Цитотоксические пептиды и их конъюгаты антитело-лекарственное средство

Цитотоксические пептиды и их конъюгаты антитело-лекарственное средство

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритеты предварительной заявки на патент США No. 61/561255, поданной 17 ноября 2011 года, и предварительной заявки на патент США No. 61/676423, поданной 27 июля 2012 года, обе из которых включены в данное описание посредством ссылки во всей их полноте.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым соединениям на основе пептидов, применимых в качестве полезных нагрузок в конъюгатах антитело-лекарственное средство (ADC), и соединениям-конструкциям полезная нагрузка-линкер, применимых в связывании с ADC. Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, включающей вышеупомянутые полезные нагрузки, конструкции полезная нагрузка-линкер и ADC, и способам использования этих полезных нагрузок, конструкций полезная нагрузка-линкер и ADC для лечения патологических состояний, включая рак.

Предшествующий уровень техники

Конъюгирование лекарственных средств с антителами, непосредственно или через линкеры, включает рассмотрение ряда факторов, в том числе идентичность и расположение химической группы для конъюгирования лекарственного средства, механизм высвобождения лекарственного средства, структурные элементы, обеспечивающие высвобождение лекарственного средства, и структурную модификацию для высвобождения свободного лекарственного средства. Кроме того, если лекарственное средство должно высвобождаться после интернализации антитела, механизм высвобождения лекарственного средства должен согласовываться с внутриклеточным транспортом конъюгата.

Хотя множество различных классов лекарственных средств было исследовано в отношении доставки через антитела, всего лишь несколько классов лекарственных средств проявили эффективность в качестве конъюгатов антитело-лекарственное средство, в то же время проявляя приемлемый профиль токсичности. Одним из таких классов являются ауристатины, производные природного продукта доластатина 10. Иллюстративные ауристатины включают (N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапролин-норэфедрин) и (N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапролин-фенилаланин). Однако, остается необходимость в дополнительных ауристатинах с улучшенными свойствами.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к цитотоксическим пентапептидам и их конъюгатам антитело-лекарственное средство, представленным формулой:

или их фармацевтически приемлемым соли или сольвату, где, в каждом случае независимо,

W представляет собой или

R¹ представляет собой водород, C₁-C₈алкил или C₁-C₈галогеналкил, или R¹ представляет собой линкер или линкер-антитело, например или

Y представляет собой -C₂-C₂₀алкилен-, -C₂-C₂₀гетероалкилен-, C₃-C₈карбоцикло-, -арилен-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-арилен-, -арилен-C₁-C₁₀алкилен-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилен-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилен-;

Z представляет собой -NH₂ или -NHL;

G представляет собой галоген, -OH, -SH или -S-C₁-C₆алкил;

L представляет собой антитело;

R² представляет собой водород, C₁-C₈алкил или C₁-C₈галогеналкил;

R^3A и R^3B определены как любые из следующих:

(1) R^3A представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил, аралкил или галоген; и

R^3B представляет собой C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил, аралкил или галоген; или

(2) R^3A и R^3B, взятые вместе, представляют собой C₂-C₈алкилен или C₁-C₈гетероалкилен;

R^4A и R^4B определены как любые из следующих:

(1) R^4A представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил или аралкил; и

R^4B представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил или аралкил; или

(2) R^4A и R^4B, взятые вместе, представляют собой C₂-C₈алкилен или C₁-C₈гетероалкилен;

R⁵ представляет собой , C₁-C₁₀гетероциклил, C₃-C₈карбоциклил и C₆-C₁₄арил, возможно замещенные 1, 2, 3, 4 или 5 группами, независимо выбранными из группы, состоящей из следующих: -C₁-C₈алкил, -C₁-C₈алкил-N(R′)₂, -C₁-C₈алкил-C(O)R′, -C₁-C₈алкил-C(O)OR′, -O-(C₁-C₈алкил), -C(O)R′, -OC(O)R′, -C(O)OR′, -C(O)N(R′)₂, -NHC(O)R′, -S(O)₂R′, -S(O)R′, -OH, галоген, -N₃, -N(R′)₂, -CN, -NHC(=NH)NH₂, -NHCONH₂, -S(=O)₂R′ и -SR′, где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила и незамещенного арила, или два R′ могут вместе с азотом, к которому они присоединены, образовывать C₁-C₁₀гетероциклил;

