Применение антитела к cd20 типа ii, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (adcc), в сочетании с циклофосфамидом, винкристином и доксорубицином для лечения неходжкинских лимфом

Применение антитела к cd20 типа ii, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (adcc), в сочетании с циклофосфамидом, винкристином и доксорубицином для лечения неходжкинских лимфом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего экспрессирующих CD20 видов рака, в сочетании с химиотерапевтическим средством, выбранным из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.

Предпосылки создания изобретения

Молекула CD20 (которую обозначают также как характерный для человеческих В-лимфоцитов дифференцировочный антиген или Вр35) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой примерно 35 кДа, локализованный на пре-В- и зрелых В-лимфоцитах (Valentine М.А. и др., J. Biol. Chem. 264(19), 1989, cc.11282-11287; и Einfield D.A. и др., EMBOJ. 7(3), 1988, cc.711-717). CD20 обнаружен на поверхности более 90% В-клеток из периферической крови или лимфоидных органов, и он экспрессируется во время раннего развития пре-В-клеток и сохраняется до дифференцировки в плазматические клетки. CD20 присутствует на поверхности как здоровых, так и злокачественных В-клеток. В частности, при неходжкинских лимфомах (НХЛ) CD20 экспрессируется на поверхности более 90% В-клеток (Anderson K.С. и др., Blood 63(6), 1984, cc.1424-1433), но он не выявлен на гематопоэтических стволовых клетках, про-В-клетках, здоровых плазматических клетках или в других здоровых тканях (Tedder T.F. и др., J. Immunol. 135(2), 1985, cc.973-979).

Состоящая из 85 аминокислот карбоксильная концевая область белка CD20 локализована в цитоплазме. Длина этой области отличается от длины других специфических для поверхности В-клеток структур, таких как тяжелые цепи IgM, IgD и IgG или антигены комплекса гистосовместимости класса II или β-цепи, которые имеют относительно короткие внутрицитоплазматические области, состоящие из 3, 3, 28, 15 и 16 аминокислот соответственно (Komaromy М. и др., NAR 11, 1983, cc.6775-6785). Среди последних 61 аминокислот карбоксильного конца 21 представляют собой кислотные остатки, а только 2 являются основными, что свидетельствует о том, что эта область имеет большой чистый отрицательный заряд (GenBank, регистрационный № NP-690605). Считается, что CD20 может принимать участие в регуляции на ранней(их) стадии(ях) процесса активации и дифференцировки В-клеток (Tedder T.F. и др., Eur. J. Immunol. 16, 1986, cc.881-887) и может функционировать в качестве ион-селективного кальциевого канала (Tedder T.F. и др., J. Cell. Biochem. 14D, 1990, с.195).

Существуют два различных типа антител к CD20, которые существенно отличаются механизмом связывания CD20 и биологической активностью (Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, cc.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood, 101, 2003, cc.1045-1052). Антитела типа I, такие, например, как ритуксимаб, обладают сильной опосредуемой комплементом цитотоксичностью, в то время как антитела типа II, такие, например, как тозитумомаб (B1), 11B8, АТ80 или гуманизированные антитела В-Ly1, эффективно инициируют гибель клеток-мишеней посредством независимого от каспазы апоптоза при сопутствующей обработке фосфатидилсерином.

Характерные особенности антител к CD20 типа I и типа II обобщены в таблице 1.

Таблица 1:
Свойства антител к CD20 типа I и типа II
Антитела к CD20 типа I	Антитела к CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализуют CD20 в липидных «плотиках»	Не локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Повышенный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)	Пониженный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)	ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
Полная связывающая активность	Пониженная связывающая активность
Гомотипическая агрегация	Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании	Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.

Изобретение относится также к применению антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения пациента, который страдает раком, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.

Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), которое предназначено для лечения рака, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.

Изобретение относится также к антителу к CD20 типа II, обладающему повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), которое предназначено для лечения пациента, страдающего раком, при котором происходит экспрессия CD20, в сочетании с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами, выбранными из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин.

Предпочтительно лечение с помощью антитела к CD20 типа II, обладающего повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), осуществляют в сочетании с циклофосфамидом и винкристином.

В изобретении предложена фармацевтическая композиция, которая содержит как антитело к CD20 типа II, обладающее повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC), так и одно или несколько химиотерапевтических средств, выбранных из группы, включающей циклофосфамид, винкристин и доксорубицин, которую применяют при раке, при котором происходит экспрессия CD20, в частности при В-клеточных неходжкинских лимфомах (НХЛ).

Предпочтительно указанное антитело к CD20 типа II представляет собой подвергнутое гликоинженерии гуманизированное антитело B-Ly1.

Подробное описание изобретения

Понятие «антитело» относится к различным формам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) полные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела и созданные с помощью генной инженерии антитела, такие как моноклональные антитела, химерные антитела или рекомбинантные антитела, а также фрагменты указанных антител, если они сохраняют отличительные признаки антител, предлагаемых в изобретении.

