Штамм bradyrhizobium для улучшения роста растений (варианты), композиция, содержащая указанный штамм, и семя, покрытое композицией

Штамм bradyrhizobium для улучшения роста растений (варианты), композиция, содержащая указанный штамм, и семя, покрытое композицией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА ДЕПОНИРОВАННЫЙ БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ

Эта заявка содержит ссылку на депонированный биологический материал, который приведен здесь в качестве ссылки. Полную информацию см. в таблице 1.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенной бактерии Bradyrhizobium, обладающей улучшенными характеристиками, включая, но без ограничения, улучшенную устойчивость к обезвоживанию.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для поддержания здорового роста растения должны экстрагировать множество элементов из почвы, на которой они растут. Эти элементы включают в себя азот и так называемые питательные микроэлементы (например, медь, железо и цинк), но многие виды почвы являются дефицитными по таким элементам или содержат их только в формах, которые не могут легко поглощаться растениями (как правило, считают, что необходимые элементы не могут легко поглощаться растениями, если они не присутствуют в почве в растворенной форме). Азот является необходимым элементом для большинства растений, поскольку он играет роль в синтезе аминокислот, белков, нуклеотидов, нуклеиновых кислот, хлорофилла, коферментов и в общем росте и здоровье растения. Чтобы противостоять этому дефициту, источники дефицитных элементов обычно вводят в почву для улучшения скорости роста и урожая, полученного от сельскохозяйственных растений. Например, нитрат и/или аммоний часто добавляют в почву, чтобы противостоять отсутствию доступного азота.

В области растениеводства хорошо известно, что для многих сельскохозяйственных культур необходимо, чтобы почва предоставляла растению относительно большие количества азота. Заметными исключениями из растений, требующих азота из почвы, являются растения из семейства бобовых.

Конкретно, бобовые растения являются уникальными по сравнению с не относящимися к бобовым растениями по их способности фиксировать атмосферный азот в аммиак. Способность растения фиксировать атмосферный азот в применимый источник азота устраняет необходимость растения получать азот из почвы. Для фиксации азота, однако, необходима симбиотическая взаимосвязь между бобовым растением и природной бактерией внутри почвы. Одними из наиболее интенсивно исследуемых партнеров в этой симбиотической взаимосвязи являются бактерии, принадлежащие к роду Bradyrhizobium или Rhizobium. Gresshoff, P. (1999). Identification of Plant Genes Involved in Plant-Microbe Interactions. Stacey, G. & Keen, T. (Ed.), Plant-Microbe Interactions (4th ed.) (Ch. 6). St. Paul: APS Press.

Симбиоз, как правило, достигается посредством сложного двустороннего обмена сигналами между растением и микроорганизмом и между микроорганизмом и растением. Как правило, растительные факторы, такие как флавоноиды и флавоноидоподобные вещества, индуцируют колонизацию бактерий в корневом клубеньке бобового растения. (Gresshoff, 1999). После колонизации бактерий в корневом клубеньке, бактерии вызывают морфологические изменения растения, а именно, закручивание корневого волоска и развитие нового корневого органа - клубенька. (Gresshoff, 1999). Клубенек позволяет образование нового физиологического окружения для клубенька, индуцирующего дифференцировку бактерий в фиксирующий азот эндосимбионт, или бактериод, для колонизированного растения. (Gresshoff, 1999).

Чтобы способствовать симбиотическому двустороннему обмену сигналами между растением и микроорганизмом, бактериями, такими как Bradyrhizobia sp., часто покрывают семена. Для продления жизнеспособности микроорганизма на семени является желательным, чтобы микроорганизм являлся устойчивым к обезвоживанию и в общем к сухим условиям внешней среды.

Остается необходимость в микроорганизмах с улучшенной устойчивостью к обезвоживанию.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе описаны новые бактериальные штаммы, обладающие улучшенной устойчивостью к обезвоживанию, особенно когда новые штаммы сравнивают с их родительским штаммом, например, родительским штаммом Bradyrhizobium sp., USDA 532C. Авторы изобретения выделили и тестировали значительное количество бактериальных штаммов по их свойствам устойчивости к обезвоживанию.

