Пептидное соединение, полезное для ингибирования образования амилоидных бляшек

Пептидное соединение, полезное для ингибирования образования амилоидных бляшек

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение имеет отношение к новому пептидному соединению, главным образом используемому для связывания с β-амилоидными пептидами и/или предотвращения или уменьшения образования амилоидных бляшек, главным образом за счет ингибирования полимеризации вышеупомянутого амилоидного пептида в виде амилоидных бляшек.

Настоящее изобретение также имеет отношение к использованию в качестве лекарственного средства или для подготовки или определения препаратов с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным заболеванием, главным образом у лиц пожилого возраста, характеризующимся длительным, в течение от 5 до 15 лет от начала заболевания, и необратимым снижением умственных способностей и, на более поздних стадиях болезни, потерей психомоторных функций.

Болезнь Альцгеймера является одной из наиболее частых причин деменции у пожилых людей, старше 55 лет, независимо от пола и образа жизни [1].

У некоторых пациентов заболевание может быть связано с наследственными нарушениями, но у большинства пациентов заболевание встречается спорадически, без какой-либо определенной причины [2].

По сей день не существует терапевтического метода лечения спорадических или наследственных форм данного заболевания. В настоящее время хорошо известно, что болезнь Альцгеймера не является неизбежным следствием процесса старения, а индуцирована ненормальным явлением агрегации β-амилоидных пептидов (далее «Aβ») [3, 4].

Аβ представляет собой пептид от 39 до 43 аминокислот (SwissProt ID Р05067), который образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (обозначенного далее как «APP»). Aβ пептид представляет собой соединение, которое обычно обнаруживается в биологических жидкостях, таких как кровь или цереброспинальная жидкость, в которых он присутствует в низких концентрациях от 0,5 до 5 нМ, и это одинаково как у здоровых людей, так и у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера [5, 6].

С другой стороны, прогрессирование болезни Альцгеймера характеризуется внеклеточным накоплением или отложением в головном мозге пациента так называемых амилоидных бляшек. Эти бляшки являются результатом конформации пептидного мономера Aβ в форму димеров, затем растворимых олигомеров больших размеров, а затем их агрегации в форму нерастворимых фибриллярных β слоистых агрегатов, которые, в конечном итоге, дают начало амилоидным бляшкам [7].

Тем не менее, точный молекулярный механизм явления формирования амилоидных бляшек и запуска болезни Альцгеймера остается частично необъясненным и по сей день.

Некоторые исследования по сути приписывают высокий амилоидогенный потенциал фрагментам, состоящим из аминокислот 17-42 из COOH-конца Aβ пептида [9]. Другие исследования не исключают, что фрагменты, состоящие из аминокислот 1-16 Aβ пептида из области NH₂-конца Aβ пептида, участвуют в патогенезе болезни Альцгеймера [10].

На настоящий момент, по всем этим имеющимся данным, можно сделать вывод, что 1-16 N-концевая область пептида Aβ является областью, которая несомненно участвует в наиболее убедительном и определяющем пути феномена формирования амилоидных бляшек, по следующим причинам.

Прежде всего, эта область у крыс содержит три мутации, отличающие Aβ пептид крысы от него же у других млекопитающих, даже если крысы не страдают болезнью Альцгеймера.

Был определено, что 1-16 N-концевая область является связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к Aβ пептиду [11-14]. В настоящее время было выявлено, что амилоидные бляшки характеризуются аномально высокой концентрацией двухвалентных металлов и, в частности, цинка [15]. Некоторое количество исследований и экспериментов, как in vivo так и in vitro, показали, что высокие концентрации цинка вызывают преципитацию Aβ пептида, приводящую к образованию амилоидных бляшек. Кроме того, было показано, что амилоидные бляшки более значимо образуются в окружении нейронов, имеющих высокие концентрации цинка [16-20].

Именно поэтому в настоящее время считается, что блокирование взаимодействия Aβ пептида с цинком должно привести к уменьшению агрегации Aβ пептида в виде амилоидных бляшек и тем самым предотвратить патологии, связанные с этим. Таким образом, в US 6001852, в качестве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера предлагается Клиохинол, который является цинк-хелатирующим агентом. Тем не менее, использование цинк-хелатирующего агента требует специальных мишеней в области связывающего домена, где цинк присоединяется к Aβ пептиду, с целью избегания вмешательств в нормальный гомеостаз цинка в организме.

