Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный хорионический гонадотропный гормон человека

Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный хорионический гонадотропный гормон человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к гонадотропинам для применения при лечении бесплодия. В частности, оно относится к хорионическому гонадотропному гормону человека (hCG).

Гонадотропины представляют собой группу гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, которые регулируют функцию гонад у мужчин и женщин. Они включают фолликулостимулирующий гормон (FSH), лютеинизирующий гормон (LH) и хорионический гонадотропный гормон (CG).

Хорионический гонадотропный гормон человека (hCG) естественным образом секретируется передней долей гипофиза и функционирует для поддержки развития фолликулов и овуляции. hCG содержит альфа субъединицу из 92 аминокислот, которая также является общей для других гликопротеиновых гормонов LH и FSH, и бета субъединицу из 145 аминокислот, уникальную для hCG, которая обуславливает специфичность гормона. Каждая субъединица посттрансляционно модифицируется путем добавления сложных углеводных остатков. Альфа субъединица содержит сайты 2-N-связанного гликозилирования на аминокислотах 52 и 78, и бета субъединица содержит сайты 2-N-связанного гликозилирования на аминокислотах 13 и 30 и четыре сайта О-связанного гликозилирования на аминокислотах 121, 127, 132 и 138.

hCG, экстрагированный из мочи беременных женщин [Choragon (Ferring)], в течение многих лет используют при лечении бесплодия. Получение hCG, экстрагированного из мочи, включает сбор и переработку больших количеств мочи. Доступна рекомбинантная версия hCG, Ovitrelle (Serono). Она экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Известный рекомбинантый продукт hCG имеет фармакокинетический профиль, отличный от hCG, получаемого из человеческой мочи. Желательно иметь hCG продукт, который ближе воспроизводит или имитирует фармакокинетический профиль продукта, полученного из человеческой мочи.

Существует значительная гетерогенность, связанная с препаратами hCG, которая относится к различиям в количествах разных представленных изоформ. Индивидуальные изоформы hCG демонстрируют идентичные аминокислотные последовательности, но отличаются по степени, в которой они подвергаются посттрансляционной модификации; конкретные изоформы характеризуются гетерогенностью структур разветвленных углеводов и разными количествами включенной сиаловой кислоты (концевой сахар), которые оба, по-видимому, влияют на биоактивность конкретной изоформы.

Гликозилирование природного hCG является весьма сложным. Гликаны в полученном естественным путем hCG гипофиза могут содержать широкий спектр структур, которые могут включать комбинации двух-, трех - и четырехантенных гликанов. Гликаны могут нести дополнительные модификации: фукозилирование ядра, делящий надвое глюкозамин, цепи, удлиненные ацетиллактозамином, частичное или полное сиалирование, сиалирование α2,3 и α2,6 связями и сульфатированный галактозамин, замещенный галактозой. Кроме того, имеются различия между распределениями структур гликанов в индивидуальных сайтах гликозилирования.

Гликозилирование рекомбинантых продуктов hCG ("rhCG") отражает наличие ряда гликозилтрансфераз, присутствующих в линии клетки-хозяина. Существующий продукт rhCG, Ovitrelle, происходит из сконструированных клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО). Диапазон модификаций гликана в rhCG, происходящем из СНО, более ограничен, чем диапазон модификаций, обнаруженных в природных продуктах, полученных из мочи. Примеры пониженной гетерогенности гликана, обнаруженного в rhCG, происходящем из СНО, включают отсутствие делящего надвое глюкозамина и пониженное содержание фукозилирования ядра и ацетиллактозаминовых удлинений. Кроме того, клетки СНО способны добавлять сиаловую кислоту лишь с использованием α2,3 связи (Kagawa et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Это отличает его от образующегося в природе hCG, который содержит гликаны со смесью α2,3- и α2,6-связанной сиаловой кислоты.

