений, но также может индуцировать и поддерживать вредные состояния, например атеросклероз, васкулит или миокардит. Слой эндотелиальных клеток кровеносных сосудов является решающей модулирующей структурой в этом процессе, поскольку циркулирующие иммунные клетки должны присоединиться к эндотелию и мигрировать в стенку сосуда или периваскулярное пространство для осуществления своих функции. По сути повышенную регуляцию молекул эндотелиальной адгезии из-за изменений перемещения жидкостей в организме, гипертонии или повышенных уровней липопротеида низкой плотности-холестерина является одной из ранних стадий в инициации атеросклероза, который в настоящее время обычно рассматривается в качестве хронического воспалительного заболевания (1).

Много усилий по модулированию взаимодействий эндотелия-лейкоцитов по предупреждению или снижению чрезмерных воспалительных реакций было достигнуто в прошлом; однако основные регуляторные принципы процесса воспаления эндотелия остаются мало исследованными. Полагают, что ингибирование отдельных компонентов воспалительного каскада, например, одним антителом против молекулы адгезии, может оказаться недостаточным для достижения устойчивого эффекта в плане сосудистого воспаления.

Хотя мало известно о роли эндотелиальных молекул микроРНК в сосудистом воспалении, первые исследования показывают потенциально важную регуляторную функцию таких малых РНК. Показано, что MiR-126 регулируется факторами транскрипции Ets-1 и Ets-2 (3) в клетках эндотелия и приводит в действие противовоспалительный эффект путем репрессии VCAM-1, ослабляя адгезию лейкоцитов к стенке сосуда. MiR-21, который на высоком уровне экспрессируется в клетках гладкой мускулатуры сосудов, выявляют в качестве возможной мишени для предупреждения формирования неоинтимы после ангиопластики. Хотя наши знания о сосудистых микроРНК в этом контексте все еще недостаточны, исследования уже сфокусированы на функции малых РНК в циркуляции иммунных клеток и установлено несколько про- и антивоспалительных микроРНК. Предположительно особенно miR-155 играет принципиальную роль в дифференциации и функционировании почти всех субпопуляций лейкоцитов.

Описана функциональная роль miR-100 в модулировании взаимодействий лейкоцитов-эндотелия путем репрессии молекул эндотелиальной адгезии. Биологическое действие miR-100 позволяет применять его для лечения заболеваний, связанных с сосудистой системой, в частности васкулита, атеросклероза, васкулярной коррекции в ответ на повреждение или рестеноз.

Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения

Функция miR-100 в сосудистой системе до настоящего времени не исследована. В настоящем изобретении изложено первое исследование, применяющее результаты дифференциальной экспрессии по данным in vivo для идентификации новой микроРНК - регулятора ангиогенеза. В настоящем изобретении описано снижение регуляции микроРНК-100 после индукции ишемии in vivo и функция указанной микроРНК в качестве анти-ангиогенного репрессора.

Хотя ген miR-100 не является микроРНК с наиболее сильной нарушенной регуляцией после индукции ишемии в задней конечности и его экспрессия не является специфичной для сосудов, исследование было сфокусировано на этом гене из-за устойчивого снижения его экспрессии на протяжении периода ангиогенеза и его подающий надежду выбор прогнозированных генов-мишеней. Ген miR-100 экспрессируется и в эндотелии, и в клетках гладкой мускулатуры сосудов in vivo и в культуре. Подходы по утрате функции, а также подходы к усилению функции, применяют для подтверждения важной регуляторной функции такой микроРНК в нескольких моделях ангиогенеза in vitro, а также по более общим клеточным функциям, например, пролиферации. Интересно отметить, что разброс эффекта подавления miR-100 на пролиферацию в клетках разных типов коррелирует с исходными уровнями микроРНК в этих клетках.

Используя комбинацию анализа экспрессии генома дикого типа в клетках эндотелия после сверхэкспрессии miR-100 и прогнозов по биоинформатике сайтов связывания микроРНК, мишенью рапамицина у млекопитающих была определена непосредственно мРНК-мишень гена miR-100. Ранее было показано, что mTOR необходим для ангиогенеза и пролиферации клеток эндотелия в ответ на гипоксию и является одной из обнадеживающих мишеней для новой анти-ангиогенной противораковой терапии.