Другие исследования [21-30] показывают, что никотиновые рецепторы ацетилхолина играют роль главной цели нейротоксичности в связи с нарушениями в холинергической и когнитивной системе, вызванными образованием амилоидных бляшек. Именно поэтому в US 7018797 метод ингибирования связывания β-амилоидных пептидов с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина был предложен для лечения нейродегенеративных заболеваний. В US 7018797, соединения, полученные из нафталина, в частности, 5,8-дигидрокси-транс-2-ди (N-пропиламино)-3-метил-1,2,3,4-тетрагидронафталин более конкретно были предложены в качестве соединений, которые могут подавлять связывание Aβ пептида с α-7 никотиновым рецептором ацетилхолина.

Другие исследования показали, что взаимодействие области 13-1 бой аминокислоты Aβ пептида (HHQK, SEQ.ID.NO.27) с клетками микроглии мозга осуществляется за счет связывания с гепарансульфатом, который является связывающей молекулой для указанных клеток, входя в категорию гликозаминогликанов. Связывание пептида Aβ с поверхностными молекулами гликозаминогликанов клеток микроглии индуцирует образование олигомеров Aβ пептидов. Молекула Трамипросата (Tramiprosate) имитирует гликозаминогликаны и ингибирует процесс олигомеризации Aβ пептидов [31-36].

В US 7314724 в качестве лекарства против болезни Альцгеймера было предложено использование растворимых форм ламининов и их фрагментов (>10 кДа), которые способны связываться с Aβ и держать его в мономерном состоянии.

Более конкретные механизмы взаимодействия между Aβ пептидами и никотиновыми рецепторами ацетилхолина, также как и с ламининами, еще не были раскрыты.

Публикация WO 93/13789 от SmithKline Beecham описывает соединения со сложной формулой, включающей олигопептиды, защищенные по обоим сторонам, общая формула которых охватывает два гекса- или гептапептида, соединенных вместе с помощью химической связи. Применение соединений, описанных в данном документе, относится к стимуляции кроветворения для защиты организма от инфекций, в частности к стимуляции миелопоэтической системы, и не объясняет механизма действия этих соединений.

US 2004/214165 описывает белковую систему экспорта у микобактерий. Последовательность 646 из 4-HAED аминокислот является просто последовательностью концевой части одного из белков микобактерий, которая участвует в процессе экспорта белка. Но эта HAED последовательность не описана в US 2004/214165 в виде формулы индивидуального изолированного олигопептида и даже меньше, так сказать тем более, в качестве терапевтически активного пептида.

EP 2130550 описывает HAED последовательность (SEQ.ID.NO.39) как паттерн белка геликазы РНК, которая активна в производстве цитокинов мононуклеарными клетками крови. Но EP 2130550 не описывает тетрапептид HAED как изолированное соединение, и, тем более, в качестве защищенного соединения и, более того, так сказать тем более, в качестве активного соединения самого по себе.

В статье Gomez-Ruiz et al. In J. Dairy Sci. 90:4966-4973 от 2007 года описывается пептид EDAK и продукт, который обнаруживается в сыре, вытекающий из деградации белков молока, вызванной брожением за счет ферментов молочнокислых бактерий или ферментов, которые были искусственно добавлены в сыры. Эта статья ни описывает, ни предполагает, что этот изолированный, очищенный тетрапептид и, тем более, защищенный защитными группами, т.е. вне его смеси с сыром, может быть соединением интереса, взятым отдельно или, тем более, может быть активным соединением сам по себе.

В статье Chu et al. in J. Am. Chem. Sco. 1995, 117, 5419-54205 описывается способ для определения тетрапептидов спектрометрически. Эти тетрапептиды определены, как связывающиеся с рецепторами, т.е. ванкомицин, только N-конец тетрапептида защищен. Тетрапептид DDAH является лишь одним из пептидов, используемых в эксперименте, выбранных для демонстрации результатов манипуляций. В статье не описываются особенности активности этого тетрапептида DDAH.

Задачей настоящего изобретения является получение нового соединения, которое может быть использовано в определении или изготовлении препарата для лечения или профилактики заболеваний, связанных с нейродегенеративными расстройствами и/или с образованием амилоидных бляшек путем полимеризации или агрегации β-амилоидных пептидов.

В частности, целью настоящего изобретения является получение нового соединения, способного ингибировать взаимодействие β-амилоидных пептидов с ионами Zn (II). Действительно, известно, что формирование амилоидных бляшек за счет агрегации или полимеризации β-амилоидного пептида индуцировано образованием комплексов цинка с β-амилоидным пептидом, цинк до не которой степени действует в качестве кофактора этой агрегации или полимеризации.

В частности, целью настоящего изобретения является получение нового соединения, способного ингибировать образование β-амилоидных бляшек и делающего возможным лечение или профилактику болезни Альцгеймера или любых других дегенеративных заболеваний, связанных с образованием амилоидных бляшек.

