Хелперный пептид ракового антигена

Хелперный пептид ракового антигена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

2420-180885RU/015

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение относится к хелперному пептиду WT1, полинуклеотиду, кодирующему этот пептид, WT1-специфическим хелперным Т-клеткам, индуцируемым этим пептидом, фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака, содержащей их, и т.п. Данная заявка заявляет приоритет в отношении Японской патентной заявки № 2009-105286, поданной 23 апреля 2009 года, причем описание Японской патентной заявки № 2009-105286 включено здесь посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген WT1 (ген опухоли Вильмса 1) является геном, идентифицированным в качестве этиологического фактора опухоли Вильмса, которая является раком почки у детей (непатентные документы 1 и 2), и представляет собой фактор транскрипции, имеющий структуру “цинковых пальцев”. Сначала этот ген WT1 считали геном-супрессором рака. Однако, последующее исследование показало, что вышеуказанный ген служит скорее в качестве ракового гена в опухолях гемопоэтических органов и солидных раковых опухолях (непатентные документы 3-6).

Поскольку ген WT1 высоко экспрессируется во многих злокачественных опухолях, продукт гена WT1, который является аутобелком, не имеющим мутации, проверяли на наличие или отсутствие иммуногенности in vivo. В результате, было показано, что белок, полученный из этого гена WT1, экспрессируемый в высокой степени в опухолевых клетках, фрагментируется внутриклеточным процессингом, и полученный пептид образует комплекс с молекулой МНС класса I, который экспонируется (представляется) на поверхности клетки, и что цитотоксические Т-клетки (далее называемые здесь CTL), узнающие такой комплекс, могут индуцироваться вакцинацией пептидом WT1 (непатентные документы 7-9). Было также показано, что мыши, иммунизированные пептидом WT1 или кДНК WT1, отторгают имплантируемые WT1-ген-экспрессирующие опухолевые клетки в высокой степени (непатентные документы 7 и 10), но нормальные ткани, эндогенно экспрессирующие ген WT1, не повреждаются индуцированными CTL. До этого, предполагали с большой уверенностью, что можно индуцировать WT1-специфическиие CTL не только в мышах, но также и в человеке, и что такие CTL имеют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, экспрессирующих в высокой степени ген WT1, но не имеют цитотоксической активности против нормальных клеток, эндогенно экспрессирующих этот ген WT1 (непатентные документы 7 и 10-14).

С другой стороны, сообщалось, что присутствие хелперных Т-клеток, специфических в отношении ракового антигена, является важным для эффективной индукции CTL (непатентный документ 15). Эти хелперные Т-клетки (CD-4-положительные Т-клетки) индуцируются, пролиферируют и активируются узнаванием комплекса молекулы МНС класса II с антигенным пептидом на антигенпрезентирующих клетках. Активированные хелперные Т-клетки продуцируют цитокины, такие как IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, или интерферон (IFN) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, считается, что связывание антигенного пептида с молекулой МНС класса II эффективно активирует CTL и другие клетки посредством индукции хелперных Т-клеток и усиливает иммунную функцию (непатентный документ 16). До этого сообщалось только связывание антигенного пептида с HLA-DRB1*0401 и HLA-DRB1*0405 молекулы МНС класса II в отношении WT1 (непатентный документ 17 и патентный документ 1), и необходимо было найти антигенные пептиды для других подтипов.

ДОКУМЕНТЫ ИЗВЕСТНОГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Непатентные документы

Патентный документ 1: International Publication № WO 2005/045027

Непатентные документы:

Непатентный документ 1: Daniel A. Harber et al., Cell. 1990 Jun 29; 61(7): 1257-69.

Непатентный документ 2: Call K.M. et al., Cell. 1990 Feb 9; 60(3): 509-20.

Непатентный документ 3: Menke A.L., Int Rev. Cetol. 1998; 181: 151-212. Review.