Было продемонстрировано, что рекомбинантный препарат FSH (Organon) отличается количеством FSH с изоэлектрической точкой (pi) ниже 4 (считаются кислыми изоформами) при сравнении с гипофизарным FSH в сыворотке или моче после менопаузы (Ulloa-Aguirre et al., 1995). Количество кислых изоформ в препаратах FSH мочи было значительно большим по сравнению с рекомбинантными продуктами, Gonal-f (Serono) и Puregon (Organon) (Andersen et al., 2004). Должно быть, это отражает более низкое молярное содержание сиаловой кислоты в rFSH, так как содержание отрицательно заряженного гликана, модифицированного сульфатом, в FSH является низким. Более низкое содержание сиаловой кислоты, по сравнению с природным FSH, является характеристикой обоих имеющихся в продаже продуктов FSH и, следовательно, вероятно отражает ограничение способа производства (Bassett and Driebergen, 2005). Время полувыведения FSH в крови было документально подтверждено для веществ из целого ряда источников. Некоторые из этих веществ фракционировали на основе общего заряда молекулы, характеризуемого их pi, у которых более кислый (pi) соответствует большему отрицательному заряду. Основной вклад в общий заряд молекулы вносит общее содержание сиаловой кислоты каждой молекулы FSH. Например, rFSH (Organon) имеет содержание сиаловой кислоты около 8 моль/моль, тогда как FSH, полученный из мочи, имеет более высокое содержание сиаловой кислоты (de Leeuw et al., 1996). Соответствующие показатели клиренса плазмы у крыс составляют 0,34 и 0,14 мл/мин (Ulloa-Aguirre et al., 2003). В другом примере, когда образец рекомбинантного FSH делили на фракции с высокой и низкой pi, эффективность фракции с высокой pi (более низкое содержание сиаловой кислоты) in vivo была пониженной, и она имела более короткий период полувыведения в плазме (D'Antonio et al., 1999). Заявители обнаружили, что, аналогично FSH, известный, полученный из СНО, рекомбинантный hCG продукт (например, Ovitrelle) также имеет меньшее количество hCG с изоэлектрической точкой (pi) меньше 4 (считаются кислыми изоформами), чем hCG мочи, также отражая меньшее содержание сиаловой кислоты известного продукта rhCG по сравнению с hCG мочи.

Общее содержание сиаловой кислоты в hCG и rhCG нельзя сравнивать непосредственно, так как сиаловые кислоты обычно связаны двумя способами. hCG из гипофиза/сыворотки/мочи содержит как α2,3, так и α2,6-связанную сиаловую кислоту, с преобладанием первой. Однако рекомбинанты, происходящие из клеток СНО, содержат только α2,3 (Kagava et al., 1988, Takeuchi et al., 1988, Svensson et al., 1990). Другими словами, рекомбинантные белки, экспрессируемые с использованием системы СНО, будут отличаться от их природных аналогов по их типу связей концевых сиаловых кислот. Это является другим отличием между природными и современными рекомбинантными продуктами, помимо меньшего общего содержания сиаловой кислоты последних, и является важным фактором при производстве биологических агентов для фармацевтического применения, так как углеводные группировки могут содействовать фармакологическим свойствам молекулы.

Следовательно, желательно иметь продукт rhCG, который ближе воспроизводит или имитирует физико-химический и фармакокинетический профиль продукта, полученного из человеческой мочи. Желательно иметь продукт rhCG, который имеет улучшенные фармакокинетическое свойство или свойства по сравнению с известным рекомбинантным продуктом.

Согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный hCG ("rhCG" или "rechCG"), включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование и, возможно, α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или более, например от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например от 19 моль/моль до 20 моль/моль. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,3-сиалирование может составлять 10% или более общего сиалирования. Например, от 45% до 80% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 50% до 70% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 55% до 65% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. Например, 65-85% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее общего сиалирования. Например, 20-55% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 30-50% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 35-45% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. Например, 15-35% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее общего сиалирования, например, от 0 до 4%, например, 0,1-4% общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования.

Авторы изобретения разработали рекомбинантный hCG человеческого происхождения, который имеет более кислый профиль, чем Ovitrelle, продукт, происходящий из СНО, и который имеет более высокое содержание сиаловой кислоты. Исследование авторов изобретения указывает на то, что тип связи сиаловой кислоты, α2,3- или α2,6-, может иметь существенное влияние на биологический клиренс hCG. Линии человеческих клеток, в отличие от линий клеток СНО, могут экспрессировать рекомбинантный hCG с сиаловыми кислотами, присоединенными как α2,3-, так и α2,6-связями.