или R⁵ представляет собой или , возможно замещенные 1, 2, 3, 4 или 5 группами, независимо выбранными из группы, состоящей из следующих: C₁-C₈алкил, -C₁-C₈алкил-N(R′)₂, -C₁-C₈алкил-C(O)R′, -C₁-C₈алкил-C(O)OR′, -O-(C₁-C₈алкил), -C(O)R′, -OC(O)R′, -C(O)OR′, -C(O)N(R′)₂, -NHC(O)R′, -S(O)₂R′, -S(O)R′, -OH, галоген, -N₃, -N(R′)₂, -CN, -NHC(=NH)NH₂, -NHCONH₂, -S(=O)₂R′, -SR′ и арилен-R′, где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкила, C₁-C₈гетероциклила, C₁-C₁₀алкилен-C₃-C₈гетероциклила и арила, или два R′ могут вместе с азотом, к которому они присоединены, образовывать C₁-C₁₀гетероциклил;

R⁶ представляет собой водород, -C₁-C₈алкил, -C₂-C₈алкенил, -C₂-C₈алкинил или -C₁-C₈галогеналкил;

R¹² представляет собой водород, C₁-C₄алкил, C₁-C₁₀гетероциклил или C₆-C₁₄арил;

R¹³ представляет собой C₁-C₁₀гетероциклил; и

R⁷ представляет собой F, Cl, I, Br, NO₂, CN и CF₃;

h равен 1, 2, 3, 4 или 5; и

X представляет собой O или S;

при условии, что, когда R^3A представляет собой водород, тогда X представляет собой S.

Настоящее изобретение относится к цитотоксическим пентапептидам и их конъюгатам антитело-лекарственное средство, представленным формулой:

или их фармацевтически приемлемым соли или сольвату, где, в каждом случае независимо,

W представляет собой или

R¹ представляет собой водород, C₁-C₈алкил или C₁-C₈галогеналкил;

R² представляет собой водород, C₁-C₈алкил или C₁-C₈галогеналкил;

R^3A и R^3B определены как любые из следующих:

(1) R^3A представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил, аралкил или галоген; и

R^3B представляет собой C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил, аралкил, галоген или водород; или

(2) R^3A и R^3B, взятые вместе, представляют собой C₂-C₈алкилен или C₁-C₈гетероалкилен;

R^4A и R^4B определены как любые из следующих:

(1) R^4A представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил или аралкил; и

R^4B представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, C₃-C₈карбоциклил, C₁-C₁₀гетероциклил, арил, гетероаралкил или аралкил; или

(2) R^4A и R^4B, взятые вместе, представляют собой C₂-C₈алкилен или C₁-C₈гетероалкилен;

R⁵ представляет собой

или

возможно замещенные 1, 2, 3, 4 или 5 группами, независимо выбранными из группы, состоящей из следующих: C₁-C₈алкил, -O-(C₁-C₈алкил), -C(O)R′, -OC(O)R′, -C(O)OR′, -C(O)NH₂, -C(O)NHR′, -C(O)N(R′)₂, -NHC(O)R′, -S(O)₂R′, -S(O)R′, -OH, галоген, -N₃, -NH₂, -NH(R′), -N(R′)₂, -CN, -NHC(=NH)NH₂, -NHCONH₂, -S(=O)₂R′ и -SR′, где каждый R′ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, C₁-C₈алкил и незамещенного арила;

R¹¹ представляет собой водород, C₁-C₈алкил, C₁-C₈галогеналкил, или R¹¹ представляет собой линкер или линкер-антитело, например или

