Пептид или пептидный комплекс, связывающийся с альфа2-интегрином, способы его получения и применения указанного вещества

Пептид или пептидный комплекс, связывающийся с альфа2-интегрином, способы его получения и применения указанного вещества

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к пептиду или пептидному комплексу, связывающемуся с α2-интегрином, который предназначен для лечения, профилактики или диагностики, к одной или нескольким нуклеиновым кислотам, кодирующим указанный пептид или пептидный комплекс, к рекомбинантной клетке, продуцирующей указанный пептид или пептидный комплекс, к способу получения указанного пептида или пептидного комплекса, к фармацевтической композиции, включающей указанный пептид, пептидный комплекс или нуклеиновые кислоты, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства, к способу обнаружения α2-интегрина и способу скрининга.

Уровень техники

Интегрины являются трансмембранными белками, опосредующими взаимодействие между адгезивными молекулами на смежных клетках и/или во внеклеточном матриксе (ЕСМ). Интегрины выполняют разные функции в нескольких биологических процессах, включающих миграцию клеток в процессе роста и заживления ран, дифференцировки и апоптоза клеток. Интегрины также могут регулировать метастатический и инвазивный потенциал опухолевых клеток. Интегрины существуют в виде гетеродимеров, состоящих из α и β субъединиц. Некоторые α и β субъединицы обладают специфичностью в отношении друг друга и могут быть определены в качестве члена VLA (очень позднего антигена). Гетеродимеры часто предпочтительно связываются с определенными адгезивными молекулами клеток или компонентами ЕСМ. Несмотря на отсутствие каталитической активности, интегрины могут быть частью мультимолекулярных сигнальных комплексов, известных как фокальные адгезии.

При связывании с лигандами интегрины передают внутриклеточные сигналы цитоскелету, которые изменяют активность клетки в ответ на адгезивные события клетки, при этом данный процесс определяется как передача сигнала внутрь клетки. Такая передача сигнала может также активировать интегрины других подтипов, экспрессированные на той же клетке, при этом данный процесс определяется как передача сигнала из клетки. Передача сигнала из клетки далее происходит при помощи регуляторных сигналов, возникающих в цитоплазме клетки вследствие разрыва сцепления между α и β субъединицами, которые затем передаются в наружный лигандсвязывающий домен рецептора. Интегрины могут играть важную роль в адгезивных событиях клетки, регулирующих рост, морфогенез, физиологию и патологию органа, а также гомеостаз нормальной ткани, иммунные и тромботические реакции, и, кроме того, интегрины являются сенсорами окружающей среды для клетки.

Одним из гетеродимеров интегринов является α2β1-интегрин. α2β1-Интегрин экспрессирован на клетках нескольких разных типов, включающих эндотелиальные и эпителиальные клетки, фибробласты, лимфоциты и тромбоциты. Специфичность α2β1-интегрина к лиганду изменяется в зависимости от типа клетки. Указанный интегрин является рецептором коллагена на тромбоцитах и фибробластах и в то же время может быть рецептором коллагена и ламинина на эндотелиальных и эпителиальных клетках.

α2β1-Интегрин представляет собой молекулу, состоящую из субъединицы α2-интегрина из семейства α-интегринов и субъединицы β1-интегрина из семейства β-интегринов. Последовательности α2 и β1 интегрина известны в данной области и рассмотрены, например, в публикациях Takada and Hemler, J. Cell Biol. 109(1):397-407, 1989, и Argraves, W.S., J. Cell Biol. Sep 105(3):1183-90 (1987). Примеры последовательностей приведены на фигуре 9, другие последовательности представлены в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), например, под номерами доступа NCBI NP_002194, NM_002203, NM_002211, NP_002202 (изоформа 1А β1-интегрина) для α2- и β1-интегрина homo sapiens, см. также ниже.

В данной области известны альтернативные сплайсированные варианты, изоформы, а также последовательности, отличные от человеческих (например, принадлежащие грызунам, таким как мышь, крыса и т.д., обезьянам или другим животным), которые представляют собой возможные альтернативные варианты, если они выполняют по меньшей мере одну из известных функций α2- или β1-интегрина.