Для этого настоящее изобретение предусматривает пептидное соединение со следующей общей формулой (I) или (II): R a -R 1 -R 2 -R 3 -R 4 -R b      (I)  или R a -R 4 -R 3 -R 2 -R 1 -R b          (II) , где

- R¹ представляет собой аминокислотный остаток H, R и K;

- R² представляет собой аминокислотный остаток A;

- R³ представляет собой аминокислотный остаток E или D;

- R⁴ представляет собой аминокислотный остаток E или D;

- R^a представляет собой N-концевую основную аминную функцию аминокислоты R¹ и R⁴, либо свободную, либо замещенную защищенной группой, предпочтительно ацетил-группой (A_C),

- R^b представляет собой гидроксильную функцию C-концевой карбоксильной группы аминокислоты R¹ и R⁴, либо свободную, либо замещенную защищенной группой, предпочтительно группой NH₂, NH_R или NR_R с R, представляющей собой C1-C4 алкильную цепь, т.е. соответствующую группе амидного типа, предпочтительно амидной группе (NH₂).

Понятно, что пептидные соединения, в соответствии с настоящим изобретением, предназначены для того, чтобы быть индивидуально выделенными и очищенными соединениями, со степенью чистоты предпочтительно более 98%, предпочтительно по меньшей мере 99%, остатки могут быть сформированы с другими пептидами между прочим.

Известным способом и предпочтительно, аминокислоты R¹, R², R³, R⁴ должны иметь конфигурацию в форме их естественных изомеров L. Но аминокислоты R¹, R², R³ и R⁴, также могут быть аналогами с D конфигурацией.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы пептидное соединение, соответственно настоящему изобретению, имело степень чистоты L-изомера более чем 98%, предпочтительно по меньшей мере 99% L-изомеров.

Изобретатели определили эти тетрапептиды путем характеристики различных аминокислот по связыванию тетрапептида с сайтом EVHH (SEQ.ID.NO.28) области 11-14 β-амилоида, в то время как охарактеризованные аминокислоты R¹, R³ и R⁴, ионно противоположного знака, т.е. в состоянии сформировать сильные ионные связи с аминокислотой E (глутаматом) в позиции 11 для R¹ и, соответственно, с Н (гистидином) в позициях 13 и 14 для R³ и, соответственно, R⁴, т.е. с 3мя из потенциально участвующих сайтов связывания ионов Zn (II) с β-амилоидом, и гидрофобная аминокислота A (аланин) способны формировать сильный гидрофобный эффект с V.

Тем самым охарактеризованные тетрапептиды формируют параллельные (формула I) и антипараллельные (формула II) нековалентные взаимодействия с EVHH мишенью области 11-14 β-амилоида. Учитывая тот факт, что три из четырех аминокислот в EBHH регионе-мишени имеют сильно заряженные группы, предпочтительнее аминокислоты, имеющие ионную комплементарность с этими тремя аминокислотами, в то время как выбор аминокислоты R² был сделан в зависимости от рассмотрения стерической комплементарности между боковыми цепями аланина и валина, даже дальнейшей стабилизации за счет гидрофобных контактов между V и A, ионными связями с E и H.

Изобретатели экспериментально показали, что тетрапептиды, как указано выше, связываются с 3-мя хелатирующими агентами иона Zn (II), а именно с аминокислотами в позициях 11, 13 и 14, которые представляют собой оптимальный компромисс, по сравнению с другими соответствующими мишенями различных размеров, содержащими 1-4 хелатирующих агентов Zn (II), выбранных из позиций 6, 11, 13 и 14, особенно из областей, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 11-16, 5-14 и 9-14, и по другим критериям определения, в частности, по размеру пептида, а именно оптимальным компромиссом является возможность использования указанного соединения в естественных условиях для ингибирования связывания ионов Zn (II) с β-амилоидным пептидом (Aβ) и для торможения олигомеризации β-амилоидного пептида, путем связывания тетрапептида с доменом для связывания ионов Zn (II) β-амилоидного пептида (Aβ).

Похоже, что сила взаимодействия может быть подорвана связью в положении 6. Наоборот, мишень, которая перекрывает только два сайта в позициях 6 и 11 или 13 и 14, недостаточна для ингибирования связывания ионов Zn (II).

Еще одно преимуществом тетрапептидов, соответственно данному изобретению, является то, что они сильно электрически заряжены, что способствует возможности их прохождения через гематоэнцефалический барьер.

Пептидные соединения включают в себя, в частности, последовательности R¹-R²-R³-R⁴ и R⁴-R³-R²-R¹, определенные формулами I и II в Таблице 1, приведенной ниже, и повторяются в последовательностях SEQ.ID.NO. с 1 по 24 из списка последовательностей, приложенных к описанию.