Y представляет собой C₂-C₂₀алкилен или C₂-C₂₀гетероалкилен; C₃-C₈карбоцикло-, -арилен-, -C₃-C₈гетероцикло-, -C₁-C₁₀алкилен-арилен-, -арилен-C₁-C₁₀алкилен-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈карбоцикло)-, -(C₃-C₈карбоцикло)-C₁-C₁₀алкилен-, -C₁-C₁₀алкилен-(C₃-C₈гетероцикло)- или -(C₃-C₈гетероцикло)-C₁-C₁₀алкилен-;

Z представляет собой -NH₂ или -NHL;

G представляет собой галоген, -OH, -SH или -S-C₁-C₆алкил;

L представляет собой антитело;

R⁷ представляет собой F, Cl, I, Br, NO₂, CN и CF₃;

h равен 1, 2, 3, 4 или 5; и

X представляет собой О или S.

Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество любого из вышеупомянутых соединений и/или любого из вышеупомянутых конъюгатов антитело-лекарственное средство и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

Еще один аспект изобретения относится к способу использования эффективного количества любого из вышеупомянутых соединений и/или любого из вышеупомянутых конъюгатов антитело-лекарственное средство для лечения рака, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества указанного соединения и/или конъюгата.

Еще один аспект изобретения относится к способу лечения рака, где указанный рак включает опухоль, метастаз или другое заболевание или расстройство, характеризующееся неконтролируемым клеточным ростом, где указанный рак выбран из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, толстой кишки, глиомы, рака эндометрия, почки, легкого, пищевода, яичника, предстательной железы, поджелудочной железы, меланомы, рака желудка и яичек.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показан график противоопухолевой активности четырех конъюгатов (каждый введен в дозе 1 мг/кг, Q4d×4) в виде зависимости объема опухоли от времени.

На Фиг. 2 показан график противоопухолевой активности шести конъюгатов (каждый введен в дозе 1 мг/кг, Q4d×4) в виде зависимости соотношения объем опухоли, обработанной лекарством/объем опухоли, обработанной носителем, от времени.

На Фиг. 3 показаны результаты тестирования H(C)-#D54 и H(C)-vcMMAE в дозе 1 мг/кг.

На Фиг. 4A, 4B и 4C показаны [A] результаты тестирования H(C)-#D54 и H(K)-MCC-DM1 в модели скрининга in vivo мышиного ксенотрансплантата MDA-MB-361-DYT2; [B] результаты тестирования H(C)-vcMMAE и H(C)-mcMMAF в модели скрининга in vivo мышиного ксенотрансплантата MDA-MB-361-DYT2; и [C] сравнение рассчитанного соотношения T/C для всех четырех конъюгатов. Мышей лечили по схеме q4d×4, начиная с суток 1.

На Фиг. 5A, 5B, 5C, 5D, 5E и 5F показаны дозозависимые результаты тестирования [A] H(C)-#D54, [B] H(C)-vcMMAE, [С] H(C)-mcMMAF и [D] H(K)-MCC-DM1 в модели in vivo мышиного ксенотрансплантата N87; [E] сравнение H(C)-#D54 и H(C)-vcMMAE; и [F] сравнение T/C для всех четырех конъюгатов. Мышей лечили по схеме q4d×4, начиная с суток 1.

На Фиг. 6 показаны дозозависимые результаты тестирования H(C)-#A115 при 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг в модели in vivo мышиного ксенотрансплантата N87. Мышей лечили по схеме q4d×4, начиная с суток 1.

На Фиг. 7 показаны данные сравнения гуманизированного антитела hu08, конъюгированного с vc-0101 или тс-3377, тестированного в модели in vivo ксенотрансплантата с PC3MM2 клетками, клеточной линией рака простаты человека, экспрессирующей IL-13Rα2 рецептор.