Было показано, что ген miR-100 способен репресировать mTOR-зависимую клеточную пролиферацию и что этот эффект может быть нейтрализован путем экспрессии mTOR, утратившей сайт связывания miR-100. Хотя другие гены-мишени miR-100 не могут быть исключены в качестве медиаторов наблюдаемых воздействий на неоваскуляризацию, это показывает, что экспрессия mTOR является важной стадией медиатора функции miR-100 в клетках сосудов. Кроме того, гистологический анализ показывает повышенную экспрессию mTOR в растущих коллатеральных артериях и лечение рапамицином - ингибитором mTOR, приводит к противоположному эффекту, оказываемому на восстановление перфузии в задней конечности по сравнению с лечением miR-100-специфическим антагомиром.

Настоящее изобретение добавляет нового кандидата к списку описанных молекул «антаго-miR» и показывает роль miR-100 в регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе и его функцию в качестве эндогенного mTOR-модулятора. Отсюда следует важная роль такой микроРНК также в других физиологических и патофизиологических процессах. Ген miR-100 является новой обнадеживающей мишенью для фармакологической терапии при сердечно-сосудистом заболевании.

Фармацевтическую композицию, описанную в настоящем изобретении, предпочтительно применяют для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний сосудистой системы. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию применяют для какого-либо из следующих заболеваний, выбранных из группы, включающей окклюзионное заболевание периферических сосудов, коронарную болезнь сердца, цереброваскулярное заболевание, васкулит, атеросклероз, сосудистое ремоделирование в ответ на повреждение и рестеноз.

Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, которая включает молекулу микроРНК или комплементарную ей последовательность, или ее вариант, и в частности один или несколько антагомиров. Антагомиры являются химически сконструированными олигонуклеотидами, которые применяют для глушения эндогенной микроРНК. Антагомир является малой синтетической молекулой РНК, которая совершенным образом комплементарна специфической микроРНК-мишени либо с ошибочным спариванием по сайту расщепления Ago2, либо с некоторым типом модификации оснований для ингибирования расщепления Ago2. Обычно антагомиры обладают некоторым видом модификации для придания большей устойчивости к разрушению. Неясно, каким образом действует антагомиризация (процесс, с помощью которого антагомир ингибирует действие микроРНК), но полагают, что она необратимо ингибирует связывание микроРНК. Антагомиры применяют для конститутивного подавления действия специфических микроРНК.

Действующая молекула основана на последовательности микроРНК-100, имеющей следующую последовательность: GUGUUCAAGCCUAGAUGCCCAA (SEQ ID No.1).

Последовательность РНК также может быть представлена в виде последовательности ДНК, в соответствии с чем урацил (U) замещен тимидином (Т). В результате последовательность читается следующим образом: GTGTTCAAGCCTAGATGCCCAA (SEQ ID No.2).

Предполагают, что молекула miR-100 является производной от более длинной молекулы-предшественницы, так называемой молекулы pre-miR, которая процессируется в молекулы зрелой miR-100. В экспериментах применяют молекулу pre-miR-100, имеющую следующую последовательность:

CCUGUUGCCACAAACCCGUAGAUCCGAACUUGUGGUAUUAGUCCGCACAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUGUGUCUGUUAGG (SEQ ID No.8).

Полагают, что молекула pre-miR складывается в следующую структуру:

Указанная выше структура имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID No.8, в соответствии с чем показаны спаривания оснований.

Молекула pre-miR процессируется в молекулы зрелой микроРНК-100, имеющую следующую последовательность:

AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG (SEQ ID No:9).

Последовательность SEQ ID No:9 является ревертированной последовательностью SEQ ID No:l.

Для фармацевтического лекарственного средства предпочтительно применяют следующую последовательность антагомира:

Antag-100: 5'-cacaaguucggaucuacggguu-3' (SEQ ID No.3). Последовательность SEQ ID No:3 применяют в экспериментах, в которых применяют обозначение «анти-miR».

В качестве контроля применяют последовательности SEQ ID NO:4 и NO:5:

Antag-cont1: 5'-aaggcaagcugacccugaaguu-3' (SEQ ID No.4) и

Antag-cont2: 5'-caccaguuaggcucuacggauu-3' (SEQ ID No.5).

Настоящее изобретение также относится к вариантам указанных выше последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3, причем понятие «вариант» означает, что один или два нуклеотида могут быть делегированы или замещены другими нуклеотидами.