Как обсуждают на протяжении настоящего документа, выделенные штаммы представляют собой штаммы из рода Bradyrhizobium spp. В частности, выделенные штаммы представляют собой штаммы Bradyrhizobium japonicum. Еще более конкретно, выделенные штаммы представляют собой выделенные штаммы Bradyrhizobium japonicum, выбранные из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612, или комбинации по меньшей мере двух или более из вышеуказанных депонированных штаммов.

В настоящем документе описаны также композиции, содержащие носитель и один или несколько из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления композиция содержит одну или несколько сигнальных молекул растений. В одном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один липохитоолигосахарид (LCO). В другом варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере один хитоолигосахарид (CO). В другом варианте осуществления, композиция содержит по меньшей мере один флавоноид. В другом варианте осуществления композиция содержит жасминовую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит линолеиновую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит линоленовую кислоту или ее производное. В другом варианте осуществления композиция содержит каррикин.

Кроме того, в настоящем документе описан способ улучшения роста растения или части растения, включающий в себя контакт растения или части растения с одним или несколькими из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. Способ включает в себя введение в почву инокулята одного или нескольких из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В другом варианте осуществления способ включает в себя введение в почву инокулята одного или нескольких из бактериальных штаммов в форме покрытия семян.

В настоящем документе описан также способ улучшения фиксации азота в растении (растениях), включающий в себя выращивание растения(растений) в почве, содержащей один или несколько из бактериальных штаммов, описанных в настоящем документе. В одном варианте осуществления растение(растения) представляет собой бобовое растение(растения), не относящееся к бобовым растение(растения) или их комбинацию. В другом варианте осуществления растение представляет собой растение, выбранное из группы, состоящей из сои, фасоли, люцерны, клевера, кукурузы, латука, томатов, картофеля, огурцов и их комбинаций.

Кроме того, в настоящем документе описаны семена, покрытые бактериальными штаммами, описанными в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Фиг. 1 представляет собой графическое представление предварительного скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг. 2 представляет собой графическое представление второго скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг. 3 представляет собой графическое представление третьего скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг. 4 представляет собой графическое представление четвертого скрининга сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C.

Фиг. 5 представляет собой столбчатую диаграмму, представляющую устойчивость к обезвоживанию отобранных сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C на нулевые (0) и четырнадцатые (14) сутки.

Фиг. 6 представляет собой столбчатую диаграмму, представляющую устойчивость к обезвоживанию отобранных сравниваемых устойчивых к обезвоживанию мутантов при сравнении с устойчивостью к обезвоживанию родительского штамма USDA 532C на седьмые (7) и четырнадцатые (14) сутки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанные бактериальные штаммы выделены и тестированы по их способности солюбилизировать фосфор. Это подробно описано в разделе «Примеры», представленном ниже. Кроме того, описанные варианты осуществления относятся к композициям, покрытиям семян, способам увеличения доступности фосфора для поглощения растением из почвы, и к способам увеличения поглощения фосфора растениями, включающим в себя выращивание растений в почве, содержащей источник фосфора.

Определения:

Как применяют в настоящем документе, формы единственного числа «a», «an» и «the» предназначены, чтобы включать в себя также формы множественного числа, если контекст явно не требует иного.

Как применяют в настоящем документе, термин «биологически чистая культура» предназначен для обозначения культуры, в основном свободной от биологического загрязнения и обладающей генетической однородностью, так что для взятых из нее различных субкультур показывают по существу идентичные генотипы и фенотипы (например, культуры, обладающие чистотой по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, вплоть до 100% чистоты).

Как применяют в настоящем документе, термин «изолят, изоляты, выделение и/или выделенный и т.д.» предназначены для обозначения того, что материал, на который ссылаются, является удаленным из среды, в которой его обнаруживают в норме.

Как применяют в настоящем документе, термин «инокулят» предназначен для обозначения любой формы бактериальных клеток или спор, которая является способной к размножению на или в почве, когда условия температуры, влажности и т.д., являются благоприятными для роста бактерий.

Как применяют в настоящем документе, термин «спора» имеет свое обычное значение, которое является хорошо известным и понятным специалистам в данной области и в общем относится к микроорганизму в его дремлющем, защищенном состоянии.