Субъединица α2-интегрина является членом субпопуляции субъединиц α-интегрина, содержащих домен, состоящий примерно из 200 аминокислот, который расположен около аминоконца и часто определяется как I-домен (или введенный домен). Многие I-домены, включая I-домен субъединицы α2-интегрина, содержат дополнительный катионсвязывающий сайт, фрагмент адгезивного сайта, зависящего от иона металла (MIDAS). Структура I-домена α2-интегрина описана, например, в публикации Dickenson et al., J. Biol. Chemistry, 272, 7661-7668 (1997). I-Домены являются важными детерминантами связывания с лигандами. Аминокислотная последовательность I-домена α2-интегрина показана на фигуре 9, где она отмечена в последовательности α2-интегрина (SEQ ID NO:20).

α2β1-Интегрин (очень поздний антиген 2; VLA-2) экспрессирован на клетках разных типов, включая тромбоциты, эндотелиальные клетки сосудов, эпителиальные клетки, активированные моноциты/макрофаги, фибробласты, лейкоциты, лимфоциты, активированные нейтрофилы и мастоциты. Природными лигандами для α2β1-интегрина являются коллаген и ламинин, обнаруженные во внеклеточном матриксе. α2β1-Интегрин участвует в нескольких биологических и патологических процессах, включающих вызываемую коллагеном агрегацию тромбоцитов, миграцию клеток в коллагене, клеточнозависимую реорганизацию коллагеновых волокон, а также коллагензависимые реакции клетки, вызывающие увеличение экспрессии и пролиферации цитокинов, изменение функции Т-клеток, мастоцитов и нейтрофилов, аллергическую реакцию замедленного типа, контактную аллергию, коллагеновый артрит, морфогенез протоков молочной железы, заживление ран эпидермиса и процессы, ассоциированные с VEGF-индуцированным развитием кровеносных сосудов.

Тромбоциты обычно циркулируют в крови в состоянии покоя, однако, они быстро реагируют на целый ряд агонистов в местах возникновения повреждения. Стимулированные тромбоциты резко изменяются и активно взаимодействуют с белками плазмы, такими как фибриноген и фактор Виллебранда (vWf), другими тромбоцитами и эндотелиальной выстилкой стенок сосудов. Все указанные взаимодействия облегчают быстрое образование гемостатической массы из тромбоцитов фибрина (Cramer, 2002, in Hemostasis and Thrombosis, 4^th edition). При связывании с лигандов рецепторы тромбоцитов передают сигнал внутрь клетки, которая в свою очередь передает сигнал наружу, в результате чего активируются вторичные рецепторы, такие как рецептор фибриногена тромбоцитов, αIIbβ3-интегрин, вызывающие агрегацию тромбоцитов. Даже незначительная активация тромбоцитов может вызвать тромботические реакции, тромбоцитопению и геморрагические осложнения.

α2-Интегрин является единственным коллагенсвязывающим интегрином, экспрессированным на тромбоцитах, и предположительно играет некоторую роль в адгезии тромбоцитов с коллагеном и гемостазе (Santoro et al., Thromb. Haemost. 74:813-821 (1995); Vanhoorelbeke et al., Curr. Drug Targets Cardiovasc. Haematol. Disord. 3(2):125-40 (2003); Sarratt et al., Blood 106(4):1268-1277 (2005)). Поэтому желательно инактивировать функцию алфа2-интегрина с целью негативного воздействия на агрегацию тромбоцитов. Одним типом такого ингибирования может быть, например, аллостерическое ингибирование, которое блокирует интегрин в неактивном состоянии.

Взаимодействие интегрина с лигандом может облегчать транссудацию лейкоцитов в воспаленные ткани (Jackson et al., J. Med. Chem. 40:3359-3368 (1997); Gadek et al., Science 295(5557):1086-9 (2002), Sircar et al., Bioorg. Med. Chem. 10:2051-2066 (2002)) и играть определенную роль в событиях, следующих за начальной транссудацией лейкоцитов из кровотока в ткани в ответ на воспалительные раздражители, включая миграцию, рекрутинг и активацию провоспалительных клеток в месте воспаления (Eble J. A., Curr. Pharm. Des. 11(7):867-880 (2005)).