Предпочтительные варианты последовательности SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2 гомологичны по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% последовательности SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2.

Предпочтительные варианты последовательности антагомира SEQ ID NO:3 гомологичны по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90% и более предпочтительно на 95% последовательности SEQ ID NO:3. Это означает, что в вариантах до трех нуклеотидов могут быть замещены другими нуклеотидами, предпочтительно только двумя и более предпочтительно только одним нуклеотидом. Понятие гомологии означает идентичность. То есть, например, по меньшей мере 85% нуклеотидов идентичны, несмотря на то, что оставшиеся нуклеотиды могут быть изменены. Для определения гомологии последовательности по настоящему изобретению сравнивают с гомологичными последовательностями, которые имеют то же число нуклеотидов. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения имеют последовательности 1, 2, 3, 8 и/или 9 при условии, что не более 2, предпочтительно 1 нуклеотид делегирован, добавлен или замещен другим нуклеотидом.

В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антагомир-100 имеет последовательность SEQ ID No:3, согласно указанному выше, причем некоторые из нуклеотидов модифицированы. Предпочтительный антагомир-100 имеет следующую последовательность:

c*a*caaguucggaucuacgg*g*u*u*,

которая соответствует последовательности SEQ ID No:3.

Все основания синтезируют в виде 2-O-метил-РНК. Значок «*» показывает а фосфотиоатную модификацию. С 3'-конца с молекулой конъюгируют холестерин для лучшего потребления клеткой.

Специалистам в данной области очевидно, что возможны незначительные модификации молекулы. Например, остаток холестерина также может быть присоединен к 5'-концу. В другом варианте дополнительные основания могут иметь фосфотиоатную модификацию.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения неполная последовательность: "UACGGGU (SEQ ID No.6) не изменяется. Следовательно, изменения в последовательности ID NO:3 происходят только в положениях последовательности ID NO:3, которые не соответствуют последовательности SEQ ID NO:6.

Это также справедливо для комплементарной последовательности соответствующей дезоксирибонуклеотидной последовательности. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения основания в положениях 5, 9, 12 и 20 не являются мутантными, что означает, что основания в указанных положениях в последовательностях SEQ ID No.1, или SEQ ID NO:3, или в комплементарных им последовательностях остаются неизмененными.

Структуры биологического действия, согласно описанному в настоящем изобретении, могут быть интродуцированы в организм для лечения в виде нуклеиновой кислоты в составе вектора, который реплицируется в клетках-хозяевах и вырабатывает олигонуклеотиды. В другом варианте нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут вводиться пациенту в соответствующем носителе.

Варианты также могут включать указанные выше последовательности и модифицированные олигонуклеотиды, конъюгированные с одной или несколькими частями молекулы, которые повышают действие, клеточное распределение или клеточное потребление получаемых антисмысловых олигонуклеотидов. Предпочтительной частью молекулы является часть молекулы холестерина или липида. Дополнительными частями молекулы для конъюгации могут быть углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. В некоторых вариантах конъюгируемая группа присоединена непосредственно к модифицированному олигонуклеотиду. В некоторых вариантах конъюгируемая группа присоединена к модифицированному олигонуклеотиду связывающей частью молекулы, выбранной из аминогруппы, гидроксила, карбоновой кислоты, тиольной группы, ненасыщенных соединений (например, с двумя или тремя связями), 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (dioxaoctanoic acid - ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC), 6-аминокапроевой кислоты (ALEX или AHA), замещенного С₁-С₁₀ алкила, замещенного или незамещенного С₂-С₁₀ алкенила и замещенного или незамещенного С₂-С₁₀ алкинила. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения группа заместителя выбрана из гидроксила, аминогруппы, карбоксигруппы, бензила, фенила, нитро-группы, тиола, тиоалкокси-группы, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соединение включает модифицированный олигонуклеотид, содержащий одну или несколько стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида для усиления таких, например, свойств, как устойчивость к нуклеазам. Включенными в стабилизирующие группы являются кэповые структуры. Такие концевые модификации защищают модифицированный олигонуклеотид от разрушения экзонуклеазой и могут способствовать доставке в клетку и/или локализации в клетке. Кэп может быть с 5'-конца (5'-кэп), или с 3'-конца (3'-кэп), или может быть с обоих концов. Кэповые структуры включают, например, инвертированные дезокси абазические кэпы.