Таблица 1
SEQ.ID.NO.1=HADD
SEQ.ID.NO.2=DDAH
SEQ.ID.NO.3=KADD
SEQ.ID.NO.4=DDAK
SEQ.ID.NO.5=RADD
SEQ.ID.NO.6=DDAR
SEQ.ID.NO.7=HAED
SEQ.ID.NO.8=DEAH
SEQ.ID.NO.9=KAED
SEQ.ID.NO.10=DEAK
SEQ.ID.NO.11=RAED
SEQ.ID.NO.12=DEAR
SEQ.ID.NO.13=HADE
SEQ.ID.NO.14=EDAH
SEQ.ID.NO.15=KADE
SEQ.ID.NO.16=EDAK
SEQ.ID.NO.17=RADE
SEQ.ID.NO.18=EDAR
SEQ.ID.NO.19=HAEE
SEQ.ID.NO.20=EEAH
SEQ.ID.NO.21=KAEE
SEQ.ID.NO.22=EEAK
SEQ.ID.NO.23=RAEE
SEQ.ID.NO.24=EEAR

Аффинность этих тетрапептидов с лигандами, соответствующими фрагменту 1-16 области β-амилоидного пептида, была проверена путем вычисления константы диссоциации, Kd, в Примерах с 1 до 3. Их константы диссоциации меньше, чем у других исследованных пептидов: тетрапептидов, трипептидов, гексапептидов или декапептидов, не входящих в это определение по фактору 10⁴.

Известным способом, указанные защитные группы являются группами совместимыми с фармацевтическим использованием в естественных условиях. Функцией защитных групп является нейтрализация электрического заряда амино- и карбоксильных концов пептида. В частности, N-конец может быть защищен формил группой (HCO-) или ацетил группой (CH₃CO-), и C-конец может быть защищен группами -NH₂, -NHR, -NRR, где R является C₁-C₄ алкилом или в дальнейшем -O-R, где R является C₁-C₄ алкилом или алкиламином, таким как -OCH₃, -OCH₂CH₃ или -OCH₂CH₂NH₂.

Следует напомнить, что:

- гидрофобными аминокислотами с неполярной группой являются аланин (A), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I), метионин (M), фенилаланин (F), пролин (P) и триптофан (W),

- гидрофобными аминокислотами с полярной группой являются глицин (G), серии (S), треонин (T), цистеин (C), тирозин (Y), аспарагин (N) и глутамин (Q),

- аминокислотами с отрицательно заряженной группой в нейтральной (кислой) pH являются аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (E), и

- аминокислотами с положительно заряженной группой в нейтральной (основной) pH являются лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H).

Все природные а аминокислоты являются хиральными, поэтому оптически активными, за исключением глицина, и все находятся в L конфигурации, в соответствии с FISHER конфигурацией, или в S конфигурации, в соответствии с системой обозначений Кана-Ингольда-Прелога.

Встречаются три важных типа взаимодействия в связях между пептидами или во вторичных структурах пептидов, таких как α спирали или тип β складчатые слои, получающиеся в результате образования водородных связей между CO и NH группами основного скелета пептида, а именно:

- гидрофобный эффект: аминокислоты, для которых радикалы являются гидрофобными, имеют большее сродство друг к другу, чем для молекул воды, окружающих белок. И наоборот, гидрофильные аминокислоты, как правило, располагаются таким образом, чтобы быть в контакте с водой,

- ионные связи: радикалы, которые положительно заряжены, образуют ионные связи с теми, которые заряжены отрицательно, и

- водородные связи, которые имеются во взаимодействиях, которые менее сильные, чем те, что образовались в результате ионной связи и гидрофобного эффекта.

Предпочтительно пептидное соединение, соответственно данному изобретению, выбранное из соединений с формулой (I) или (II), где R¹-R²-R³-R⁴ или, соответственно, R⁴-R³-R²-R¹ представлено HAEE, EDAR, EEAH, EEAK, EEAR, HADE, KADD, KAEE, RADD, RADE, RAEE, HADD, DDAK, KAED, DEAR или KADE. Эти пептиды соответствуют в различном порядке последовательности SEQ.ID.NO.1, 3, 4, 5, 9, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 и 24.

Тетрапептиды, указанные выше, имеют константы диссоциации их взаимодействия с фрагментом 1-16 области β-амилоида, Kd, как рассчитано в Примерах 1-3 ниже, которые ниже, чем для других исследованных пептидов.

Более предпочтительно, пептидное соединение, соответственно данному изобретению, из числа соединений с формулой (I) или (II), где R¹-R²-R³-R⁴ или R⁴-R³-R²-R¹ представлено одним из тетрапептидов: HADD, DDAK, RADD, KAED, DEAR, KADE, HAEE и RAFE. Эти пептиды соответствуют последовательностям SEQ.ID.NO.1, 4, 5, 9, 12, 15, 19 и 23, соответственно. Они имеют еще более низкие константы диссоциации, Kd, чем у других исследованных пептидов, как рассчитано в Примерах от 1 до 3.