Как отмечалось в научной литературе, блокирование α2-интегрина влияет на аллергические реакции замедленного типа и эффективность лечения ревматоидного артрита в мышиной модели и модели воспалительного заболевания кишечника (Kriegelstein et al., J. Clin. Invest. 110(12):1773-82 (2002); de Fougerolles et al., J. Clin. Invest. 105:721-720 (2000)) и ослабляет пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток in vitro (Senger et al., Am. J. Pathol. 160(1):195-204 (2002), из чего следует, что блокирование α2-интегрина может предотвращать/ингибировать анормальное или более интенсивное развитие кровеносных сосудов, имеющее место в разных типах рака. Кроме того, было установлено, что ингибирование α2-интегрина в модели хирургического удаления колоректального рака у крыс оказывает эффективное антиметастатическое действие (van der Bji et al., Hepatology 47(2):532-543 (2008)). Подобным образом также можно воспрепятствовать коммитированию клеток колоректального рака с образованием злокачественного фенотипа (Kirkland et al., J. Biol. Chem. 283(41):27612-27619 (2008)). Так как установлено, что α2-интегрин опосредует злокачественный фенотип рака поджелудочной железы (Grzesiak and Bouvet, Br. J. Cancer 94:1311-1319 (2006)), то в настоящее время ведутся исследования по терапевтическому воздействию на указанную мишень при лечении агрессивного рака такого типа. Кроме того, α2β1-интегрин взаимодействует с гликосфинголипидами при прогрессировании рака предстательной железы, из чего следует, что блокирование такого взаимодействия позволит терапевтически воздействовать на рак данного типа (van Slambrouck et al., Int. J. Onco. 345:693-699 (2009)). α2-Интегрин, по-видимому, играет важную роль в экспериментальном аутоиммунном энцефалите (ЕАЕ), мышиной модели рассеянного склероза (MS), так как лечение антителом против α2-интегрина, проведенное сразу же после возникновения данного заболевания, подавляло клинические признаки и воспаление центральной нервной системы (Tsunoda et al., Brain Pathol. 17:45-55 (2007)). Механизм терапевтически благоприятного воздействия антитела против α2-интегрина, вероятнее всего, связан с ингибированием взаимодействия α2β1-интегрина с белком комплемента C1q. Указанное взаимодействие является первой стадией дегрануляции и активации мастоцитов, опосредующих аутоиммунные и воспалительные заболевания, такие как рассеянный склероз, системная красная волчанка, гломерулонефрит (McCall-Culbreath et al., Blood 111 (3562-3570) 2008).

Таким образом, α2-интегрин является интересной мишенью для медицинского воздействия. Так как интегрины являются трудными мишенями для создания специфических ингибиторов и, принимая во внимание различные возможные терапевтические показания, существует потребность в альтернативных ингибиторах, связывающихся с α2-интегрином, в частности, ингибиторах альфа2-интегрина, обладающих свойствами, отличающимися от свойств существующих ингибиторов α2-интегрина, которые могут быть использованы при лечении нарушений, ассоциированных с α2-интегрином.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам против α2-интегрина, антигенсвязывающим фрагментам и другим связывающим молекулам, предназначенным для лечения, профилактики или диагностики, к одной или нескольким нуклеиновым кислотам, кодирующим связывающую молекулу, к рекомбинантной клетке, продуцирующей связывающую молекулу, к способу получения связывающей молекулы, к фармацевтической композиции, включающей связывающую молекулу или нуклеиновые кислоты, которая предназначена для применения в качестве лекарственного средства, к способу обнаружения α2-интегрина и способу скрининга.

В данной связи было создано и испытано моноклональное антитело против α2-интегрина. Указанное антитело обладает благоприятными характеристиками, рассмотренными в примерах. В частности, антитело против α2-интегрина и его моновалентные фрагменты или производные были исследованы в отношении констант связывания, перекрестной реактивности, было произведено картирование доменов и получены данные функционирования in vitro.

Установлено, что моноклональное антитело (mAb) связывается с I-доменом α2-интегрина со сродством в нМ диапазоне, при этом связывание происходит в эпитопе I-домена, отличающемся от эпитопа, с которым связывается антитело-компаратор, известное в данной области, которое также направленно воздействует на I-домен альфа2-интегрина. Все созданные молекулы антитела по настоящему изобретению (mAb IgG4, Fab) характеризуются сравнимыми скоростями ассоциации и диссоциации при выполнении экспериментов методом Biacore. Указанные антитела обладают перекрестной реактивностью с α2β1-интегрином приматов, при этом не было обнаружено перекрестной реактивности с α2β1-интегрином мышей, крыс, собак, морских свинок или кроликов при исследовании с использованием тромбоцитов, полученных у соответствующих видов животных.