Непатентный документ 4: Yamagami T. Et al., Blood. 1996 Apr 1: 87(7): 2878-84.

Непатентный документ 5: Inoue K. et al., Blood. 1998 Apr 15; 91(8): 2969-76.

Непатентный документ 6: Tsuboi A. et al., Leuk Res. 1999 May; 23(5): 499-505.

Непатентный документ 7: Oka Y. et al., J. Immunol. 2000 Feb 15; 164(4): 1873-80.

Непатентный документ 8: Melief C.J. et al., Immunol. Rev. 1995 Jun; 145: 167-77.

Непатентный документ 9: Ritz J, J. Clin. Oncol. 1994 Feb; 12(2): 237-8.

Непатентный документ 10: Tsuboi A. Et al., J. Clin. Immunol. 2000 May; 20(3): 195-202.

Непатентный документ 11: Oka Y. et al., J. Immunogenetics. 2000 Feb; 51(2): 99-107.

Непатентный документ 12: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.

Непатентный документ 13: Gao L. et al., Blood. 2000 Apr 1; 95(7): 2198-203.

Непатентный документ 14: Ohminami H. et al., Blood. 2000 Jan 1; 95(1): 286-93.

Непатентный документ 15: Cancer. Res. 62: 6438, 2002.

Непатентный документ 16: J. Immunol. Immunother., 24: 195, 2001.

Непатентный документ 17: Cancer. Immunol. Immunother. 51: 271, 2002.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ ЭТИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Таким образом, целью, которая должна быть достигнута данным изобретением, является обеспечение пептида, индуцирующего WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с различными молекулами МНС класса II, полинуклеотида, кодирующего этот пептид, WT1-хелперных Т-клеток, индуцируемых этим пептидом, и фармацевтической композиции для лечение/предупреждения рака, содержащей их.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ЭТИХ ПРОБЛЕМ

Авторы этого изобретения провели интенсивные исследования для достижения этой цели. В результате, они обнаружили, что пептид, имеющий часть последовательности смежных аминокислот, представляющей белок WT1, функционирует в качестве ракового антигенного хелперного пептида, другими словами, этот пептид экспонируется (представляется) на антигенпрезентирующих клетках связыванием с молекулой МНС класса II и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и показали, что этот пептид может быть использован в фармацевтической композиции для лечения/предупреждения рака.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает:

(1) Пептид, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1, и индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки связыванием с молекулой МНС класса II, где эта аминокислотная последовательность выбрана из группы, состоящей из:

(а) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:3;

(b) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4;

(с) аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, и

(d) аминокислотной последовательности, в которой одна или несколько аминокислот являются замещенными, делетированными или добавленными в аминокислотных последовательностях, изображенных в (а)-(с);

(2) Пептид по (1), где этой аминокислотной последовательностью является аминокислотная последовательность, изображенная в SEQ ID NO:3;

(3) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102;

(4) Пептид по (1) или (2), где эта молекула МНС класса II выбрана из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 и DQB1* 0601;

(5) Полинуклеотид, кодирующий пептид по любому из (1)-(4);

(6) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по (5);

(7) Антитело против пептида по любому из (1)-(4) или полинуклеотид по (5);

(8) Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения рака, содержащая пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);

(9) Способ лечения или предупреждения рака, который предусматривает введение эффективного количества пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) субъекту, имеющему молекулу МНС класса II по (3) или (4);

(10) Применение пептида по любому из (1)-(4), полинуклеотида по (5) или вектора по (6) для лечения или предупреждения рака;

(11) Антигенпрезентирующие клетки, которые экспонируют (представляют) пептид по любому из (1)-(4) посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4);

(12) Способ индукции антигенпрезентирующих клеток, который предусматривает культивирование незрелых антигенпрезентирующих клеток в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию антигенпрезентирующих клеток, которые экспонируют (представляют) этот пептид посредством молекулы МНС класса II по (3) или (4), из незрелых антигенпрезентирующих клеток;