Рекомбинантный hCG со смесью и α2,3-, и α2,6-связанной сиаловой кислоты получали конструированием линии человеческих клеток для экспрессии как rhCG, так и α2,3-сиалилтрансферазы (Примеры 4, 5а и 5б). Экспрессируемый продукт является сильно кислым и несет смесь и α2,3-, и α2,6-связанных сиаловых кислот; причем последние обеспечены эндогенной сиалилтрансферазной активностью. Это имеет два преимущества над rhCG, экспрессируемым в традиционных клетках СНО: во-первых, вещество является более сиалированным из-за объединенных активностей двух сиалилтрансфераз; и, во-вторых, вещество имеет более близкое сходство с природным hCG. Это, вероятно, является биологически более подходящим по сравнению с рекомбинантными продуктами, происходящими из клеток СНО, которые продуцировали только α2,3-связанную сиаловую кислоту и имеют пониженное содержание сиаловой кислоты.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что rhCG по изобретению может ближе воспроизводить или имитировать физико-химический и фармакокинетический профиль природного человеческого продукта из мочи, чем другие рекомбинантные продукты. Другими словами, rhCG по изобретению может быть ближе к «натуральному» hCG. Это может иметь значительные преимущества в отношении дозировки и т.д. Кроме того, более «натуральный» или более «человеческий» продукт может быть более желательным для пациента, который может нуждаться в терапии, и, несмотря на искусственность, является настолько «натуральным», насколько это возможно. У рекомбинантного продукта hCG, имеющего углевод (например, гликан), структура которого ближе к природному hCG (например, человеческому из мочи), могут быть другие преимущества (например, фармакокинетические преимущества) по сравнению с другими рекомбинантными продуктами.

Изобретение, таким образом, представляет собой рекомбинантную версию hCG, который несет смесь α2,3 и α2,6 сиаловой кислоты и, следовательно, имеет более близкое сходство с природным hCG. Ожидается, что применение данного соединения для контролируемой стимуляции яичника в методиках IVF (экстракорпоральное оплодотворение) и индукции овуляции будет приводить к более естественной стимуляции яичника по сравнению с существующими рекомбинантными продуктами.

Согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный hCG ("rhCG" или "rechCG") (и/или препарат рекомбинантного hCG), включающий α2,3 сиалирование и α2,6 сиалирование. rhCG или препарат rhCG возможно может дополнительно включать α2,8 сиалирование.

Здесь термин «препарат рекомбинантного hCG» включает, например, препарат для фармацевтического применения, который включает рекомбинантный hCG. В воплощениях изобретения rhCG может присутствовать в виде одной изоформы или в виде смеси изоформ.

rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или более (Пример 8), например от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например от 19 моль/моль до 20 моль/моль. rhCG по изобретению может продуцироваться или экспрессироваться в линии клеток человека.

В rhCG (или препарате rhCG) согласно изобретению α2,3-сиалирование может составлять 10% или более от общего сиалирования. Например, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 или 90% или более от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,3-сиалирование в количестве, которое составляет от 45% до 80% от общего сиалирования, например от 50% до 70% от общего сиалирования, например от 55 до 65% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,3-сиалирование в количестве, которое составляет от 65% до 85% от общего сиалирования, например от 70% до 80% от общего сиалирования, например от 71% до 79% от общего сиалирования. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее от общего сиалирования. Например, 45, 40, 30, 20, 10, 5% или менее от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,6-сиалирование в количестве, которое составляет 20-55% от общего сиалирования, например 30-50% от общего сиалирования, например 35-45% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,6-сиалирование в количестве, которое составляет от 15 до 35% от общего сиалирования, например, от 20 до 30% от общего сиалирования, например от 21 до 29% от общего сиалирования. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее от общего сиалирования. Например, 2,5% или менее от общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,8-сиалирование в количестве, которое составляет от 0 до 4% от общего сиалирования, например, от 0,1 до 4% от общего сиалирования, например от 0,5 до 3% от общего сиалирования, например от 0,5 до 2,5% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования. Под сиалированием подразумевают количество сиаловых остатков, присутствующих на углеводных структурах hCG. α2,3-сиалирование означает сиалирование в 2,3 положении (как хорошо известно в данной области), и α2,6-сиалирование - в 2,6 положении (также хорошо известное в данной области). Таким образом, фраза «% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование» относится к % от общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в hCG, которые сиалированы в 2,3 положении. Термин «% от общего сиалирования, составляющий α2,6-сиалирование» относится к % от общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в hCG, которые сиалированы в 2,6 положении.

rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты (количество сиалирования на молекулу hCG) (на основе массы белка, а не массы белка плюс углевода) 6% или более (например, от 6% до 15%, например от 7% до 13%, например от 8% до 12%, например от 11% до 15%, например от 12% до 14%) по массе.