Как применяют в настоящем документе, термин «источник» конкретного элемента предназначен для обозначения соединения этого элемента, которое, по меньшей мере в рассматриваемых условиях почвы, не делает этот элемент полностью доступным для поглощения растением.

Как применяют в настоящем документе, термины «эффективное количество», «эффективная концентрация», или «эффективная доза» предназначены для обозначения количества, концентрации или дозы одного или нескольких бактериальных изолятов, достаточные, чтобы вызывать увеличение роста растения или части растения или увеличение фиксации азота. Абсолютное значение действительной эффективной дозы зависит от факторов, включая, но без ограничения, размер (например, площадь, общую площадь в акрах и т.д.) поля для введения бактериальных изолятов, синергические или антагонистические взаимодействия с другими активными или инертными ингредиентами, которые могут увеличивать или уменьшать активность бактериальных изолятов, и стабильность бактериальных изолятов в композициях и/или в формах для обработки семян. «Эффективное количество», «эффективную концентрацию» или «эффективную дозу» бактериальной композиции можно определять, например, посредством общепринятого эксперимента зависимости от дозы.

Как применяют в настоящем документе, термины «носитель» или «агрономически приемлемый носитель» предназначены для обозначения любого материала, который можно использовать для доставки активных средств (например, бактериального штамма) к семени, почве, растению или части растения.

Как применяют в настоящем документе, термин «совместимый с почвой носитель» предназначен для обозначения любого материала, который можно добавлять в почву без вызова/наличия неблагоприятного эффекта на рост растений, структуру почвы, дренирование почвы или т.п.

Как применяют в настоящем документе, термин «совместимый с семенами носитель» предназначен для обозначения любого материала, который можно добавлять к семени без вызова/наличия неблагоприятного эффекта на семя, вырастающее из семени растение, прорастание семени или т.п.

Как применяют в настоящем документе, термин «обеспечивающий преимущество для сельского хозяйства ингредиент(ы)» предназначен для обозначения любого средства или комбинации средств, способных вызывать или обеспечивать преимущественный и/или полезный эффект в сельском хозяйстве.

Как применяют в настоящем документе, «по меньшей мере один биологически активный ингредиент» предназначен для обозначения биологически активных ингредиентов, например, сигнальных молекул, других микроорганизмов и т.д.), отличных от одного или нескольких бактериальных изолятов, описанных в настоящем документе.

Как применяют в настоящем документе, термин «обезвоживание» предназначен для обозначения состояния необычайной сухости, например, условий без влаги и/или воды. Термины «устойчивость к обезвоживанию» и/или «переносимость обезвоживания» предназначены, чтобы включать в себя способность организма противостоять условиям и/или выживать в условиях и/или выдерживать условия необычайной сухости.

Как применяют в настоящем документе, термины «фиксация азота», «фиксация атмосферного азота», или «связывание азота» и т.д. предназначены, чтобы включать в себя биологические процессы, в которых молекулярный азот или азот в атмосфере переводится в одно или несколько азотных (N) соединений, включая, но без ограничения, аммиак, соли аммония, мочевину и нитраты.

Как применяют в настоящем документе, термин «фиксирующий азот организм» предназначен для обозначения любого организма (например, диазотрофов), способных переводить молекулярный азот или азот в атмосфере в одно или несколько азотных (N) соединений, включая, но без ограничения, аммиак, соли аммония, мочевину и нитраты.

Как применяют в настоящем документе, термины «солюбилизация фосфата», или «повышение растворимости фосфата» и т.д. предназначены для обозначения перевода нерастворимого фосфата (например, минерального фосфата и т.д.) в растворимую форму фосфата.

Как применяют в настоящем документе, термин «солюбилизирующий фосфат организм» предназначен для обозначения любого организма, способного переводить нерастворимый фосфат в растворимую форму фосфата.