Исследованные молекулы ингибируют взаимодействие рекомбинантного α2-интегрина с коллагеном in vitro при низких значениях нМ IC₅₀. Помимо ингибирования коллагена, моноклональное антитело против α2β1-интегрина или его Fab-фрагменты способны ингибировать адгезию тромбоцитов с коллагеном при использовании выделенных тромбоцитов человека и плазмы человека с высоким содержанием тромбоцитов в статических условиях. Указанные антитела также способны ингибировать образование тромбов на поверхности, покрытой коллагеном, в текучем состоянии. Способность блокировать связывание с коллагеном и, таким образом, предотвращать адгезию тромбоцитов с коллагеном является одной из ранних стадий устранения образования тромба.

И наконец, моноклональные антитела или Fab-фрагменты не вызывают активации тромбоцитов, поскольку не было обнаружено увеличения активации GPIIbIIIa или поверхностной экспрессии Р-селектина у ~30 доноров указанного моноклонального антитела. Таким образом, настоящее изобретение относится к моновалентным антителам, фрагментам или производным указанных антител и их применению для приготовления исследовательских, диагностических и терапевтических агентов, предназначенных для лечения указанных ниже нарушений, связанных с α2-интегрином; конкретные примеры нарушений включают тромбоз, другие сосудистые заболевания, рак и патологические последствия развития кровеносных сосудов, аутовоспалительные заболевания, такие как рассеянный склероз.

Как должно быть известно квалифицированному специалисту, характеристики связывания антител определяются вариабельными доменами. В антителах, связывающихся с антигеном, обычно присутствует вариабельный домен из тяжелой цепи и совместно действующий вариабельный домен из легкой цепи, которые расположены с возможностью достижения совместного действия. Вариабельный домен также определяется как FV-область. В частности, за связывание с антигеном отвечают вариабельные петли, по три в легкой (VL) и тяжелой (VH) цепи. Указанные петли именуются областями, определяющими комплементарность (CDR), LCDR1, LCDR2 и LCDR3 для VL и HCDR1, HCDR2 и HCDR3 для VH. В данной области известен целый ряд разных расположений вариабельного домена в тяжелой цепи и совместно действующего вариабельного домена в легкой цепи. Поэтому важно идентифицировать один или несколько приемлемых вариабельных доменов в тяжелой цепи и один или несколько совместно действующих вариабельных доменов в легкой цепи. В результате выполнения сравнительного анализа последовательностей были идентифицированы CDR-области тяжелой и легкой цепей для вышеуказанного антитела против α2-интегрина.

Первым объектом настоящего изобретения являются пептид или пептидный комплекс, предпочтительно выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с I-доменом α2-интегрина человека, при этом указанное антитело или его фрагмент включает домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) и домен вариабельной области легкой цепи (VL) и обладает перекрестной реактивностью с α2-интегрином примата кроме человека, и не обладает перекрестной реактивностью с α2-интегрином вида, отличного от примата.

Вторым объектом настоящего изобретения являются пептид или пептидный комплекс, предпочтительно выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с I-доменом α2-интегрина человека, при этом указанное антитело или его фрагмент включает домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) и домен вариабельной области легкой цепи (VL) и конкурирует с эталонным антителом за связывание с эпитопом эталонного антитела, включающего легкую цепь, кодированную плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23944, и тяжелую цепь, кодированную (i) плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23946, или (ii) плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23945.

Третьим объектом настоящего изобретения является пептид или пептидный комплекс, включающий один или несколько нижеследующих компонентов а-f:

(а) LCDR1, где LDR1 является последовательностью RASESVESYGNSFIY (SEQ ID NO:6) или ее функционально активным вариантом;

(b) LCDR2, где LDR2 является последовательностью LASNLAS (SEQ ID NO:7) или ее функционально активным вариантом;

(с) LCDR3, где LDR3 является последовательностью QQNNEDPYT (SEQ ID NO:8) или ее функционально активным вариантом;

(d) HCDR1, где HDR1 является последовательностью GYTFTSYWMN (SEQ ID NO:3) или ее функционально активным вариантом;

(е) HCDR2, где HDR2 является последовательностью RIDPSDSETHYNQKFK (SEQ ID NO:4) или ее функционально активным вариантом; и

(f) HCDR3, где HDR3 является последовательностью VGRGYFDY (SEQ ID NO:5) или ее функционально активным вариантом;

при этом один или несколько компонентов а)-f) расположены с возможностью связывания пептида или пептидного комплекса с α2-интегрином.