Рекомбинантный hCG, экспрессируемый в клетках яичников китайского хомячка (СНО), включает исключительно α2,3-сиалирование.

rhCG по изобретению можно продуцировать или экспрессировать в линии клеток человека. Это может упрощать (и делать более эффективным) способ получения, так как манипулирование и контроль, например, за ростовой средой клеток для сохранения сиалирования могут быть менее критичными, чем в случае с известными способами. Данный способ также может быть более эффективным, так как образуется меньше основного rhCG, чем при получении известных rhCG продуктов; образуется больше кислотного rhCG, и разделение/удаление основного hCG является менее трудоемким. rhCG можно продуцировать или экспрессировать в линии клеток Per.С6, линии клеток, происходящей от Per.С6, или в модифицированной линии клеток Per.C6. Линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью [линии клеток]. Альтернативно или дополнительно, линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы.

rhCG можно продуцировать с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью. rhCG можно продуцировать с использованием α2,3- и/или α2,6-сиалилтрансферазы.

Согласно настоящему изобретению, в другом аспекте предложен способ получения rhCG и/или препарата rhCG, как здесь описано (согласно аспектам изобретения), включающий стадию продуцирования или экспрессии rhCG в линии клеток человека, например в линии клеток Per.C6, линии клеток, происходящей от Per.C6, или в модифицированной линии клеток Per.C6, например линии клеток, которая была модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы.

Структура rhCG содержит гликановые группировки. Разветвление может приводить к тому, что гликан может иметь 1, 2, 3, 4 или более концевых остатков сахаров или «антенн», как хорошо известно в данной области. rhCG по изобретению может иметь гликаны с присутствием сиалирования на одноантенных, и/или двухантенных, и/или трехантенных, и/или четырехантенных структурах. rhCG может включать моносиалированные, дисиалированные, трисиалированные и тетрасиалированные гликановые структуры, например, со следующими относительными количествами: 0,1-4% - моносиалированные; 35-45% - дисиалированные; 0,5-8% - трисиалированные и 0-1% тетрасиалированные (например, как показано анализом WAX заряженных гликанов, как изложено в Примере 8Г)- Предпочтительно рекомбинантный hCG по изобретению включает моно(1S), ди(2S), три(3S) и тетра(4S) сиалированные структуры. Предпочтительно относительные количества сиалированных структур находятся в следующих соотношениях (1S:2S:3S:4S):0,2-1%:35-40%:2,5-7%:0,5-1% (например, как показано анализом WAX заряженных гликанов, как изложено в Примере 8Г).

Согласно настоящему изобретению, в другом аспекте предложен rhCG, полученный (например, экспрессированный) в линии клеток человека. rhCG может включать α2,3- и α2,6-сиалирование. rhCG может продуцироваться или экспрессироваться в линии клеток Per.C6, линии клеток, происходящей от Per.C6, или в модифицированной линии клеток Per.C6. Линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью [линии клеток]. Альтернативно или дополнительно, линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы. rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или больше, например от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например от 19 моль/моль до 20 моль/моль. В rhCG (или препарате rhCG) α2,3-сиалирование может составлять 10% или более от общего сиалирования, например, от 45% до 80% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 50% до 70% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 55 до 65% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. Например, 65-85% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее от общего сиалирования. Например, 20-55% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 30-50% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 35-45% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. Например, 15-35% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее от общего сиалирования, например, от 0 до 4%, например, от 0,5 до 4% от общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования.

Согласно настоящему изобретению в дополнительном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая rhCG, включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование (например, как изложено выше). Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать FSH и/или LH.

FSH может быть получен любыми способами, известными в данной области. FSH в том виде, в котором он здесь используется, включает FSH человеческого происхождения или рекомбинантный FSH. FSH человеческого происхождения может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи) любым способом, известным в данной области. FSH может быть рекомбинантным FSH, например экспрессируемым в линии клеток человека. Способы проведения экспрессии и очистки рекомбинатного FSH хорошо известны в данной области.

LH может быть получен любыми способами, известными в данной области. LH в том виде, в котором он здесь используется, включает LH человеческого происхождения и рекомбинантный LH. LH человеческого происхождения может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи) любым способом, известным в данной области. Способы проведения экспрессии и очистки рекомбинатного LH хорошо известны в данной области.