Как применяют в настоящем документе, термины «растение(растения)» и «часть(части) растения» предназначены для обозначения всех растений и популяций растений, таких как желательные и нежелательные дикие растения или сельскохозяйственные растения (включая встречающиеся в природе сельскохозяйственные растения). Сельскохозяйственные растения могут представлять собой растения, которые можно получать общепринятыми способами разведения и оптимизации растений или способами биотехнологии и генной инженерии, или посредством комбинации этих способов, включая трансгенные растения и включая культивары растений, охраняемые или не охраняемые правами растениеводов-селекционеров. Части растения следует понимать как обозначающие все части и органы растений над и под землей, такие как побег, лист, цветок и корень, в качестве примеров которых можно упомянуть листья, иглы, черенки, стволы, цветы, плодовые тела, плоды, семена, корни, клубеньки, клубни, и корневища. Части растения включают в себя также собранный материал и материал для вегетативного и генеративного размножения (например, черенки, клубни, корневища, отростки и семена и т.д.).

Как применяют в настоящем документе, термин «клубенек» предназначен для обозначения, но без ограничения, детерминированных клубеньков, недетерминированных клубеньков или их комбинации. Примеры детерминированных клубеньков и недетерминированных клубеньков хорошо известны в данной области и описаны в Denison, R. F., 2000, The Amer. Naturalist. 156 (6): 567-576. Детерминированные клубеньки обнаружены у видов Glycine, Lotus или Phaseolus и являются округлыми и сферическими по форме. (Denison, 2000) Детерминированные клубеньки растут только в течение ограниченного периода времени - как правило, несколько недель. (Denison, 2000) В отличие от детерминированных клубеньков, недетерминированные клубеньки обнаружены у видов Medicago, Trifolium и Pisium, имеют вытянутую форму и растут непрерывно. (Denison, 2000) Термин «заселение клубенька» является термином, известным в данной области. McDermott T.R. & Graham, P.H., Appl. and Environ. Microbiol. 55(10): 2493-2498. В данной области хорошо известно, что, несмотря на редкие исключения, отдельный клубенек содержит только один бактериальный штамм. Johnston, A.W.B., et al., 1974, J. Gen. Microbiol 87: 343-350; Dunham, D. H. & Baldwin, I.L., 1931, Soil Science 32: 235-249; Johnson, H.W., et al., 1963, Agrono. J. 55: 269-271; Dudman, W.F. & Brockwell, J., 1968, J. Agricul. Res. 19: 739-747; Nicol, H. & Thorton, H.G., 1941, Proc. Roy. Soc. В 130, 32-59; Hughes, D.Q. & Vincent, J.M., 1942, Proc. of the Linnenan Soc. of New South Wales 67: 142-152; и Vincent, J.M. & Waters, L.M., 1953, J. Gen. Microbiol. 9: 357-370.

Как применяют в настоящем документе, термин «усиленный рост растения» предназначен для обозначения увеличенного урожая растения (например, увеличенной биомассы, увеличенного количества плодов, или их комбинации, как измерено в бушелях на акр), увеличенного количества корней, увеличенной массы корней, увеличенного объема корней, увеличенной площади листьев, увеличенной густоты стояния растений, увеличенной мощности растения, увеличенной массы растения (например, общей массы в сухом состоянии растения или части растения, общей массы свежего растения или части растения и т.д.), или их комбинаций.

Как применяют в настоящем документе, «усиленная конкурентоспособность» и/или «усиленное образование клубеньков» представляет собой определение для обозначения бактериального штамма(штаммов), обладающего процентом заселения клубеньков, например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, вплоть до 100% заселения клубеньков.

Как применяют в настоящем документе, термин «температурная устойчивость» предназначен для обозначения диапазона температур, при котором бактериальный штамм(ы) являются способными расти, например, максимальной и минимальной температур, при которых бактериальный штамм может расти.

Как применяют в настоящем документе, термин «коммерчески доступный штамм(ы)» предназначен для обозначения коммерчески доступных бактериальных штаммов, например, USDA 532C, USDA 110, USDA 123, USDA 127, USDA 129 и т.д. Cregan, P.В., et al., 1989, Appl. и Enviro. Microbiol. 55 (10): 2532-2536.

Как применяют в настоящем документе, термин «питательный микроэлемент(ы)» предназначен для обозначения питательных веществ, необходимых для роста растения, здоровья растения и/или развития растения.

Как применяют в настоящем документе, термин «биостимулятор(ы)» предназначен для обозначения любого вещества, способного усиливать метаболические или физиологические процессы внутри растений и почвы.