(13) WT1-специфические хелперные Т-клетки, которые индуцируются пептидом по любому из (1)-(4);

(14) Способ индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, который предусматривает культивирование мононуклеарных клеток периферической крови в присутствии пептида по любому из (1)-(4) и индукцию WT1-специфических хелперных Т-клеток из этих мононуклеарных клеток периферической крови;

(15) Набор для индукции WT1-специфических хелперных Т-клеток, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4);

(16) Набор для предупреждения или лечения рака, содержащий, в качестве существенного ингредиента, пептид по любому из (1)-(4), полинуклеотид по (5) или вектор по (6);

(17) Способ определения присутствия или количества WT1-специфических хелперных Т-клеток в субъекте, имеющем молекулу МНС класса II по (3) или (4), причем указанный способ предусматривает стадии:

(а) реакции пептида по любому из (1)-(4) с пробой, полученной из этого субъекта; и затем

(b) определения присутствия или количества цитокина, содержащегося в этой пробе.

ЭФФЕКТЫ ЭТОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно данному изобретению, можно получать хелперные пептиды WT1, которые связываются со многими типами молекул МНС класса II, такими как DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102, фармацевтическую композицию для лечения/предупреждения рака, включающую в себя их и т.п. Таким образом, становится возможной индукция WT1-специфических хелперных Т-клеток in vivo и in vitro в различных субъектах (в частности, большинство японцев имеют вышеуказанные молекулы). Поскольку WT1-специфические хелперные Т-клетки индуцируются данным изобретением, можно также эффективно активировать Т-клетки и В-клетки в раке, экспрессирующем WT1 в высокой степени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме каждым из трех пептидов (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), с каждым пептидом. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом.

Фиг.2 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток после стимуляции каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, которую получали обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), с каждым соответствующим пептидом в присутствии анти-МНС класса I или II-антитела. На этом рисунке, символ “-“ показывает отсутствие стимуляции пептидом. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.

Фиг.3 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток каждой WT1-пептид-специфической Т-клеточной линии в ответ на клетки С1498, клетки С1498, обработанные в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄), а также клетки С1498, имеющие усиленную экспрессию белка WT1. Символ “имп/мин” в ординате показывает количество импульсов в минуту.

Фиг.4 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности в каждой пептид-специфической Т-клеточной линии, полученной обработкой в импульсном режиме тремя пептидами (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄).

Фиг.5 показывает результаты, полученные измерением CTL-цитотоксической активности трех пептидов (mWT1₃₅, mWT1₈₆ и mWT1₂₉₄). ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанные в импульсном режиме пептидом WT1₁₂₆ (рестриктированным МНС класса I пептидом). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS.

Фиг.6 показывает схематическое изображение временного ряда при проведении имплантации опухоли и иммунизации в эксперименте с имплантацией опухоли. Иммунизацию хелперным пептидом mWT1₃₅ проводили в 7-й, 14-й и 21-й дни после подкожной имплантации WT1-экспрессирующих лейкозных клеток мышам и вскрытие проводили в 29-й день. Направленные вниз белые стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили контроль (ЗФР) (IFA/30 мкл). Направленные вниз черные стрелки показывают временные точки, в которых внутрикожно вводили хелперный пептид mWT1₃₅ (50 мкМ/IFA/30 мкл).

Фиг.7 показывает размеры опухолей в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅, и долю не имеющих заболевания популяций мышей. В мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅, 4 из 10 мышей не имели заболевания. С другой стороны, в мышах, иммунизированных контролем, в 9 мышах не было мышей без заболевания.

Фиг.8 показывает коэффициент выживаемости без заболевания в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅.

Фиг.9 показывает цитотоксическую активность CTL в мышах, иммунизированных хелперным пептидом mWT1₃₅. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1₁₂₆ (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).