На Фиг. 8A-E показаны данные по [A] эффективности химерных крыса-человек анти-Notch ADC, введенных в дозе 5 мг/кг, в легочных ксенотрансплантатах HCC2429; [B и C] эффективности химерных крыса-человек анти-Notch ADC, введенных в дозе 5 мг/кг, в ксенотрансплантатах молочной железы MDA-MB-468; [D и E] эффективности химерных крыса-человек анти-Notch ADC, введенных в дозе 5 мг/кг, в ксенотрансплантатах желудка N87.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к цитотоксическим пентапептидам, к конъюгатам антитело-лекарственное средство, содержащим указанные цитотоксические пентапептиды, и к способам их использования для лечения рака и других патологических состояний. Изобретение также относится к способам использования таких соединений и/или конъюгатов in vitro, in situ и in vivo для обнаружения, диагностики или лечения клеток млекопитающих или ассоциированных патологических состояний.

Определения и сокращения

Если не указано иное, следующие термины и фразы, как их используют в данном описании, имеют следующие значения. Когда в данном описании используют товарные знаки, они включают препарат продукта, непатентованное наименование лекарственного средства и активный(е) фармацевтический(е) ингредиент(ы) указанного под товарным знаком продукта, если по контексту не указано иное.

Термин "антитело" (или "Ab") используют в данном описании в наиболее широком смысле, и он конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, моноспецифические антитела, мультиспецифические антитела (например биспецифические антитела) и фрагменты антител, которые проявляют желаемую биологическую активность. Интактное антитело имеет главным образом две области: вариабельную область и константную область. Вариабельная область связывается и взаимодействует с антигеном-мишенью. Вариабельная область включает гипервариабельный участок (CDR), который распознает и связывается со специфическим сайтом связывания на конкретном антигене. Константная область может распознаваться и взаимодействовать с иммунной системой (см., например, Janewayet al., 2001, Immuno. Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Антитело может быть любого типа или класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) или подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Антитело может иметь происхождение из любого подходящего вида. В некоторых воплощениях антитело имеет человеческое или мышиное происхождение. Антитело может быть, например, человеческим, гуманизированным или химерным.

Термины "специфически связывается" и "специфическое связывание" относятся к связыванию антитела с заранее установленным антигеном. Как правило, антитело связывается с аффинностью по меньшей мере примерно 1×10⁷ М^-1 и связывается с заранее установленным антигеном с аффинностью, которая по меньшей мере в два раза больше по сравнению с его аффинностью в отношении связывания с неспецифическим антигеном (например бычьим сывороточным альбумином (BSA), казеином), отличным от заранее установленного антигена или близкородственного антигена.

Термин "моноклональное антитело", как его используют в данном описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направленными против единственного антигенного сайта. Определение "моноклональное" указывает на природу антитела как получаемого из по существу гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующее продуцирование антитела каким-либо конкретным способом.

Термин "моноклональные антитела" специально включает "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, имеющих происхождение из конкретных видов или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющих происхождение из других видов или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагментов таких антител, при условии что они проявляют желаемую биологическую активность.

Как используют в данном описании, "H(C)-" относится к трастузумабу (товарный знак HERCEPTIN®), который означает моноклональное антитело, препятствующее связыванию HER2/neu рецептора через один из его цистеинов с соединением по изобретению. Как используют в данном описании, "H(K)-" относится к трастузумабу, который означает моноклональное антитело, препятствующее связыванию HER2/neu рецептора через один из его лизинов с соединением по изобретению.

"Интактное антитело" представляет собой антитело, которое содержит антиген-связывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (C_L) и константные домены тяжелой цепи, C_H1, C_H2, C_H3 и C_H4, в зависимости от класса антител. Константные домены могут быть нативными последовательностями константных доменов (например, человеческая нативная последовательность константных доменов) или их варианты аминокислотных последовательностей.

Интактное антитело может проявлять одну или более "эффекторных функций", которые относятся к тем биологическим активностям, которые приписывают Fc-области (например, нативная последовательность Fc-области или аминокислотный вариант последовательности Fc-области) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают комплемент-зависимую цитотоксичность, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз.