Как применяют в настоящем документе, термин «увлажняющее средство(средства)» предназначен для обозначения любого вещества, способного снижать и/или уменьшать поверхностное натяжение воды.

ШТАММЫ

В одном варианте осуществления выделенный штамм(ы), описанные в настоящем документе, представляет собой фиксирующий азот бактериальный штамм(ы). В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobum sp. В следующем аспекте штамм получен из штамма Bradyrhizobium, включая, но без ограничения, штамм, выбранный из группы, состоящей из Bradyrhizobium bete, Bradyrhizobium canariense, Bradyrhizobium elkanii, Bradyrhizobium iriomotense, Bradyrhizobium japonicum, Bradyrhizobium jicamae, Bradyrhizobium liaoningense, Bradyrhizobium pachyrhizi и Bradyrhizobium yuanmingense. В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobum japonicum.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающие улучшенным/увеличенным процентом выживаемости бактерий в по существу безводной внешней среде, когда процент выживаемости выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с процентом выживаемости родительского штамма(штаммов), например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C, в течение периода времени, например, по меньшей мере 1 сутки, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 3 суток, по меньшей мере 4 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 6 суток, по меньшей мере 1 неделя, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 4 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 2 месяца, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяца, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 год или более.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенным/увеличенным процентом выживаемости в по существу безводной внешней среде, где увеличенный процент выживаемости в по существу безводной внешней среде включает в себя увеличенный процент выживаемости бактерий во внешней среде, которая является по меньшей мере на 70% безводной, например, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, вплоть до 100% безводной внешней средой, когда процент выживаемости выделенного штамма(штаммов) Bradyrhizobium сравнивают с процентом выживаемости родительского штамма(штаммов), например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532С.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий следующими улучшенными/превосходными характеристиками при сравнении с коммерчески доступными штаммами, например, коммерческим штаммом Bradyrhizobium japonicum USDA 532C, где улучшенные/превосходные характеристики включают в себя, но без ограничения:

a. улучшенную конкурентоспособность для колонизации растения сои и

b. улучшенную эффективность в стимуляции роста растения сои.

В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной конкурентоспособностью для колонизации растения. В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной эффективностью для стимуляции роста растения. В другом варианте осуществления выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий улучшенной/превосходной конкурентоспособностью для колонизации растения и улучшенной/превосходной эффективностью для стимуляции роста растения.

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающие улучшенной/превосходной температурной устойчивостью.

В другом аспекте настоящего изобретения выделенный штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium sp., обладающий природной устойчивостью к глифосату.

В другом варианте осуществления штаммы представляют собой штаммы Bradyrhizobum japonicum, выбранные из группы, состоящей из:

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50608;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50609;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50610;

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50611; и

штамма с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В конкретном варианте осуществления штамм(ы) могут представлять собой один или несколько из вышеупомянутых депонированных штаммов (например, включая по меньшей мере два из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере три из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере четыре из вышеупомянутых штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеупомянутых штаммов).

В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50608. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50609. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50610. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50611. В одном из вариантов осуществления штамм представляет собой штамм с депозитарным номером доступа NRRL B-50612.

В другом варианте осуществления бактериальная культура(культуры) обладает свойствами/характеристиками, идентичными по меньшей мере одному из депонированных штаммов или комбинации по меньшей мере двух из вышеупомянутых депонированных штаммов, включая более двух, например, по меньшей мере три из вышеупомянутых штаммов, по меньшей мере четыре из вышеупомянутых штаммов, вплоть до всех и включая все из вышеупомянутых штаммов. Свойства/характеристики бактериальной культуры включают в себя, но без ограничения, бактериальные штаммы, обладающие улучшенной и/или превосходной устойчивостью к обезвоживанию. В другом варианте осуществления штамм(ы) представляет собой штамм(ы) Bradyrhizobium, обладающие улучшенной и/или превосходной устойчивостью к обезвоживанию, когда устойчивость к обезвоживанию сравнивают с устойчивостью к обезвоживанию и/или с переносимостью обезвоживания родительского штамма(штаммов) бактерий, например, родительского штамма Bradyrhizobium japonicum USDA 532C.