Фиг.10 показывает цитотоксическую активность mWT1-специфических CTL в контрольных мышах. ● показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием клеток RMAS, обработанных в импульсном режиме пептидом mWT1₁₂₆ (пептидом МНС I). ○ показывает результаты экспериментов, проводимых с использованием контрольных клеток RMAS. Число в скобках обозначает размер опухоли (мм).

Фиг.11 показывает цитотоксическую активность mWT1₁₂₆ специфических CTL (слева) и долю WT1₁₂₆ тетрамер-положительных Т-клеток (справа) при введении пептида WT1₃₅.

Фиг.12 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток посредством стимуляции пептидом WT1₃₅, в мононуклеарных клетках периферической крови каждого здорового субъекта, имеющего молекулы МНС класса I.

Фиг.13 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0901-, DPB1* 0201/0501- и DQB1* 0303/0401-положительного субъекта (здорового субъекта В)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.14 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного субъекта (здорового субъекта G)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.15 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/0405-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0401/0501-положительного здорового субъекта (здорового субъекта А)] Стимулятором [PBMC, полученными из DRB1* 0101/0803-, DPB1* 0501/- и DQB1* 0501/0601-положительного субъекта (здорового субъекта Н)]. Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.16 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0405/0803-, DPB1* 0202/0501- и DQB1* 0401/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта G)] Стимулятором [l-клетки, содержащие включенный ген DQB1* 0601]. Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT1_35.

Фиг.17 показывает результаты, полученные измерением пролиферации клеток при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 1502/1502-, DPB1* 0201/0901- и DQB1* 0601/0601-положительного здорового субъекта (здорового субъекта D)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает количество включенного ³Н-тимидина (имп/мин). Абсцисса показывает типы различных добавленных антител (без антитела, анти-HLA-DR-антитела, анти-HLA-DP-антитела и анти-HLA-DQ-антитела).

Фиг.18 показывает результаты, полученные измерением IFN-γ-продуцирующей способности при лечении Респондера [PBMC, полученных из DRB1* 0101/1501-, DPB1* 0201/0402- и DQB1* 0501/0602-положительного здорового субъекта (здорового субъекта I)] Стимулятором [PBMC, полученными из того же самого здорового субъекта, что и в случае респондера). Ордината показывает долю количества IFN-γ в Т-клетках. Абсцисса показывает присутствие или отсутствие IFN-γ (+ или -) импульса с пептидом WT1_35.

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте, данное изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислот, полученных из белка WT1 мыши или человека. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз; миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома; солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника. Таким образом, пептид данного изобретения присутствует в раковых клетках, экспрессирующих в большом количестве ген WT1.

Пептид данного изобретения является пептидом, который имеет аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученных из белка WT1 человека, изображенную в SEQ ID NO:2, сохраняет способность связываться с молекулами МНС класса II, как показано ниже, и имеет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки. Не существует конкретного ограничения в отношении этой аминокислотной последовательности и длины пептида данного изобретения, пока этот пептид имеет вышеуказанные признаки. Однако слишком длинный пептид чувствителен к действию протеаз, а слишком короткий пептид не может связываться с пептидом, приспособленным к углублению бороздки. Длина пептида данного изобретения равна предпочтительно 10-25 аминокислотам, более предпочтительно 15-21 аминокислотам, еще более предпочтительно 16-20 аминокислотам, например, 17 аминокислотам, 18 аминокислотам или 19 аминокислотам. Конкретными примерами пептида данного изобретения являются пептиды, имеющие аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3; аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:4, и аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:5.