"Фрагмент антитела" содержит часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab′, F(ab′)₂ и Fv, диатела, триатела, тетратела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антитела, scFv, scFv-Fc, мультиспецифичные фрагменты антитела, образованные из фрагмента(ов) антител, фрагмент(ы), продуцируемый(е) Fab экспрессионной библиотекой, или эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеуказанного, которые иммуноспецифично связываются с антигеном-мишенью (например, раковым клеточным антигеном, вирусным антигеном или микробным антигеном).

Термин "вариабельный" в контексте антитела относится к определенным участкам вариабельных доменов антитела, которые сильно отличаются по последовательности и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Эта вариабельность сконцентрирована в трех сегментах, называемых "гипервариабельными участками" в вариабельных доменах легкой и тяжелой цепи. Более высококонсервативные участки вариабельных доменов называют каркасными областями (FR). Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей каждый содержит четыре FR, соединенные тремя гипервариабельными участками.

Термин "гипервариабельный участок" при использовании здесь относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок в общем содержит аминокислотные остатки из "участка, определяющего комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (L3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), и/или те остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (142) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia и Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). FR остатки представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определено в данном описании.

"Одноцепочечное Fv" или "scFv" фрагмент антитела содержит V.sub.H и V.sub.L домены антитела, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, Fv полипептид дополнительно содержит полипептидный линкер между V.sub.H и V.sub.L доменами, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора scFv см. Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg и Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин "диатело" относится к небольшим фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, причем фрагменты содержат вариабельный тяжелый домен (V_H), соединенный с вариабельным легким доменом (V_L) в одной полипептидной цепи. При использовании линкера, который слишком короткий, чтобы обеспечить спаривание между двумя доменами на одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта. Диатела описаны более подробно, например, в EP 0404097; WO 93/11161; и Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.

"Гуманизированные" формы не являющихся человеческими (например, грызуна) антител являются химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. В большинстве случаев гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (реципиентное антитело), в которых остатки из гипервариабельного участка реципиента заменены остатками из гипервариабельного участка не являющихся человеческими видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеческим примат, имеющих желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками не являющихся человеческими видов. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживают в реципиентном антителе или в донорном антителе. Эти модификации создают для дополнительного улучшения эффективности антитела. В общем, гуманизированное антитело содержит по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из гипервариабельных петель соответствуют петлям из иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все из FR являются FR из последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело возможно также содержит по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), как правило человеческого иммуноглобулина. Для дополнительных деталей см. Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; и Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.

Как используют в данном описании, "выделенное" означает отделенное от других компонентов (а) природного источника, такого как растительная или животная клетка или клеточная культура, или (б) синтетической органической химической реакционной смеси. Как используют в данном описании, "очищенное" означает, что при выделении изолят содержит по меньшей мере 95%, и в другом аспекте по меньшей мере 98%, соединения (например, конъюгата) по массе изолята.

"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено и/или выделено из компонента из его естественного окружения. Загрязняющие компоненты из его естественного окружения являются материалами, которые будут препятствовать диагностическому или терапевтическому использованию антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях антитело очищают (1) до более чем 95% по массе антитела, как определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности, путем использования секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до гомогенности согласно электрофорезу на полиэтиленгликоле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием кумасси голубого или, предпочтительно, серебрянки. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, в виду того что по меньшей мере один компонент природного окружения антитела не будет присутствовать. Однако, обычно выделенное антитело получают по меньшей мере за одну стадию очистки.