В другом аспекте выделенный бактериальный штамм(ы) по настоящему изобретению включает в себя штамм(ы), близко родственные любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S. См. Stackebrandt E, et al., «Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology», Int J Syst Evol Microbiol. 52(3):1043-7 (2002) относительно использования идентичности последовательности рДНК 16S для определения родства у бактерий. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один штамм является по меньшей мере на 95% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 96% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 97% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 98% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 98,5% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S, по меньшей мере на 99% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S или по меньшей мере на 99,5% идентичным любому из вышеуказанных штаммов на основании идентичности последовательности рДНК 16S.

Бактерию Bradyrhizobium, описанную здесь, и в частности, штаммы с депозитарными номерами доступа NRRL B-50608, NRRL B-50609, NRRL B-50610, NRRL B-50611 и NRRL B-50612, можно выращивать способами, известными в данной области.

Полученный материал можно использовать непосредственно в композиции, в качестве обработки семян, или споры можно собирать, концентрировать центрифугированием, составлять и затем высушивать с использованием способов сушки воздухом, лиофилизации или сушки в псевдоожиженном слое (Friesen Т., Hill G., Pugsley Т., Holloway G., and Zimmerman D. 2005, Experimental determination of viability loss of Penicillium bilaiae conidia during convective air-drying Appl Microbiol Biotechnol 68: 397-404) для получения смачиваемого порошка.

Вышеупомянутые депонированные штаммы депонированы 1 октября 2012 г., как более подробно указано ниже в разделе «Материалы и методы», согласно условиям Будапештского Соглашения о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA.

КОМПОЗИЦИИ:

В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей носитель и инокулят одного или нескольких из депонированных штаммов (либо в форме спор, либо штаммов в вегетативном состоянии), описанных в настоящем документе. В конкретных вариантах осуществления композиция может находиться в форме жидкости, суспензии, твердого вещества или порошка (смачиваемого порошка или сухого порошка). В другом варианте осуществления композиция может находиться в форме покрытия семян. Композиции в форме жидкости, суспензии или порошка (например, смачиваемого порошка) могут являться пригодными для покрытия семян. При использовании для покрытия семян, композицию можно наносить на семена и позволять высохнуть. В вариантах осуществления, когда композиция представляет собой порошок (например, смачиваемый порошок), жидкость, такая как вода, может являться необходимой для добавления к порошку перед нанесением на семена. Примеры других носителей включают в себя увлажненные отруби, высушенные, просеянные и нанесенные на семена до покрытия адгезивным средством, например, гуммиарабиком.

Носители:

Носители, описанные в настоящем документе, позволяют депонированному бактериальному штамму(штаммам) оставаться эффективными (например, способными фиксировать азот) и жизнеспособными после составления. Носители, описанные в настоящем документе, включают в себя, в качестве неограничивающих примеров, жидкости, суспензии или твердые вещества (включая смачиваемые порошки или сухие порошки). В одном из вариантов осуществления носитель представляет собой совместимый с почвой носитель, как описано в настоящем документе.

В одном варианте осуществления носитель представляет собой жидкий носитель. Жидкости, пригодные в качестве носителей для композиций, описанных в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров воду, водный раствор или неводный раствор. В одном варианте осуществления носитель представляет собой воду. В другом варианте осуществления носитель представляет собой водный раствор, такой как водный раствор сахара. В другом варианте осуществления носитель представляет собой неводный раствор. Если используют жидкий носитель, жидкий (например, водный) носитель может дополнительно включать в себя среду для роста для культивирования депонированных бактериальных штаммов. Неограничивающие примеры пригодной среды для роста для депонированных бактериальных штаммов включают в себя среду с арабинозой-глюконатом (AG), среду с дрожжевым экстрактом и маннитом (YEM), среду G16 или любую среду, известную специалистам в данной области как совместимую с питательными веществами и/или предоставляющую питательные вещества для депонированных бактериальных штаммов.

В другом варианте осуществления носитель представляет собой суспензию. В одном из вариантов осуществления суспензия может содержать клейкое вещество, жидкость или их комбинацию. Предусматривают, что клейкое вещество может представлять собой любое средство, способное приклеивать инокулят (например, один или несколько из депонированных штаммов) к интересующему субстрату (например, семени). Клейкие вещества включают в себя в качестве неограничивающих примеров альгинат, минеральное масло, сироп, гуммиарабик, мед, метилцеллюлозу, молоко, обойный клей и их комбинации. Жидкости, пригодные для суспензии, включают в себя в качестве неограничивающих примеров воду или водный раствор сахара.