Более предпочтительно, пептидное соединение, соответственно данному изобретению, выбранное из соединений с формулой (I) или (II), где R¹-R²-R³-R⁴ или R⁴-R³-R²-R¹, представлено одним из двух тетрапептидов HAEE и RADD.

- R¹ представляет собой аминокислотный остаток H,

- R² представляет собой аминокислотный остаток A,

- R³ представляет собой аминокислотный остаток E,

- R⁴ представляет собой аминокислотный остаток E.

Наиболее предпочтительные пептидные соединения соответствуют формулам Ac-HAEE-NH₂ и Ac-RADD-NH₂.

Константы диссоциации взаимодействия, Kd, обоих этих пептидов с лигандом соответствующим фрагменту 1-16 области β-амилоида, в Примере 1, были самыми низкими из всех протестированных пептидов.

Оба эти пептидные соединения, также выступают как наиболее представительные в условиях ингибирования связывания ионов Zn (II) с β-амилоидным пептидом и ингибирования полимеризации или агрегации β-амилоидного пептида в виде бляшки, в присутствии физиологических концентраций ионов Zn (II), в особенности от 100 до 400 мкМ, путем связывания указанного β-амилоидного пептида, но, прежде всего, оба этих пептидных соединения обладают свойствами ингибирования образования амилоидных бляшек в естественных условиях на мышиных моделях, наиболее представительные из них описаны в Примерах ниже.

Объектом настоящего изобретения является также применение пептидного соединения, соответственно данному изобретению, для уменьшения или предотвращения связывания ионов Zn (II) с β-амилоидным пептидом путем связывания указанного пептидного соединения с указанным β-амилоидным пептидом.

Еще более конкретно, объектом настоящего изобретения является использование пептидного соединения, соответственно данному изобретению, для уменьшения или предотвращения полимеризации и/или агрегации β-амилоидного пептида, в присутствии ионов Zn (II), более конкретно в физиологических концентрациях ионов Zn (II), в особенности от 100 до 400 мкМ, путем связывания указанного пептидного соединения с указанным β-амилоидным пептидом.

Следовательно, настоящее изобретение относится к применению пептидного соединения, соответственно данному изобретению, для лечения заболеваний, связанных с образованием амилоидных бляшек.

Объектом настоящего изобретения является также применение пептидного соединения, соответственно данному изобретению, в качестве лекарственного средства, в особенности, для лечения нейродегенеративных заболеваний и, предпочтительно, для лечения болезни Альцгеймера.

Объектом настоящего изобретения является также применимая композиции для использования, соответственно данному изобретению, в которой активное вещество содержит, по меньшей мере, один остаток R¹-R²-R³-R⁴ или R⁴-R³-R²-R¹ пептидного соединения, соответственно данному изобретению.

Активное вещество может быть мультимером, состоящим из нескольких мономеров с последовательностью R¹-R²-R³-R⁴ или R⁴-R³-R²-R¹, связанных через связи, способные продолжительно во времени разлагаться в организме и тем самым освобождать тетрапептид, активный мономер.

Известным способом, пептидное соединение, соответственно данному изобретению, может быть сформулировано в виде эфира или их физиологически приемлемых производных солях.

Более конкретно, объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая соединение, соответственно данному изобретению, или активная субстанция, содержащая, по меньшей мере, один R¹-R²-R³-R⁴ или R⁴-R³-R²-R¹ остаток пептидного соединения, соответственно данному изобретению, с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно проходящим через парентеральный, чрескожный или чресслизистый путь.

Более конкретно, фармацевтическая композиция, соответственно данному изобретению, будет сформулирована так, чтобы быть инъекционной, особенно для внутрисосудистого, внутримышечного, подкожного, внутриспинного или цереброспинального пути.

Другие способы введения, такие как оральный, букальный, назальный, ректальный или местный путь, могут быть предусмотрены при условии, что пептидное соединение, соответственно данному изобретению, составлено в такой форме, чтобы выдерживать деградацию до достижения клеток-мишеней головного мозга.

Более предпочтительно, указанная композиция представлена в лиофилизированной форме.

Более конкретно, в композиции, соответственно настоящему изобретению, концентрация указанного пептидного соединения составляет от 20 до 2000 мкМ. Следующие примеры описывают и демонстрируют эффективность пептидного соединения, соответственно данному изобретению, и даны только в качестве иллюстрации и не должны быть истолкованы, как ограничение изобретения.

В свете примеров, приведенных ниже, другие признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными.