Пептид данного изобретения включает в себя также варианты вышеупомянутых пептидов. Эти варианты могут содержать, например, пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в одной из указанных выше аминокислотных последовательностей. Замена аминокислот в пептидах может проводиться в любых положениях и любыми типами аминокислот. Предпочтительными являются консервативные аминокислотные замены. Например, остаток Glu может быть заменен остатком Asp, остаток Phe остатком Tyr, остаток Leu остатком Ile, остаток Ala остатком Ser, остаток His остатком Arg. Добавление или делеция аминокислот может проводиться предпочтительно на N-конце и С-конце в пептидах, но может проводиться во внутренней последовательности. Предпочтительный конкретный пример пептида данного изобретения имеет последовательность SEQ ID NO:3. В этой связи, все вышеуказанные пептиды должны сохранять способность связываться с молекулой МНС класса II и быть способными индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки.

В этой связи, молекула МНС класса II, с которой связывается пептид данного изобретения, может принадлежать к любому подклассу HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Предпочтительно, молекула МНС класса II является молекулой, выбранной из группы, состоящей из DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 0802, DRB1* 0803, DRB1* 0901, DRB1* 1201, DRB1* 1403, DRB1* 1501, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0402, DPB1* 0501, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0302, DQB1* 0401, DQB1* 0501, DQB1* 0601, DQB1* 0602 и DRB5* 0102. Более предпочтительно, молекулой МНС класса II является DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1403, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202, DPB1* 0901, DQB1* 0301, DQB1* 0601 или DRB5* 0102 и наиболее предпочтительно DRB1* 0101, DRB1* 0405, DRB1* 1502, DPB1* 0201, DPB1* 0202 или DQB1* 0601. В данном описании, пептид, который сохраняет способность индуцировать WT1-специфические хелперные Т-клетки, называют хелперным пептидом WT1. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:3, называют также пептидом WT1₃₅, хелперным пептидом WT1₃₅ или пептидом WT1₃₅.

Пептид данного изобретения может быть также пептидом, имеющим аминокислотную последовательность, состоящую из смежных аминокислот, полученную из белка WT1 мыши, изображенную в SEQ ID NO:1, и вышеуказанная аминокислотная последовательность может быть пептидом (SEQ ID NO:6), в котором аминокислотный остаток в положении 9 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:4, заменен лейцином; или пептидом (SEQ ID NO:7), в котором аминокислотный остаток в положении 11 в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:5, заменен серином. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать пептид, выбранный из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность, которая имеет замену, делецию или добавление нескольких аминокислот, например, 1-9, предпочтительно 1-5, 1-4, 1-3, более предпочтительно 1-2 аминокислот, еще более предпочтительно одной аминокислоты в аминокислотной последовательности, изображенной в SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7. В описанных ниже примерах, пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:6, называют также пептидом WT1₈₆ или хелперным пептидом WT1₈₆, и пептид, имеющий аминокислотную последовательность, изображенную в SEQ ID NO:7, пептидом WT1₂₉₄, хелперным пептидом WT1₂₉₄.

Пептид данного изобретения может быть произведен из белка WT1 и может состоять из вышеуказанной последовательности смежных аминокислот или содержать эту последовательность. Таким образом, пептид данного изобретения может быть, например, пептидом, состоящим из самой вышеуказанной аминокислотной последовательности, или белком WT1, содержащим вышеуказанную аминокислотную последовательность или ее часть. Пептид данного изобретения может быть также пептидом, полученным модификацией вышеуказанной аминокислотной последовательности. Аминокислотные остатки в вышеуказанной аминокислотной последовательности могут быть модифицированы известным способом. Такой модификацией может быть например, эстерификация, алкилирование, галогенирование, фосфорилирование, сульфирование, амидирование и т.п. на функциональной группе в боковой цепи аминокислотного остатка, входящего в состав пептида. Можно также связывать различные вещества с N-концом и/или С-концом пептида, содержащего вышеуказанную аминокислотную последовательность. Например, с этим пептидом могут быть связаны аминокислота, пептид, его аналог и т.п. В случае, если эти вещества связаны с пептидом данного изобретения, они могут быть обработаны, например, ферментом in vivo и т.п., или с использованием такого способа, как внутриклеточный процессинг, таким образом, что, в конечном счете, генерируют пептид, состоящий из вышеуказанной аминокислотной последовательности, которая представлена на поверхности клетки в виде комплекса с молекулой МНС класса II, являющийся посредством этого способным к генерированию эффекта индукции хелперных Т-клеток. Эти вещества могут быть веществами, регулирующими растворимость пептида этого изобретения, веществами, улучшающими стабильность этого пептида, например, устойчивость к протеазам, веществами, делающими возможной специфическую доставку пептида данного изобретения, например, к конкретной ткани или конкретному органу, или веществами, имеющими усиливающее действие на эффективность поглощения антигенпрезентирующих клеток или другое действие. Эти вещества могут быть также веществами, увеличивающими способность индукции CTL, например, хелперными пептидами, другими, чем пептид данного изобретения.