Четвертым объектом настоящего изобретения является вышеуказанный пептид или пептидный комплекс, предназначенный для лечения, профилактики или диагностики нарушения или заболевания, связанного с α2-интегрином.

Пятым объектом настоящего изобретения является одна или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих пептид или пептидный комплекс по настоящему изобретению.

Шестым объектом настоящего изобретения является клетка, гетерологично экспрессирующая одну из нуклеиновых кислот по настоящему изобретению.

Седьмым объектом настоящего изобретения является способ получения пептида или пептидного комплекса по настоящему изобретению, который включает культивирование клетки по настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию пептида или пептидного комплекса, и необязательно выделение указанного пептида или пептидного комплекса из клетки-хозяина.

Восьмым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая по меньшей мере один пептид или пептидный комплекс по настоящему изобретению и/или по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, которая предназначена для использования в качестве лекарственного средства.

Девятым объектом настоящего изобретения является способ диагностики заболевания, ассоциированного с измененным α2-интегрином, который включает:

а) контактирование образца, включающего α2-интегрин, с пептидом или пептидным комплексом по любому из пунктов 1-3;

b) обнаружение связывания α2-интегрина с пептидом или пептидным комплексом; и

с) сравнение связывания, обнаруженного на стадии b), с эталонным образцом,

при этом связывание измененного α2-интегрина в исследуемом образце по сравнению с эталонным образцом указывает на наличие заболевания.

Десятым объектом настоящего изобретения является изделие, включающее:

а) упаковочный материал,

b) пептид или пептидный комплекс по любому из пунктов 1-3 или его фармацевтически приемлемую соль,

с) этикетку или вкладыш, находящийся внутри упаковочного материала, с информацией о том, что указанный пептид или пептидный комплекс позволяет эффективно лечить заболевание или нарушение, в частности, заболевание или нарушение, связанное с α2-интегрином.

Одиннадцатым объектом настоящего изобретения является диагностический набор, предназначенный для диагностики нарушения или заболевания, связанного с α2-интегрином, который включает пептид или пептидный комплекс по настоящему изобретению, приемлемую упаковку и, возможно, соответствующие инструкции по использованию указанного пептида или пептидного комплекса для обнаружения α2-интегрина.

Двенадцатым объектом настоящего изобретения является способ лечения или диагностики нарушения или заболевания, связанного с α2-интегрином, который включает использование одного или нескольких пептидов или пептидных комплексов по настоящему изобретению и/или одной или нескольких нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или одной из фармацевтических композиций по настоящему изобретению.

Тринадцатым объектом настоящего изобретения является способ диагностики заболевания, ассоциированного с измененным α2-интегрином, который включает:

а) контактирование образца, полученного у субъекта, с пептидом или пептидным комплексом по настоящему изобретению;

b) обнаружение связывания α2-интегрина с пептидом или пептидным комплексом; и

с) сравнение связывания, обнаруженного на стадии b), со связыванием α2-интегрина с пептидом или пептидным комплексом в одном или нескольких эталонных образцах;

при этом связывание в полученном образце, отличающееся от связывания, обнаруженного в одном или нескольких эталонных образцах, указывает на наличие заболевания.

Определенные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с I-доменом α2-интегрина человека, при этом указанное антитело или фрагмент включает домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) и домен вариабельной области легкой цепи (VL) и обладает перекрестной реактивностью с α2-интегрином примата кроме человека и не обладает перекрестной реактивностью с α2-интегрином вида, отличного от примата.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к выделенному моноклональному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с I-доменом α2-интегрина человека, при этом указанное антитело или его фрагмент включает домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) и домен вариабельной области легкой цепи (VL) и конкурирует с эталонным антителом за связывание с эпитопом эталонного антитела, включающего легкую цепь, кодированную плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23944, и тяжелую цепь, кодированную (i) плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23946, или (ii) плазмидой, депонированной в DSMZ под номером доступа DSM 23945.