Антитело, которое "индуцирует апоптоз", представляет собой антитело, которое индуцирует программируемую клеточную гибель, как определяют посредством связывания аннексина V, фрагментации ДНК, сжатия клетки, расширения эндоплазматического ретикулума, клеточной фрагментации и/или образования мембранных везикул (называемых апоптотическими тельцами). Клетка представляет собой опухолевую клетку, например, молочной железы, яичника, желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, толстой кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы или мочевого пузыря. Разные методы доступны для оценки клеточных событий, ассоциированных с апоптозом. Например, перенос фосфатидилсерина (PS) может быть измерен посредством связывания аннексина; фрагментация ДНК может быть оценена посредством электрофоретического расщепления ДНК; и конденсация ядра/хроматина наряду с фрагментацией ДНК может быть оценена посредством какого-либо увеличения в гиподиплоидных клетках.

Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству лекарственного средства, эффективного для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может снижать количество раковых клеток; уменьшать размеры опухоли; подавлять (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковой клетки в периферические органы; подавлять (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазы опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или облегчать до некоторой степени один или более симптомов, ассоциированных с раком. До той степени, с которой лекарственное средство может ингибировать рост и/или уничтожать имеющиеся раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность может, например, быть измерена путем оценки времени до прогрессирования заболевания (TTP) и/или определения степени ответа (RR).

Термин "существенное количество" относится к большинству, то есть более чем 50% популяции, смеси или образца.

Термин "внутриклеточный метаболит" относится к соединению, полученному в результате метаболического процесса или реакции внутри клетки на конъюгате антитело-лекарственное средство (ADC). Метаболический процесс или реакция может представлять собой ферментативный процесс, такой как протеолитическое расщепление пептидного линкера ADC. Внутриклеточные метаболиты включают, без ограничения, антитела и свободное лекарственное средство, которые могут подвергаться внутриклеточному расщеплению после поглощения, диффузии, захвата или транспорта в клетку.

Термины "внутриклеточно расщепленный" и "внутриклеточное расщепление" относятся к метаболическому процессу или реакции внутри клетки на ADC или подобном ему, посредством которых ковалентная связь, например, линкера между лекарственной группировкой и антителом разрушается с получением свободного лекарственного средства или другого метаболита конъюгата, диссоциированного от антитела внутри клетки. Расщепленные группировки ADC являются, таким образом, внутриклеточными метаболитами.

Термин "биодоступность" относится к системной доступности (то есть уровни в крови/плазме) данного количества лекарственного средства, введенного пациенту. Биодоступность представляет собой абсолютный термин, который указывает меру как времени (скорость), так и общего количества (степень) лекарственного средства, которое достигает общего кровотока из введенной лекарственной формы.

Термин "цитотоксическая активность" относится к уничтожающему клетку, цитостатическому или антипролиферативному эффекту ADC или внутриклеточного метаболита указанного ADC. Цитотоксическая активность может быть выражена в виде значения IC₅₀, которое равно концентрации (молярной или массовой) на единицу объема, при которой выживает половина клеток.

"Расстройство" представляет собой любое состояние, при котором может быть получена польза от лечения лекарственным средством или конъюгатом антитело-лекарственное средство. Оно включает хронические и острые расстройства или заболевания, включая такие патологические состояния, которые приводят млекопитающего к рассматриваемому расстройству. Неограничивающие примеры расстройств, подлежащих лечению по настоящему изобретению, включают доброкачественные и злокачественные новообразования; лейкоз и лимфоидные новообразования, нейрональные, глиальные, астроцитальные, гипоталамические и другие эндокринные, макрофагальные, эпителиальные, стромальные и бластоцельные расстройства; а также воспалительные, ангиогенные и иммунологические расстройства.

Термины "рак" и "раковый" относятся к или описывают физиологическое состояние или расстройство у млекопитающих, которое как правило характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. "Опухоль" содержит одну или более раковых клеток.

Примеры "пациента" включают, без ограничения, человека, крысу, мышь, морскую свинку, обезьяну, козу, корову, лошадь, собаку, кошку, птицу и домашнюю птицу. В иллюстративном воплощении пациент представляет собой человека.