Модификация пептида данного изобретения может быть модификацией аминогруппы на N-концевой аминокислоте или карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте этого пептида. Модифицирующие группы аминокислотной группы на N-концевой аминокислоте включают в себя, например, одну-три алкильные группы, имеющие 1-6 атомов углерода, фенильные группы, циклоалкильные группы и ацильные группы. Конкретные примеры ацильной группы включают в себя алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, алканоильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкильной группой, имеющей 5-7 атомов углерода, алкилсульфонильную группу, имеющую 1-6 атомов углерода, фенилсульфонильную группу, алкоксикарбонильную группу, имеющую 2-6 атомов углерода, алкоксикарбонильную группу, замещенную фенильной группой, карбонильную группу, замещенную циклоалкоксигруппой, имеющей 5-7 атомов углерода, феноксикарбонильную группу и т.п. Пептиды, имеющие модификацию карбоксильной группы на С-концевой аминокислоте, включают в себя, например, эстерифицированные и амидированные пептиды. Конкретные примеры этого сложного эфира включают в себя сложный алкиловый эфир, имеющий 1-6 атомов углерода, сложный алкиловый эфир, имеющий 0-6 атомов углерода, замещенный фенильной группой, сложный циклоалкиловый эфир, имеющий 5-7 атомов углерода и т.п., и конкретные примеры амида включают в себя амид, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 1-6 атомов углерода, амид, замещенный одной или двумя алкильными группами, имеющими 0-6 атомов углерода, замещенными фенильной группой, амид, образующий 5-, 7-членный азоциклоалкан, включающий в себя атом азота амидной группы, и т.п.

Модификация пептида данного изобретения может проводиться также связыванием аминокислотных остатков друг с другом через связь, другую чем пептидная связь, такую как связь углерод-углерод и связь углерод-сера. Кроме того, пептид данного изобретения может содержать одну или несколько D-аминокислот.

Вышеупомянутые пептиды, вариантные пептиды и модифицированные пептиды согласно данному изобретению являются только иллюстративными, и специалисты с квалификацией в данной области могут легко допустить, получить, оценить и использовать другие вариации вышеуказанных пептидов.

Пептид данного изобретения может быть синтезирован с использованием способа, рутинно используемого в данной области или его модифицированного способа. Такой способ синтеза описан, например, в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol.2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1985; Development of Medicines (continuation), Vol.14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten Co., 1991 и т.п. Пептид данного изобретения может быть получен с использованием способа генетической инженерии на основе информации нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид данного изобретения. Такой способ генетической инженерии хорошо известен квалифицированным в данной области специалистам. Такой способ может проводиться в соответствии со способом, описанным в литературе [Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983); DNA Cloning, DM. Glover. IRL PRESS (1985)], как описано выше, или способом, описанным ниже, и другими способами.

Можно определить, связывается ли пептид данного изобретения или его кандидатный пептид с вышеуказанной молекулой МНС класса II и индуцирует ли хелперные Т-клетки, известным способом, например, таким как способ, описанный в Cancer Immunol. Immunother. 51:271 (2002), или способ, описанный в примерах данного описания, и другими способами.