Фармацевтическая композиция может служить для лечения бесплодия, например, для применения, например, во вспомогательных репродуктивных технологиях (ART), индукции овуляции или внутриматочной инсеминации (IUI). Фармацевтическую композицию можно использовать, например, при медицинских показаниях, когда используют известные препараты hCG. Согласно настоящему изобретению также предложено применение rhCG и/или описанного здесь препарата rhCG (согласно аспектам изобретения) для изготовления или в изготовлении лекарственного средства для лечения бесплодия. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно готовить в виде препарата хорошо известных композиций для любого пути введения лекарственного средства, например перорального, ректального, парентерального, чрескожного (например, технология пластыря), внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрицистернального (intrasusternal), внутривагинального, внутрибрюшинного, местного (порошки, мази или капли) или в виде буккального или назального спрея. Типичная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как водный раствор, нетоксичные эксципиенты, включая соли и консерванты, буферы и тому подобное, как описано, среди прочих, в Remington's Pharmaceutical Sciences, пятнадцатое издание (Matt Publishing Company, 1975) на страницах 1405-1423 и 1461-87 и в Национальном формуляре XIV, четырнадцатое издание (Американская фармацевтическая ассоциация, 1975).

Примеры подходящих водных и неводных фармацевтических носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное), карбоксиметилцеллюлозу и их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат.

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать добавки, такие как, но не ограничивающиеся, консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Для предупреждения роста микробов можно включать антибактериальные и противогрибковые агенты, и они включают, например, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобное. Кроме того, может быть желательным включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобное.

В некоторых случаях желательно осуществлять пролонгированное действие для замедления поглощения hCG (и других активных ингредиентов, в случае их присутствия) из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с плохой растворимостью в воде. Скорость поглощения hCG тогда зависит от его скорости растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В качестве альтернативы, отложенное поглощение комбинированной формы hCG, введенной парентерально, осуществляется растворением или суспендированием комбинации hCG в масляном носителе.

Формы в виде инъецируемого депо могут быть получены путем образования микроинкапсулирующих матриц hCG (и других агентов, если они присутствуют) в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. Скорость высвобождения hCG можно контролировать, в зависимости от отношения hCG к полимеру и природы конкретного используемого полимера. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поливинилпирролидон, поли(ортоэфиры), поли(ангидриды) и т.д. Инъецируемые композиции в виде депо также получают путем заключения hCG в липосомы или микроэмульсии, которые являются совместимыми с тканями организма.

Инъецируемые композиции можно стерилизовать, например, путем фильтрования через фильтр, задерживающий бактерии, или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед применением. Инъецируемые композиции можно поставлять в любом подходящем контейнере, например сосуде, предварительно заполненном шприце, картриджах для инъекции и тому подобном.

Инъецируемые композиции можно поставлять в виде продукта, имеющего фармацевтические композиции, содержащие hCG (возможно с FSH, LH и т.д.). Если имеется более чем один активный ингредиент (т.е. hCG или, например, FSH или LH), они могут быть подходящими для введения раздельно или совместно. При введении раздельно введение может быть последовательным. Продукт можно поставлять в любой подходящей упаковке. Например, продукт может содержать много предварительно заполненных шприцев, содержащих любой из hCG, FSH или комбинацию и FSH, и hCG, шприцы, упакованные в блистерную упаковку, или другие средства для поддержания стерильности. Продукт возможно может содержать инструкции для применения композиций hCG и FSH.

рН и точную концентрацию разных компонентов фармацевтической композиции регулируют согласно традиционной практике в данной области. Смотри GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7^th ed. В предпочтительном воплощении композиции по изобретению поставляют в виде композиций для парентерального введения. Общие способы получения парентеральных композиций известны в данной области и описаны в REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, приведенной выше, на страницах 780-820. Парентеральные композиции можно поставлять в жидких композициях или в виде твердого вещества, которое будет смешиваться со стерильной инъецируемой средой непосредственно перед введением. В особенно предпочтительном воплощении парентеральные композиции поставляются в стандартной лекарственной форме для легкости введения и однородности дозировки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение теперь будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры и приложенные графические материалы.