Соответствующие кэповые структуры включают 4',5'-метиленовый нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотид, альфа-нуклеотид, модифицированный основной нуклеотид, фосфородитиоатную связь, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-зесо-нуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутиловый нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированную нуклеотидную часть молекулы, 3'-3'-инвертированную абазическую часть молекулы, 3'-2'-инвертированную нуклеотидную часть молекулы, 3'-2'-инвертированную абазическую часть молекулы, 1,4-бутандиол фосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексил фосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфортиоат, фосфордитиоат, связывающая метилфосфонатная часть молекулы и несвязывающая метилфосфонатная часть молекулы 5'-амино-алкил фосфат, 1,3-диамино-2-пропил фосфат, 3-аминопропил фосфат, 6-аминогексил фосфат, 1,2-аминододецил фосфат, гидроксипропил фосфат, 5'-5'-инвертированную нуклеотидную часть молекулы, 5'-5'-инвертированную абазическую часть молекулы, 5'-фосфорамидат, 5'-фосфоротиоат, 5'-амино, связывающий и/или несвязывающий 5'-фосфорамидат, фосфоротиоат и 5'-меркапто-часть молекулы.

Настоящее изобретение относится к молекуле микроРНК-100, ее антагомиру или ее вариантам, согласно описанному выше, которые применяют в фармацевтических композициях и для получения соответствующих лекарственных средств. Такие фармацевтические композиции применяют для положительного или отрицательного модулирования роста кровеносных сосудов.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула микроРНК-100 или ее варианты применяют для модуляции пролиферации, формирования трубочек и активности по прорастанию клеток эндотелия. Их действие заключается в формировании новых кровеносных сосудов, в частности применимом для лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Соединение, включающее модифицированный олигонуклеотид, комплементарный микроРНК, его предшественник, описанный в настоящем изобретении, получают в качестве фармацевтической композиции для модуляции эндотелиальных клеток. К соответствующим способам введения относятся, но ими перечень не ограничивается, пероральное, ректальное, трансмукозальное, кишечное, энтеральное, местное, через суппозитории, путем ингаляции, подоболочечное, внутрижелудочковое, внутрибрюшинное, интраназальное, внутриглазничное и парентеральное (например, внутривенное, внутримышечное, интрамедуллярное и подкожное) введение. Дополнительный соответствующий способ введения включает хемоэмболизацию. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические подоболочечные средства вводят для достижения скорее локальной, чем системной экспозиции. Например, фармацевтические композиции могут быть внесены инъекцией непосредственно в область, где требуется вызвать определенный эффект.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в форме дозированной единицы (например, таблетки, капсулы, болюса и др.). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такие фармацевтические композиции включают модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25-800 мг. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает дозу модифицированного олигонуклеотида, выбранную из 25 мг, 50 мг, 75 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 500 мг, 600 мг, 700 мг и 800 мг.

Фармацевтический агент может быть стерильным лиофилизированным модифицированным олигонуклеотидом, который восстанавливают соответствующим растворителем, например, стерильной водой для инъекций или стерильным физиологическим раствором для инъекций. Восстановленный продукт вводят путем подкожной инъекции или внутривенной инфузии после разведения в физиологическом растворе. Лиофилизированный лекарственный продукт состоит из модифицированного олигонуклеотида, который получают в воде для инъекций или в физиологическом растворе для инъекций, с величиной рН, доведенной до 7,0-9,0 кислотой или основанием при приготовлении и затем лиофилизируют. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25-800 мг модифицированного олигонуклеотида.

Композиции настоящего изобретения могут дополнительно содержать другие дополнительные компоненты, обычно присутствующие в фармацевтических композициях на уровнях дозирования, принятых в данной области. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически действующие материалы, например, средства от зуда, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные агенты, или могут содержать дополнительные материалы, применимые при переработке различных дозированных форм композиций по настоящему изобретению, например, красители, вкусовые агенты, консерванты, антиоксиданты, опалесцирующие агенты, уплотняющие агенты и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении могут нежелательным образом влиять на биологическое действие компонентов композиций по настоящему изобретению. Составы могут быть стерилизованы и при необходимости перемешаны со вспомогательными агентами, например, смазывающими, консервирующими, стабилизирующими, увлажняющими агентами, эмульгаторами, солями для поддержания осмотического давления, буферами, красителями, вкусовыми и/или ароматизирующими веществами и другими агентами, которые в составе не вступают в разрушительные взаимодействия с олигонуклеотидом (олигонуклеотидами).