Поскольку пептид данного изобретения активирует хелперные Т-клетки (CD4-положительные Т-клетки), этот пептид индуцирует и поддерживает дифференцировку CTL и проявляет действие активации эффекторных клеток, таких как макрофаги. Таким образом, можно использовать пептид данного изобретения для эффективного лечения или предупреждения рака.

В другом аспекте, данное изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему вышеуказанный хелперный пептид WT1 (далее называемый здесь полинуклеотидом WT1). Полинуклеотид данного изобретения может быть ДНК или РНК. Последовательность оснований полинуклеотида данного изобретения может быть определена на основе аминокислотной последовательности вышеуказанного хелперного пептида WT1. Этот полинуклеотид может быть получен, например, способом синтеза ДНК или РНК, ПЦР-способом и т.п.

Полинуклеотид данного изобретения включает в себя полинуклеотид, который гибридизуется с комплементарной последовательностью полинуклеотида, кодирующего пептид данного изобретения, при строгих условиях и кодирует пептид, имеющий активность, сравнимую с активностью пептида данного изобретения. Что касается термина “гибридизуются при строгих условиях”, используемая здесь гибридизация может проводиться в соответствии с общепринятым способом, описанным, например, в Molecular Cloning, 2^nd edition, Sambrook, J., Frisch, E.F., Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и т.п. Термин “строгие условия” включает в себя, например, условия, в которых гибрид образуется в растворе, содержащем 6×SSC (10×SSC является раствором, содержащим 1,5 М NaCl и 0,15 М тринатрийцитрат) и 50% формамид, при 45°С и затем промывают 2×SSC при 50°С (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1.-6.3.6) и т.п.

Еще в одном аспекте, данное изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему вышеуказанный полинуклеотид (далее называемому здесь также экспрессирующим вектором WT1). Тип экспрессирующих векторов, других последовательностей, содержащихся, наряду с вышеуказанной полинуклеотидной последовательностью, и т.п. может быть выбран должным образом в зависимости от типа хозяев, в которые вводят эти экспрессирующие векторы, от цели этого введения и т.п. Примеры этого экспрессирующего вектора включают в себя плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки Escherichia coli, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pUC118, pUC119, pBR322 и pCR3, а также фаговые векторы, такие как λZAPII и λgt11. В случае, когда хозяином являются дрожжевые клетки, примеры этого вектора включают в себя pYES2, pYEUra3 и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки насекомых, примером этого вектора является pAcSGHisNT-A и т.п. В случае, когда хозяином являются клетки животного, примеры этого вектора включают в себя плазмидные векторы, такие как pKCR, pCDM8, pGL2, pcDNA3.1, pRc/RSV и pRc/CMV, вирусные векторы, такие как ретровирусный вектор, аденовирусный вектор и аденоассоциированный вирусный вектор. Этот вектор может необязательно содержать такие факторы, как индуцируемый экспрессией промотор, ген, кодирующий сигнальную последовательность, маркерный ген для отбора и терминатор. Для легкого выделения и легкой очистки к этому вектору могут быть добавлены последовательность, экспрессируемая в виде слитого белка с тиоредоксином, His-метка, GST (глутатион-S-трансфераза) и т.п. В этом случае, можно использовать GST-слитый белковый вектор (pGEX4T и другие), имеющий подходящий промотор (lac, tac, trc, trp, CMV, ранний промотор SV40 и т.д.), функциональный в клетках-хозяевах, вектор (pcDNA3.1/Myc-His, и т.д.), имеющий последовательность-метку, такую как Myc и His, а также вектор (pET32a), экспрессирующий слитый белок с тиоредоксином и His-метку, и т.п.

При введении экспрессирующего вектора данного изобретения субъекту для получения хелперного пептида WT1 in vivo, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцированные этим пептидом, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса II и экспрессируют в высокой степени WT1, могут повреждаться специфически с использованием этого экспрессирующего вектора WT1 данного изобретения.