В одном варианте осуществления изобретения указанное антитело или его фрагмент специфически связывается с I-доменом α2-интегрина человека со сродством связывания в нМ диапазоне. В другом варианте осуществления изобретения указанное антитело или его фрагмент ингибирует взаимодействие α2-интегрина человека с коллагеном in vitro, подавляя, таким образом, активацию тромбоцитов вследствие адгезии указанных тромбоцитов с указанным коллагеном.

В одном варианте осуществления изобретения указанный домен вариабельной области тяжелой цепи включает HCDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO:5. В другом варианте осуществления изобретения указанный домен вариабельной области тяжелой цепи включает CDR-области тяжелой цепи SEQ ID NO:3 (HCDR1), SEQ ID NO:4 (HCDR2) и SEQ ID NO:5 (HCDR3) или их функционально активные варианты. В одном варианте осуществления изобретения функционально активный вариант HCDR2 включает мутацию Asp→Glu в положении аминокислоты 6.

В одном варианте осуществления изобретения домен вариабельной области легкой цепи включает LCDR3 легкой цепи SEQ ID NO:8. В другом варианте осуществления изобретения домен вариабельной области легкой цепи включает CDR-области легкой цепи SEQ ID NO:6 (LCDR1), SEQ ID NO:7 (LCDR2) и SEQ ID NO:8 (LCDR3) или их функционально активные варианты. В одном варианте осуществления изобретения функционально активный вариант LCDR1 включает мутацию Asn→Gln в положении аминокислоты 11.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность домена вариабельной области тяжелой цепи (VH) по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична последовательности VH SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления изобретения указанный домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) включает последовательность SEQ ID NO:2 или ее функционально активный вариант.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность домена вариабельной области легкой цепи (VL) по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична последовательности VL SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения указанный домен вариабельной области легкой цепи (VL) включает последовательность SEQ ID NO:1 или ее функционально активный вариант.

В одном варианте осуществления изобретения домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) включает одну или несколько замен аминокислот в положениях, выбираемых из группы, состоящей из Н5, Н7, Н11, Н12, Н17, Н20, Н38, Н40, Н43, Н55, Н61, Н65, Н66, Н67, Н76, Н81, Н82, Н87, Н91, Н93, Н112, Н113 и Н116. В одном варианте осуществления изобретения одну или несколько замен аминокислот выбирают из группы, состоящей из 5His→Val, 7Pro→Ser, 11Leu→Val, 12Val→Lys, 17Pro→Ser, 20Leu→Val, 38Lys→Arg, 40Arg→Ala, 43Arg→Gln, 55Asp→Glu, 61Asn→Ala, 65Lys→Gln, 66Asp→Gly, 67Lys→Arg, 76Ser→Thr, 81Ile→Met, 82Gln→Glu, 87Thr→Arg, 91Ser→Thr, 93Val→Lys, 112Thr→Leu, 113Leu→Val и 116Ser→Val.

В одном варианте осуществления изобретения домен вариабельной области легкой цепи (VL) включает одну или несколько замен аминокислот в положениях, выбираемых из группы, состоящей из L9, L12, L15, L22, L34, L46, L47, L80, L83, L85, L87 и L89. В одном варианте осуществления изобретения одну или несколько замен аминокислот выбирают из группы, состоящей из 9Ala→Ser, 12Ala→Ser, 15Leu→Val, 15Leu→Pro, 22Ser→Thr, 34Asn→Gln, 46Gln→Lys, 47Ala→Pro, 80Asp→Asn, 83Glu→Gln, 85Asp→Glu, 87Ala→Thr и 89Thr→Asn.

В одном варианте осуществления изобретения последовательность домена вариабельной области тяжелой цепи (VH) по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична последовательности VH, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:38 (НС1), SEQ ID NO:39 (НС2), SEQ ID NO:40 (НС3), SEQ ID NO:41 (НС4), SEQ ID NO:42 (НС5), SEQ ID NO:43 (НС6) и SEQ ID NO:44 (НС7). В другом варианте осуществления изобретения домен вариабельной области тяжелой цепи (VH) включает последовательность HV, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:38 (НС1), SEQ ID NO:39 (НС2), SEQ ID NO:40 (НС3), SEQ ID NO:41 (НС4), SEQ ID NO:42 (НС5), SEQ ID NO:43 (НС6) и SEQ ID NO:44 (НС7).