Термины "лечить" или "лечение", если иное не следует по контексту, относится к терапевтическому лечению или профилактическим мерам для предотвращения обострения, где задача состоит в том, чтобы подавлять или снижать (уменьшать) нежелаемое физиологическое изменение или расстройство, такое как развитие или распространение рака. Для целей данного изобретения, благоприятные или желаемые клинические результаты включают, без ограничения, облегчение симптомов, минимизацию степени заболевания, стабилизированное (то есть не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, улучшение или облегчение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), неважно может ли это быть обнаружено или нет."Лечение" может также означать продление выживания по сравнению с ожидаемым выживанием без получения лечения. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают тех, кто уже имеет состояние или расстройство, а также тех, у кого подозревается состояние или расстройство.

В контексте рака термин "лечение" включает любое из или все из ингибирования роста опухолевых клеток, раковых клеток или опухоли; ингибирования репликации опухолевых клеток или раковых клеток, уменьшения общего очага опухоли или снижения количества раковых клеток и улучшения одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием.

В контексте аутоиммунного заболевания термин "лечение" включает любое из или все из ингибирования репликации клеток, ассоциированных с аутоиммунным болезненным состоянием, включая, без ограничения, клетки, которые продуцируют аутоиммунные антитела, уменьшения очага аутоиммунного антитела и ослабления одного или более симптомов аутоиммунного заболевания.

В контексте инфекционного заболевания термин "лечение" включает любое из или все из: ингибирования роста, размножения или репликации патогена, который вызывает инфекционное заболевание, и ослабления одного или более симптомов инфекционного заболевания.

Термин "вкладыш упаковки" используют для ссылки на инструкции, включенные в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показании(ях), использовании, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предосторожностях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.

Как используют в данном описании, термины "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используют взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают потомство. Слова "трансформанты" и "трансформированные клетки" включают первичную клетку-субъект и культуры или потомство, происходящее от них, безотносительно количества переносов. Также следует понимать, что все потомство не может быть точно идентичным по содержанию ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, как определено в отношении первоначально трансформированной клетки, также включено. Когда подразумеваются отличные обозначения, это будет ясно из контекста.

Если не указано иное, термин "алкил" сам по себе или как часть другого термина относится к прямоцепочечному или разветвленному насыщенному углеводороду, имеющему указанное количество атомов углерода (например, "C₁-C₈алкил" относится к алкильной группе, имеющей от 1 до 8 атомов углерода). Если количество атомов углерода не указано, алкильная группа имеет от 1 до 8 атомов углерода. Иллюстративные прямоцепочечные C₁-C₈алкилы включают, без ограничения, метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил и н-октил; в то время как разветвленные C₁-C₈алкилы включают, без ограничения, -изопропил, -втор-бутил, -изобутил, -трет-бутил, -изопентил и -2-метилбутил; ненасыщенные C₂-C₈алкилы включают, без ограничения, винил, аллил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 1-гексил, 2-гексил, 3-гексил, ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил и 3-метил-1-бутинил.

Если не указано иное, "алкилен" сам по себе или как часть другого термина относится к насыщенному разветвленному или прямоцепочечному или циклическому углеводородному радикалу с установленным количеством атомов углерода, как правило 1-18 атомов углерода, и имеющему два моновалентных радикальных центра, полученные при удалении двух атомов водорода от одного и того же или двух разных атомов углерода исходного алкана. Типичные алкиленовые радикалы включают, без ограничения: метилен (-CH₂-), 1,2-этилен (-CH₂CH₂-), 1,3-пропилен (-CH₂CH₂CH₂-), 1,4-бутилен (-CH₂CH₂CH₂CH₂-) и тому подобное. "C₁-C₁₀" прямоцепочечный алкилен представляет собой прямоцепочечную насыщенную углеводородную группу формулы -(CH₂)_1-10-. Примеры C₁-C₁₀алкилена включают метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентилен, гексилен, гептилен, октилен, нонилен и декален.

Если не указано иное, термин "гетероалкил" сам по себе или в комбинации с другим термином означает, если не указано иное, стабильный прямоц