Фиг.1 Показаны кинетические кривые для связывания пептида Ac-HAEE-NH₂ с лигандом, соответствующим 1-16 области β-амилоида, в различных концентрациях, т.е. кривая A = 2 мкМ, кривая B = 5 мкМ, кривая C = 10 мкМ, кривая D = 15 мкМ, кривая E = 20 мкМ, кривая F = 25 мкМ и кривой G = 0 мкМ, с оборудованием и в соответствии с процедурой Примера 1.

Фиг. от 2 до 9. Представлены кинетические кривые для связывания пептидов последовательности SEQ.ID.NO.1, 4, 5, 9, 12, 15, 19 и 23, соответственно с оборудованием и по методике Примера 3, указанный тетрапептид должен быть более очищенным, чем в Примере 1.

Вариации единиц ответа спектрометра на оси ординат (EO = единица ответа) в течение времени дают возможность вычисления константы диссоциации, Kd, связей тетрапептида с фрагментом области 1-16 β-амилоида пептида, как описано в Примерах 1 и 3.

Пример 1: связывание тетрапептида Ac-HAEE-NH₂ (SEQ.ID.NO.19.) с иммобилизованным пептидным фрагментом, соответствующим 1-16 области β-амилоидного пептида.

Анализ был проведен при помощи поверхностно-плазмонно-резонансной спектроскопии (SPR) связей тетрапептида Ac-HAEE-NH₂ с иммобилизованным пептидным фрагментом, соответствующим области 1-16 β-амилоидного пептида.

С помощью этого анализа возможно вычислить константу диссоциации, Kd, взаимодействия пептида с иммобилизованным лигандом, было понятно, что значение Kd тем меньше, чем выше взаимодействие с лигандом и, следовательно, устойчивость образовавшегося комплекса взаимодействия высокая. В этих способах, считается, что значимое специфическое взаимодействие присутствует, если Kd меньше или равна 10^-4 М. С другой стороны, если Kd больше или равна 10^-3 М, считается, что нет значимого связывания или взаимодействия.

Поверхностным плазмонным резонансом является физическое явление, в основном известное за счет его использования в качестве метода измерения связи лиганда с рецептором, адсорбированным на поверхности металлического слоя. Система детекции SPR измеряет вариацию показателя преломления в непосредственной близости от границы, когда лиганд связывается с рецептором.

Принципы поверхностно-плазмонно-резонансной спектроскопии описаны в Nagata, K. и Handa, H. (eds), Springer-Verlag, Tokyo, 2000.

Более конкретно, в системе SPR-спектроскопии, например, применяя биосенсоры от BIACORE, после иммобилизации лигандов на поверхности датчика типа чипа, в данном случае на указанном β-амилоидном фрагменте, аналитический реагент вводится на указанную поверхность с постоянной скоростью потока через систему микрофлюидных каналов. Поляризованный свет, излучаемый источником света, отражается от покрытой золотом поверхности чипа, а затем детектируется диодным ридером. Соответственно связыванию лиганда и аналитической молекулы отличается интенсивность отраженного света. Изменение ответа спектрометра (EO = единица ответа) позволяет рассчитать константу диссоциации взаимодействия.

Чипы биосенсора получены из GE Healthcare (США). SPR-спектроскопические эксперименты были проведены на аппарате BIACORE 3000. Реагенты для иммобилизации фрагмента β-амилоидного пептида (EDC, NHS, PDEA и цистеин) были куплены у GE Healthcare (США). Буфером, используемым для иммобилизации пептидного лиганда за счет образования тиоловых связей, являлся 10 мМ ацетат натрия при pH 4,5. Регенерирующим буфером являлся HBS буфер, содержащей среду с 10 мМ HEPES и 3 мМ EDTA, 0,005% сурфактантом P20 и 150 мМ NaCl при pH 7,4. Иммобилизационным буфером являлся HBS буфер при pH 7,4 и HEPES буфер при pH 6,8, 50 мМ, со 100 мкМ ионов Zn (II) для реактивного тетрапептида Ac-HAEE-NH₂. Все буферы были профильтрованы перед использованием.

Пептидным фрагментом лиганда был: Ac-DAEFRHDSGYEVHHQKGGGGC-NH₂, соответствующий последовательности SEQ.ID.NO.26. Этот пептид с 21 аминокислотами содержит 16 аминокислот N-концевого связывающего домена β-амилоида, т.е. DAEFRHDSGYEVHHQK (SEQ.ID.NO.25), за которым следует 4 аминокислоты глицин и цистеин С-конца. Цистеин является необходимым для иммобилизации лиганда на поверхности чипа с помощью тиоловых связей, в соответствии с процедурой поставщика. 4 аминокислоты глицина вследствие этого образуют связывающий тетрапептид ("линкер") между чипом и лигандом. Кроме того, таким образом иммобилизованный лиганд обладает достаточной гибкостью по отношению к поверхности, так законно имитируя условия взаимодействия между тетрапептидным реагентом и лигандом. Этот лиганд был привязан на CM5 чип биосенсора, следуя стандартной процедуре через тиоловые связи в условиях, описанных в руководстве датчика, предоставляемом поставщиком GE Healthcare (США).