В одном варианте осуществления изобретения последовательность домена вариабельной области легкой цепи (VL) по меньшей мере на 90%, 95%, 97% или 99% идентична последовательности VL, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO:33 (LC1), SEQ ID NO:34 (LC2), SEQ ID NO:35 (LC3), SEQ ID NO:36 (LC4) и SEQ ID NO:37 (LC5). В другом варианте осуществления изобретения домен вариабельной области легкой цепи (VL) включает последовательность VL, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:33 (LC1), SEQ ID NO:34 (LC2), SEQ ID NO:35 (LC3), SEQ ID NO:36 (LC4) и SEQ ID NO:37 (LC5).

В одном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть является химерным антителом или гуманизированным антителом. В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающую часть выбирают из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, Fv с дисульфидной связью, scFv и (scFv)₂. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающую часть выбирают из группы, состоящей из мультиспецифического антитела, двуспецифического антитела, изотипически сходного антитела, антитела с двумя вариабельными доменами и биспецифического антитела. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть включает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, выбираемый из группы, состоящей из константного домена IgM человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgG2 человека, константного домена IgG3 человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgE человека и константного домена IgA человека. В одном варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающая часть включает константный домен IgG4 человека.

Еще одним объектом изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность антитела или его антигенсвязывающей части по настоящему изобретению. Другим объектом изобретения является рекомбинантный экспрессирующий вектор, включающий указанную нуклеиновую кислоту. Другим объектом изобретения является клетка-хозяин, включающая рекомбинантный экспрессирующий вектор. Другим объектом изобретения является способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих продуцирование антитела клеткой-хозяином.

Еще одним объектом изобретения является фармацевтическая композиция, включающая антитело или его антигенсвязывающую часть и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. Другим объектом изобретения является способ лечения, профилактики или диагностики нарушения или заболевания, связанного с α2-интегрином, который включает введение нуждающемуся субъекту указанной фармацевтической композиции. В одном варианте осуществления изобретения заболевание или нарушение, связанное с α2-интегрином, выбирают из группы, состоящей из тромбоза, сосудистого заболевания, рака, включающего развитие кровеносных сосудов и метастазирование, воспаления, воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания и заболевания, характеризующегося анормальным или повышенным развитием кровеносных сосудов, воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, реакций на трансплантат, ретробульбарного неврита, травмы спинного мозга, ревматоидного артрита, системной красной волчанки (SLE), рассеянного склероза, синдрома Рейнауда, экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита, синдрома Шегрена, склеродермии, сердечно-сосудистого заболевания, псориаза и инфекций, вызывающих воспалительную реакцию. В другом варианте осуществления изобретения заболевание или нарушение, связанное с α2-интегрином, выбирают из группы, состоящей из острого коронарного синдрома, окклюзии коронарной артерии, ишемического инсульта, стеноза сонной артерии или окклюзии периферических артерий.

Подробное описание изобретения

Определения терминов

Прежде чем перейти к подробному описанию настоящего изобретения, следует отметить, что данное изобретение не ограничено рассмотренными ниже конкретными методами, процедурами и реагентами, которые могут изменяться. Также следует отметить, что термины, использованные в настоящем описании изобретения, служат только для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не ограничивают объем настоящего изобретения, который ограничен только прилагаемой формулой изобретения. За исключением особо оговоренных случаев все технические и научные термины, использованные в настоящем описании изобретения, имеют значения, известные специалистам в той области, к которой относится данное изобретение.

Термины, использованные в настоящем описании изобретения, предпочтительно имеют значения, приведенные в словаре “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recomendations)”, Leuenberger, H.G.W., Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).

В приведенном ниже описании изобретения и формуле изобретения, если из контекста не следует обратное, слово “включать” и его варианты, такие как “включает” и “включающий”, предполагают включение указанного целого числа, стадии, группы целых чисел или стадий, а не исключение любого целого числа, стадии, группы целых чисел или стадий.