Краткое описании графических материалов

На Фиг.1 показана карта плазмиды экспрессионного вектора pnCGальфа/бета;

На Фиг.2 показан экспрессионный вектор для α2,3-сиалилтрансферазы (ST3GAL4);

На Фиг.3 показан экспрессионный вектор для α2,6-сиалилтрансферазы (ST6GAL1);

На Фиг.4 показана детекция изоформ rhCG в линии клеток человека, полученных из препаратов рекомбинантного hCG согласно изобретению (дорожка 3, 4), посредством IEF (изоэлектрофокусировка), окрашенных кумасси синим, по сравнению с препаратами предшествующего уровня техники (дорожка 1, 2);

На Фиг.5 показаны скорости метаболического клиренса (MCR) образцов hCG в Per.C6, сконструированных с α2,3-сиалилтрансферазой; и

На Фиг.6 показаны долговременные MCR образцов rhCG в Per.C6, сконструированных с α2,3-сиалилтрансферазой.

Выбор последовательности

Человеческий hCG

Использовали кодирующую область гена альфа полипептида hCG согласно Fiddes and Goodman (1979). Последовательность внесена в банк данных как АН007338, и во время конструирования отсутствовали другие варианты данной последовательности белка. Данная последовательность называется здесь SEQ ID NO: 1.

Использовали кодирующую область гена бета полипептида hCG согласно Fiddes and Goodman (1980). Последовательность внесена в банк данных как NP_000728 и согласуется с последовательностями белка CGbeta3, CGbeta5 и CGbeta7. Данная последовательность именуется здесь SEQ ID NO: 2.

Сиалилтрансфераза

α2,3-Сиалилтрансфераза - кодирующую область гена бета-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (α2,3-сиалилтрансфераза, ST3GAL4) использовали согласно Kitagawa and Paulson (1994). Последовательность внесена в банк данных как L23767 и называется здесь как SEQ ID NO: 3.

α2,6-Сиалилтрансфераза - кодирующую область гена бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (α2,6-сиалилтрансфераза, ST6GAL1) использовали согласно Grundmann era/. (1990). Последовательность внесена в банк данных как NM_003032 и называется здесь как SEQ ID NO: 4.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование вектора, экспрессирующего hCG

Кодирующую последовательность альфа полипептида hCG (АН007338, SEQ ID NO: 1) и бета полипептида hCG (NP_000728, SEQ ID NO: 2) амплифицировали ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием комбинаций праймеров CGa-fw и CGa-rev и CGb-fw и CGb-rev, соответственно.

CGa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'

CGa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'

CGb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC-3'

CGb-rev 5'- CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3'

Образующуюся амплифицированную ДНК hCG бета расщепляли рестрикционными ферментами Ascl и Hpal и вставляли в сайты Ascl и Hpal на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV (цитомегаловирус), несущем неомициновый селективный маркер. Аналогично ДНК hCG альфа расщепляли BamHI и Nhel и вставляли в сайты BamHI и Nhel на экспрессионном векторе, уже содержащем ДНК полипептида hCG бета.

ДНК вектора использовали для трансформации штамма DH5α E.coli. Колонии отбирали для амплификации, и из числа колоний, которые включали вектор, содержащий и hCG альфа, и бета, отбирали двадцать для секвенирования. Все колонии, отобранные для секвенирования, содержали правильные последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Плазмиду phCG А+В отбирали для трансфекции (Фиг.1).

Пример 2. Конструирование экспрессионного вектора ST3

Кодирующую последовательность бета-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,3STfw и 2,3STrev.

2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTMGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

Образующуюся амплифицированную ДНК ST3 расщепляли рестрикционными ферментами BamHl и AflII и вставляли в сайты BamHI и AflII на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано ранее, и секвенировали. Клон pST3#1 (Фиг.2) содержал правильную последовательность согласно SEQ ID NO: 3, и был выбран для трансфекции.

Пример 3. Конструирование экспрессионного вектора ST6 Кодирующую последовательность бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,6STfw и 2,6STrev.

2,6STfw5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'

2,6STrevS'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

Образующуюся амплифицированную ДНК ST6 расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и AflII и вставляли в сайты BamHI и AflII на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано ранее, и секвенировали. Клон pST6#11 (Фиг.3) содержал правильную последовательность согласно SEQ ID NO: 4 и был выбран для трансфекции.

Пример 4. Стабильная экспрессия phCG А+В в клетках PER.C6. Трансфекция, выделение и скрининг клонов

Клоны Per.C6, продуцирующие hCG, генерировали экспрессией обеих полипептидных цепей hCG из одной плазмиды (смотри Пример 1).