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать один или несколько модифицированных олигонуклеотидов и один или несколько эксципиентов. В некоторых таких вариантах осуществления настоящего изобретения эксципиенты выбраны из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, магния стеарата, талька, салициловой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают, используя известные методы, включая, но ими не ограничиваясь, смешивание, растворение, гранулирование, штамповку драже, растирание в порошок, эмульгирование, инкапсулирование, инкапсулирование или таблетирование.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть жидкой (например, суспензией, эликсиром и/или раствором). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения жидкую фармацевтическую композицию получают, используя ингредиенты, известные в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, воду, гликоли, масла, спирты, ароматизаторы, консерванты и красители.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть твердой (например, порошком, таблеткой и/или капсулой). В некоторых из таких вариантов осуществления настоящего изобретения твердую фармацевтическую композицию, включающую один или несколько олигонуклеотидов, получают, используя ингредиенты, известные в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие агенты, связующие агенты и разрыхлители.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению перерабатывают в качестве пролонгированных препаратов. Некоторые такие пролонгированные препараты обычно действуют дольше, чем непролонгированные препараты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пролонгированные препараты получают, применяя соответствующие полимерные или гидрофобные материалы (например, эмульсию в соответствующем масле), или ионообменные смолы, или слаборастворимые производные, например, слаборастворимую соль.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композицию по настоящему изобретению включает систему доставки. К примерам систем доставки относятся, но ими не ограничиваются, липосомы и эмульсии. Определенные системы доставки применимы для получения определенных фармацевтических композиций, в том числе включающих гидрофобные соединения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяют определенные органические растворители, например диметилсульфоксид.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композицию по настоящему изобретению включает одну или несколько тканеспецифичных молекул доставки, разработанных для доставки одного или нескольких фармацевтических агентов по настоящему изобретению, к определенным тканям или типам клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифичным антителом.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композицию по настоящему изобретению включает систему сопутствующего растворителя. Некоторые из таких систем сопутствующего растворителя включают, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такие системы сопутствующего растворителя применяют для гидрофобных соединений. Примером такой системы сопутствующего растворителя, которой перечень не ограничивается, является система сопутствующего растворителя VPD, представляющая раствор абсолютного этанола, включающего 3 мас.% бензилового спирта, 8 мас.% неполярного поверхностно активного продукта Polysorbate 80™ и 65 мас.% полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем сопутствующего растворителя могут существенно варьировать без существенного изменения их растворимости и токсичности. Кроме того, идентичность компонентов системы сопутствующего растворителя могут варьировать: например, другие поверхностно активные вещества могут применяться вместо продукта Polysorbate 80; размер фракции полиэтиленгликоля может варьировать; другие биосовместимые полимеры могут заменить полиэтиленгликоль, например, поливинилпирролидон; другие сахара или полисахариды могут быть замещены на декстрозу.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композицию по настоящему изобретению включает систему устойчивого высвобождения. Одним из примеров такой системы устойчивого высвобождения является полупроницаемый матрикс плотных гидрофобных полимеров. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения системы устойчивого высвобождения могут в зависимости от их химической природы высвобождать фармацевтические агенты на протяжении часов, суток, недель или месяцев.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают для перорального введения. В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция переработана путем комбинирования одного или нескольких соединений, включающих модифицированный олигонуклеотид с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Некоторые из этих носителей позволяют перерабатывать фармацевтические композиции в таблетки, пилюли, драже, капсулы, растворы, гели, сиропы, гидросмеси, суспензии и др. для применения субъектами через рот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции для перорального применения получают перемешиванием олигонуклеотида и одного или нескольких твердых эксципиентов. К соответствующим эксципиентам относятся, но ими не ограничиваются, наполнители, например сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, например, картофельный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (ПВП). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такую смесь необязательно измельчают и необязательно добавляют вспомогательные агенты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции формируют для получения сердцевин таблеток или драже. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения добавляют разрыхлители (например, перекрестно связанный поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, например альгинат натрия).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сердцевины драже предусмотрены с покрытием. В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения применяют концентрированные растворы сахаров, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карболовый гель, полиэти