Скорость потока, применявшаяся на всех этапах, составляла 5 мкл/мин. Карбоксиметил декстрановая матрица была активирована путем добавления смеси в соотношении 1:1 из 1-этил-3 (3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS), т.е. 30 мкл EDC на 400 мМ и NHS на 100 мМ, с последующим введением 80 мМ PDEA (2(2 пиридинилдитио)-этан амин) в растворе 0,1 М бората натрия при pH 8,5. Затем был добавлен пептидный лиганд в буферном растворе ацетата натрия в количестве 0,05 мг/мл. Тиоловые группы, не вступившие в реакцию на поверхности CM5 чипов, были удалены с помощью 50 мМ раствора цистеина в 0,1 М буферном растворе ацетата натрия при pH 4, с тем, чтобы обеспечить поверхность, которая дала бы вариацию единиц ответа (EO) около 700 условных единиц с контрольным образцом жидкости. Контрольная жидкость взаимодействует с поверхностью чипа в соответствии с той же процедурой.

Реагент Ac-HAEE-NH₂ был подготовлен путем разбавления 7 концентраций, т.е. 0, 2, 5, 10, 15, 20 и 25 мкМ, и введен в многоканальном режиме (20 мкл QUICKINJECT, 5 мкл/мин). Поверхность чипа был открыта на 330 секунд для буферного раствора реагента для того, чтобы отследить его связывание. Поверхность чипа затем регенерировалась путем введения регенерирующего буфера (20 мкл). Данные контрольной полоски были вычтены из сырых данных для полос, соответствующих иммобилизованным пептидам реагента. Далее, была рассчитана константа диссоциации, Kd, известным способом, от кривых, установленных для равновесного ответа (REQ) от концентрации (M) в оценке программой BIA 4,1. Затем были введены 7 образцов реагента в различных концентрациях в каналы с иммобилизованными лигандами на поверхности чипа.

Кривые кинетического связывания Ac-HAEE-NH₂ с иммобилизованными пептидами, после вычитания ответов контроля, описаны на Фиг.1.

Кривые на Фиг.1 дают возможность вычисления константы диссоциации, Kd, взаимодействий, которые были оценены в 2,2×10^-8 М.

В присутствии физиологических концентраций ионов Zn (II) (100-400 мкМ), константа диссоциации была практически неизменной. Тем не менее, высокие концентрации ионов Zn (II) (10 мМ) подавляли взаимодействие лиганда с реагентом. Если считать, что связывание ионов Zn (II) с Aβ пептидом характеризуются микромолярными (мкМ) значениями Kd, может быть предположено, что реагент Ac-HAEE-NH₂ конкурирует с ионами Zn (II) за связывание с Aβ пептидом. Однако, аффинность реагента с Aβ пептидом значительно выше, чем у ионов Zn (II), так что пептид Ac-HAEE-NH₂ предотвращает связывание ионов Zn (II) с пептидом Aβ при физиологических концентрациях.

Более конкретно, аффинность Ac-HAEE-NH₂ реагента и Aβ амилоида больше, чем у ионов Zn (II).

Эксперименты показали, что в присутствии физиологических концентраций ионов Zn (II) на микромолярном уровне (менее 500 мкМ), связывание HAEE с 1-16 областью β-амилоида практически не изменяется в присутствии или в отсутствие ионов Zn (II). С другой стороны, более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействие между НАЕЕ и 1-16 областью Aβ. Эти данные показывают, что HAEE имеет большее сродство к области-мишени, чем ионы Zn (II), и способен блокировать взаимодействие между ионами Zn (II) и Aβ, когда ионы Zn (II) находятся в физиологических концентрациях.

Пример 2: Сравнительный пример

Ниже описаны эксперименты для связывания пептидного лиганда-мишени с соответствующей 1-16 областью β-амилоида, проводимые с другими пептидами в соответствии с процедурой, описанной в Примере 1.

1 - Все 23 других тетрапептида, перечисленных в таблице 1, соответствующие SEQ последовательности SEQ.ID.NO. от 1 до 18 и от 20 до 24 с теми же защитными группами R^a=Ac и R^b=NH₂, были протестированы, и их константы диссоциации, Kd, были от 10^-5 до 10^-6 М. Эти константы диссоциации практически не менялись в присутствии цинка в физиологических концентрациях от 100 до 400 мкМ. Тетрапептидами, соответственно данному изобретению, имеющими низкую константу диссоциации, Kd, (за исключением HAEE), были: EDAR, EEAH, EEAK, EEAR, HADE, KADD, KAEE, RADD, RADE, RAEE, HADD, DDAK, KAED, DEAR и KADE.