В другом аспекте, данное изобретение относится к антителу против вышеуказанного хелперного пептида WT1 или полинуклеотида, кодирующего этот пептид (далее называемому здесь антителом WT1). Антитело данного изобретения может быть либо поликлональным антителом, либо моноклональным антителом. Способ получения такого антитела уже известен, и антитело данного изобретения может быть получено также в соответствии с таким общепринятым способом (Current protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., (ed.), 1987, John Wiley and Sons (pub.), Section 11.12-11.13, Antibodies; A Laboratory Manual, Lane, H.D. et al., (ed.), Cold Spring Harber Laboratory Press (pub.), New York, 1989).

Данное изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или предупреждения рака, содержащей вышеуказанный хелперный пептид WT1, полинуклеотид WT1 или экспрессирующий вектор WT1. Ген WT1 экспрессируется в высокой степени, например, в опухолях гемопоэтических органов, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома, а также солидных раках, таких как рак желудка, рак кишечника, рак легкого, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичника, и, следовательно, эту фармацевтическую композицию данного изобретения можно использовать для лечения или предупреждения рака, экспрессирующего ген WT1. При введении фармацевтической композиции данного изобретения субъекту, имеющему молекулу МНС класса II, WT1-специфические хелперные Т-клетки, индуцируемые хелперным пептидом WT1, содержащимся в этой фармацевтической композиции, продуцируют различные цитокины (например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 или интерферон (IFN), и т.д.) и стимулируют пролиферацию, дифференцировку и созревание В-клеток и других субпопуляций Т-клеток. Таким образом, опухолевые клетки, которые имеют молекулу МНС класса I и экспрессируют в высокой степени WT1, могут специфически повреждаться с использованием пептида данного изобретения.

Фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать, например, носитель, эксципиент и т.п., наряду с вышеуказанным хелперным пептидом WT1, полинуклеотидом WT1 или экспрессирующим вектором WT1, в качестве эффективного компонента. Хелперный пептид WT1, содержащийся в фармацевтической композиции данного изобретения, индуцирует WT1-специфические хелперные Т-клетки, и, следовательно, фармацевтическая композиция данного изобретения может содержать подходящий адъювант или может вводиться с подходящим адъювантом для усиления эффективности индукции. Примеры предпочтительного адъюванта включают в себя, но не ограничиваются ими, полный или неполный адъювант Фрейнда, гидроксид алюминия и т.п. Фармацевтическая композиция данного изобретения может также содержать известный антигенный пептид рака, другой, чем вышеуказанный хелперный пептид WT1, например, пептид WT1₁₂₆, индуцирующий WT1-специфические CTL, в качестве эффективного компонента (Oka et al., “Cancer immunotherapy targeting Wilms' tumor gene WT1 product”, Journal of Immunology, 164:1873-1880, 2000; и Oka et al., “Human cytotoxic T-lymphocyte responses specific for peptides of the wild-type Wilms' tumor gene (WT1) product”, Immunogenetics, 51: 99-107, 2000).

Кроме того, фармацевтическая композиция данного изобретения может вводиться в комбинации с известным раковым антигенным пептидом. Например, известный раковый антигенный пептид, например, пептид WT1₁₂₆, может вводиться до или после введения фармацевтической композиции данного изобретения. Фармацевтическая композиция данного изобретения имеет признак, который активирует В-клетки или другие Т-клетки индуцированием WT1-специфических хелперных Т-клеток, и, следовательно, можно дополнительно усиливать активность CTL, индуцированных введением известного ракового антигенного пептида, и значительно увеличивать терапевтические действия.

Способ введения фармацевтической композиции данного изобретения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от таких условий, как тип заболеваний, состояние субъектов и сайты нацеливания. Примеры способа введения включают в себя, но не огра