В тексте настоящего описания изобретения процитировано несколько документов (например, патентов, заявок на патент, научных публикаций, спецификаций производителей, инструкций, последовательностей под номерами доступа, зарегистрированными в Genbank и т.д.). Следует отметить, что в описании изобретения допустимо упоминание ранее известных изобретений. Некоторые документы, приведенные в настоящем изобретении, “включены в настоящее описание изобретение в качестве ссылки”. В случае возникновения противоречия между определениями или положениями, приведенными в таких ссылках, и определениями или положениями, приведенными в настоящем описании изобретения, приоритет принадлежит тексту настоящего описания изобретения.

Последовательности. Все последовательности, приведенные в настоящем описании изобретения, представлены в прилагаемом списке последовательностей, полное содержание которого является частью настоящего описания изобретения.

Термин “примерно” применительно к числовому значению означает числовые значения в диапазоне, нижний предел которого на 5% меньше указанного числового значения и верхний предел на 5% больше указанного числового значения.

Термин “альфа2-интегрин” или “α2-интегрин” в использованном здесь значении означает альфа2-интегрин, известный в данной области, предпочтительно альфа2-интегрин человека и, в частности, альфа2-интегрин человека, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, показанную в SEQ ID NO:21, и аминокислотную последовательность SEQ ID NO:20 или ее биологически активный фрагмент. Термин “I-домен” означает часть альфа2-интегрина, которая подчеркнута и выделена жирным шрифтом в SEQ ID NO:20.

Термины “специфически связывается”, “специфическое связывание” или тому подобные означают, что пептид или пептидный комплекс, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, образует с антигеном комплекс, который является относительно устойчивым в физиологических условиях. Специфическое связывание может быть охарактеризовано константой равновесной диссоциации, равной по меньшей мере примерно 1×10^-6 М или меньше (например, меньшее значение K_D означает более прочное связывание). В данной области хорошо известны методы определения специфического связывания двух молекул, которые включают, например, равновесный диализ, резонанс поверхностных плазмонов и тому подобные. Выделенное антитело, которое специфически связывается с альфа2-интегрином, однако, может обладать перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы альфа2-интегрина других видов. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению, специфичные к α2-интегрину, связываются с α2-интегрином человека и приматов кроме человека со сродством, которое по меньшей мере в два раза больше сродства связывания с неспецифическим антигеном (например, с α2-интегрином животных, отличных от приматов). Кроме того, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), связывающиеся с альфа2-интегрином и одним или несколькими дополнительными антигенами, тем не менее, считаются антителами, которые “специфически связываются” с альфа2-интегрином в значении, использованном в настоящем описании изобретения.

Термин “K_D” в использованном здесь значении означает константу равновесной диссоциации при взаимодействии определенного пептида/пептидного комплекса с молекулой-мишенью или антитела с антигеном. Константу равновесной диссоциации обычно измеряют в “моль/л” (сокращенное обозначение “M”).

Термин “медленная скорость диссоциации”, “Koff” или “kd” означает диссоциацию пептида/пептидного комплекса или антитела с альфа2-интегрином с константой скорости, равной 1×10^-3 с^-1 или меньше, предпочтительно 1×10^-4 с^-1 или меньше, при определении методом резонанса поверхностных плазмонов, например, BIACORE™.

Термин “высокоаффинное” антитело означает моноклональные антитела, обладающие сродством связывания к альфа2-интегрину человека, равным по меньшей мере 10^-10 М, предпочтительно 10^-11 М, еще предпочтительнее 10^-12 М, при измерении методом резонанса поверхностных плазмонов, например, BIACORE™, методом ELISA определения сродства в растворе.

Термин “резонанс поверхностных плазмонов” в использованном здесь значении означает оптическое явление, позволяющее анализировать специфические биологические взаимодействия в реальном времени путем обнаружения изменений концентрации белка в биосенсорной матрице, например, при использовании системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.).

“Эпитоп”, также известный как антигенная детерминанта, представляет собой область антигена, узнаваемую иммунной системой, в частности, антителами, В-клетками или Т-клетками. В использованном здесь значении термин “эпитоп” означает часть антигена, способную связываться с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению. В данном контексте термин “связывание” предпочтительно означает “специфическое связывание” в значении, использованн