Эти значения соответствуют прочным связям с целевым лигандом 1-16 области β-амилоидного пептида.

2 - Другие сравнительные примеры с 10 различными тетрапептидами, аналогичные тетрапептидам из Таблицы 1, но где одна аминокислота была заменена на аланин (A), т.е. указаны следующие тетрапептиды: AAEE, HAEA, HAAE, AADD, HAAD, HADA, AADE, RADA, RAAE, KAAE. соответствующие этим последовательности SEQ.ID.NO. от 29 до 38, соответственно, имели значительно большую константу диссоциации, т.е. Kd от 10^-3 до 10^-4 М, что соответствует неспецифическому или незначимому взаимодействию с целевым лигандом.

SEQ.ID.NO.29 взята из SEQ.ID.NO.23, в которой первая аминокислота R была заменена на A.

SEQ.ID.NO.30 взята из SEQ.ID.NO.19, где последняя аминокислота E была заменена на A.

SEQ.ID.NO.31 взята из SEQ.ID.NO.19, где третья аминокислота E была заменена на A.

SEQ.ID.NO.32 взята из SEQ.ID.NO.5, в которой первая аминокислота R была заменена на A.

SEQ.ID.NO.33 взята из SEQ.ID.NO.7, в которой третья аминокислота E была заменена на A.

SEQ.ID.NO.34 взята из SEQ.ID.NO.1, в которой последняя аминокислота D была заменена на A.

SEQ.ID.NO.35 взята из SEQ.ID.NO.13, в которой первая аминокислота H была заменена на A.

SEQ.ID.NO.36 взята из SEQ.ID.NO.5, в которой последняя аминокислота D была заменена на A.

SEQ.ID.NO.37 взята из SEQ.ID.NO.23, где третья аминокислота E была заменена на A.

SEQ.ID.NO.38 взята из SEQ.ID.NO.21, в которой третья аминокислота E была заменена на A.

Были протестированы 3-10 различных трипептида, соответствующих тетрапептиду SEQ.ID.NO.19 (HAEE), где были удалены 1, 2 или 3 аминокислоты в соответствии со следующими последовательностями SEQ.ID.NO. от 59 до 68: AEE, HAO, SHA, GHA, EEQ, AHA, IAH, FSH, ESD, ISH. Следует отметить, что ранее был описан трипептид AEE, соответствующий комплементарному трипептиду из 12-14 области в соответствии с критериями комплементарности. Эти трипептиды комплементарны областям Aβ пептидов, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15 и 14-16.

Эти 10 различных трипептидов имеют константу диссоциации от 10^-3 до 10^-4 М, что отражает отсутствие значимого или специфического взаимодействия с мишенью.

4 - Кроме того, были протестированы 10 различных гексапептидов, включая тетрапептид SEQ.ID.NO.19 (HAEE), предпочтительно соответственно данному изобретению, с добавлением 2ух аминокислот на их N-конце или на C-конце, а именно следующие гексапептиды: HAEESD, HAEEAD, HAEESE, HAEEGE, HAEEQE, LAHAEE, IAHAEE, FSHAEE, LGHAEE, ISHAEE. Эти гексапептиды комплементарны областям Aβ пептида 11-16 и 9-14.

Эти 10 гексапептидов, которые повторяются в списке последовательностей в SEQ.ID.NO. от 39 до 48, также имеют относительно высокие константы диссоциации, Kd, от 10^-3 до 10^-4 М, которые отражают отсутствие значимого или специфического взаимодействия с лигандом 1-16 области β-амилоида.

Все эти 10 гексапептиды соответствуют последовательностям, для которых 2 дополнительные аминокислоты могут взаимодействовать с аминокислотами 15-16 (QK) β-амилоида N-концевого удлинения и с аминокислотами GY области 9-10 (GY) в β-амилоида, в соответствии с ионными или гидрофобными взаимодействиями, как описано ранее.

5 - Наконец, были протестированы 10 декапептидов, взятых из списка последовательностей в следующей последовательности SEQ.ID.NO. от 49 до 58: HSLAHAEESD, KNIAHAEEAD, RNFSHAEESE, KQLGHAEEGE, RQISHAEEQE, DDHSLAHAEE, EEKNIAHAEE, EERNFSHAEE, DEKQLGHAEE, DERQISHAEE, и они имеют константы диссоциации, Kd, от 10^-3 до 10^-4 М, которые отражают отсутств