Для получения стабильных клонов использовали трансфекционный агент на основе липосом с конструкцией phCG А+В. Стабильные клоны отбирали в селективной среде Per.C6, дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка) и содержащей G418. Через три недели после трансфекции вырастали клоны, устойчивые к G418. Всего для выделения отбирали 389 клонов. Выделенные клоны культивировали в селективной среде до 70-80%-ной конфлюентности. Супернатанты анализировали на содержание белка hCG с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), селективного в отношении hCG, и фармакологической активности на рецепторе hCG в клонированной линии клеток, используя анализ накопления сАМР (циклический аденозинмонофосфат). С клонами (118), экспрессирующими функциональный белок, работали далее для увеличения объема культуры до 24 лунок, 6 лунок и колб Т80.

Исследования для определения продуктивности и качества материала из 47 клонов инициировали в колбах Т80 с генерацией достаточного количества материала. Клетки культивировали в дополненной среде, как описано ранее, в течение 7 суток и отбирали супернатант. Продуктивность определяли с использованием ELISA, селективного в отношении hCG. Определяли изоэлектрический профиль материала (с использованием способа, описанного в Примере 6). Информацию из IEF использовали для отбора клонов для анализа скорости метаболического клиренса. Клоны с достаточной продуктивностью и качеством отбирали для конструирования сиалилтрансферазы.

Пример 5а. Уровень сиалирования увеличивается в клетках, которые сверхэкспрессируют α2,3-сиалилтрансферазу. Стабильная экспрессия pST3 в клетках PER.C6, экспрессирующих hCG; Трансфекция, выделение и скрининг клонов

Клоны Per.C6, продуцирующие сильно сиалированный hCG, генерировали путем экспрессии α2,3-сиалилтрансферазы из отдельных плазмид (смотри Пример 2) в клетках Per.C6, уже экспрессирующих обе полипептидные цепи hCG (смотри Пример 4). Клоны, продуцированные из клеток PER.C6®, как изложено в Примере 4, отбирали на их характеристики, включающие продуктивность, хороший профиль роста, продукцию функционального белка и продуцированный hCG, который включал некоторый уровень сиалирования.

Стабильные клоны генерировали, как описано ранее в Примере 4. Клоны, кодирующие α2,3-сиалилтрансферазу, выделяли, наращивали и анализировали. Конечное число клонов для исследования α2,3- составляло пять. Клоны с α2,3-сиалилтрансферазой адаптировали к бессывороточной среде и условиям суспензии.

Как и ранее, клоны анализировали с использованием ELISA, селективного в отношении hCG, функционального ответа в линии клеток с рецептором hCG, IEF (Пример 6). Их также анализировали на метаболическую скорость клиренса (Пример 9) и в биопробе на hCG USP (Фармакопея Соединенных Штатов Америки) (Пример 10). Результаты сравнивали с имеющимся в продаже рекомбинантным hCG (Ovitrelle, Serono) и с родительскими линиями клеток hCG Рег.Сб. Репрезентативные образцы показаны в Примерах и на Фигурах.

В заключение необходимо отметить, что экспрессия hCG совместно с α2,3-сиалилтрансферазой в клетках Per.C6 приводит к повышенным уровням сиалированного hCG по сравнению с клетками, экспрессирующими только hCG.

Пример 5б. Стабильная экспрессия pST3 в клетках PER.C6, экспрессирующих hCG - другой способ

Полученный выше альфа бета гетеродимер (Пример 4) имел низкий уровень сиалирования, приводящий к очень основному профилю IEF. Как показано выше (Пример 5а), экспрессия hCG совместно с α2,3-сиалилтрансферазой в клетках Рег.Сб приводит к повышенным уровням сиалированного hCG по сравнению с клетками, экспрессирующими только hCG.

Проводили двойную трансфекцию генов альфа и бета субъединицы hCG совместно с геном фермента α2,3-сиалилтрансферазы в клетки Per.C6 в формате суспензионной культуры клеток. Линии клеток генерировали сотрансфекцией вектора hCG (двойной альфа/бета, Пример 1) и вектора, кодирующего α2,3-сиалилтрансферазу (Пример 2) при бессывороточных условиях. Клоны, полученные из клеток PER.C6®, отбирали на их характеристики, включающие продуктивность, хороший профиль роста, продукцию функционального белка и продуцированный hCG, который включал некоторый уровень сиалирования. Клоны выделяли, наращивали и анализировали.

Как и ранее, клоны анализировали с использованием EL