В другом варианте осуществления носитель представляет собой твердое вещество. В конкретном варианте осуществления твердое вещество представляет собой порошок. В одном варианте осуществления порошок представляет собой смачиваемый порошок. В другом варианте осуществления порошок представляет собой сухой порошок. В другом варианте осуществления твердое вещество представляет собой гранулы. Твердые вещества, пригодные в качестве носителей для композиций, обсуждаемых в настоящем документе, включают в себя в качестве неограничивающих примеров торф, пшеницу, пшеничную сечку, молотую пшеничную солому, отруби (например, увлажненные отруби, не увлажненные отруби), вермикулит, целлюлозу, крахмал, почву (пастеризованную или не пастеризованную), гипс, тальк, глины (например, каолин, бентонит, монтмориллонит) и силикагели.

Необязательные преимущественные с точки зрения сельского хозяйства ингредиенты:

Композиции, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько необязательных ингредиентов. Необязательные ингредиенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров один или несколько биологически активных ингредиентов, микроэлементов, биостимуляторов, консервантов, полимеров, увлажняющих средств, поверхностно-активных веществ или их комбинаций.

Биологически активный ингредиент(ы):

Композиции, описанные в настоящем документе, могут, необязательно, включать в себя один или несколько биологически активных ингредиентов, как описано в настоящем документе. Биологически активные ингредиенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров сигнальные молекулы (например, липохитоолигосахариды (LCO), хитоолигосахариды (CO), хитиновые соединения, флавоноиды, жасминовую кислоту или ее производные, линолеиновую кислоту или ее производные, линоленовую кислоту или ее производные, каррикины и т.д.) и обеспечивающие преимущество микроорганизмы (например, Rhizobium spp., Bradyrhizobium spp., Sinorhizobium spp., Azorhizobium spp. и т.д.).

Сигнальная молекула(молекулы):

В одном из вариантов осуществления композиции, описанные в настоящем документе, включают одну или несколько сигнальных молекул. В одном варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляет собой один или несколько LCO. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляет собой одно или несколько хитиновых соединений. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько CO. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько флавоноидов или их производных. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько не относящихся к флавоноидам индукторов гена nod (например, жасминовую кислоту, линолеиновую кислоту, линоленовую кислоту и их производные). В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько каррикинов или их производных. В другом варианте осуществления одна или несколько сигнальных молекул представляют собой один или несколько LCO, одно или несколько хитиновых соединений, один или несколько CO, один или несколько флавоноидов и их производных, один или несколько не относящихся к флавоноидом индукторов гена nod и их производных, один или несколько каррикинов и их производных, или любую комбинацию сигнальных молекул из них.

LCO:

Соединения липохитоолигосахаридов (LCO) также известные в данной области как симбиотические сигналы Nod или факторы Nod, состоят из олигосахаридного остова из -1,4-связанных остатков N-ацетил-D-глюкозамина («GlcNAc») с N-связанной цепью жирного ацила, конденсированной с невосстанавливающим концом. LCO отличаются по количеству остатков GlcNAc в остове, по длине и степени насыщенности цепи жирного ацила, и по замещениям восстанавливающих и невосстанавливающих остатков сахара. Пример LCO представлен ниже в виде формулы I:

,

в которой:

G представляет собой гексозамин, который может являться замещенным, например, ацетильной группой на атоме азота, сульфатной группой, ацетильной группой и/или эфирной группой на атоме кислорода,

R₁, R₂, R₃, R₅, R₆ и R₇, которые могут являться идентичными или различными, представляют собой H, CH₃CO-, C_xH_yCO-, где x представляет собой целое число между 0 и 17, и y представляет собой целое число между 1 и 35, или любую другую ацильную группу, например, такую как карбамил,

R₄ представляет собой моно-, ди- или триненасыщенную алифатическую цепь, содержащую по меньшей мере 12 атомов углеро