Понятия «моноклональное антитело» или «композиция моноклонального антитела» в контексте настоящего описания относятся к препарату, содержащему молекулы антитела, которые имеют одинаковый аминокислотный состав. Соответственно понятие «человеческое моноклональное антитело» относится к антителам, обладающим одинаковой специфичностью связывания, которые имеют вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения человеческие моноклональные антитела получают с помощью гибридомы, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного кроме человека, например, трансгенной мыши, имеющей геном, который содержит трансген человеческой тяжелой цепи и трансген человеческой легкой цепи, слитые с иммортализованной клеткой.

Предпочтительно указанное антитело к CD20 типа II представляет собой моноклональное антитело.

Понятие «химерное антитело» относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, выведенную из одного источника или видов, и по меньшей мере часть константной области, выведенную из другого источника или видов, которое, как правило, получают методами рекомбинантной ДНК. Наиболее предпочтительными являются химерные антитела, содержащие мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Такие мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессируемых генов иммуноглобулина, содержащих сегменты ДНК, которые кодируют мышиные вариабельные области иммуноглобулина, и сегменты ДНК, которые кодируют человеческие константные области иммуноглобулина. Другими формами «химерных антител», подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен по сравнению с исходным антителом. Такие «химерные» антитела называют также «антителами переключенного класса». Методы получения химерных антител основаны на общепринятых методиках рекомбинантной ДНК и методиках генной трансфекции, и в настоящее время являются хорошо известными в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc.6851-6855; US 5202238 и US 5204244).

Понятие «гуманизированное антитело» относится к антителам, в которых каркасный участок или «гипервариабельные участки» (CDR) модифицированы таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, в результате чего образуется «гуманизированное антитело» (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, cc.323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, cc.268-270). Особенно предпочтительными CDR являются CDR, которые содержат последовательности, распознающие антигены, указанные выше для химерных и бифункциональных антител.

Подразумевается, что в контексте настоящего описания понятие «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельную и константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc.368-374). На основе указанной технологии можно получать человеческие антитела к широкому разнообразию мишеней. Примеры человеческих антител описаны у Kellermann S.A. и др., Curr Opin Biotechnol. 13, 2002, cc.593-597.

Подразумевается, что понятие «рекомбинантное человеческое антитело» в контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, из мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессируемые с помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектируют клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии, в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении, подвергали in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH- и VL-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными им, но могут не встречаться в существующем в естественных условиях in vivo спектре зародышевых линий человеческого антитела.

В контексте настоящего описания понятие «специфически связывается» или «связывается специфически с» относится к антителу, специфически связывающемуся с антигеном CD20. Предпочтительно аффинность к связыванию характеризуется значением KD, составляющим 10^-9 молей/л или менее (например, 10^-10 молей/л), предпочтительно значением KD, составляющим 10^-10 молей/л или менее (например, 10^-12 молей/л). Аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, например, анализа графиков Скэтчарда, с использованием экспрессирующих CD20 клеток.

Подразумевается, что понятие «молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно она представляет собой двухцепочечную ДНК.

«Константные области» не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но они участвуют в эффекторных функциях (таких как ADCC, связывание комплемента и CDC).

Понятия «вариабельная область» (вариабельная область легкой цепи (VL), вариабельная область тяжелой цепи (VH)) в контексте настоящего описания обозначает каждую из пар легких и тяжелых цепей, которые принимают непосредственное участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные области человеческих легкой и тяжелой цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждая область содержит четыре каркасных участка (FR), последовательности которых в значительной степени являются консервативными, соединенные тремя «гипервариабельными участками» (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки адаптированы к β-складчатой конформации, и CDR могут образовывать петли, соединяющие β-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживают свою трехмерную структуру с помощью каркасных участков и образуют вместе с CDR из другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют наиболее важную роль в специфичности/аффинности к связыванию антител, предлагаемых в изобретении, и поэтому они представляют собой еще один объект изобретения.

Понятия «гипервариабельный участок» или «антигенсвязывающий центр антитела» в контексте настоящего описания относятся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из «определяющих комплементарность участков» или «CDR». «Каркасные» или «FR»-участки представляют собой участки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельного участка, как он определен в настоящем описании. Таким образом, легкая и тяжелая цепи антитела содержат в направлении от N- к С-концу следующие участки: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой участок, который прежде всего вносит основной вклад в связывание с антигеном. CDR- и FR-участки определяют согласно стандартной номенклатуре Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1991) и/или как участки из «гипервариабельной петли».

Понятия «CD20» и «антиген CD20» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо, и они включают любые варианты, изоформы и видовые гомологи человеческого CD20, которые в естественных условиях экспрессируются клеткой или экспрессируются на клетках, трансфектированных геном CD20. Связывание антитела, предлагаемого в изобретении, с антигеном CD20 опосредует уничтожение клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки), путем инактивации CD20. Уничтожение клеток, экспрессирующих CD20, может происходить посредством одного или нескольких из следующих механизмов: индукция клеточной гибели/апоптоза, ADCC и CDC.

Синонимами CD20, принятыми в данной области, являются антиген CD20 В-лимфоцитов, поверхностный антиген В-лимфоцитов B1, Leu-16, Bp35, BM5, и LF5.

Понятие «антитело к CD20», предлагаемое в изобретении, относится к антителу, которое специфически связывается с антигеном CD20. В зависимости от характеристик связывания и биологической активности антитела к CD20 в отношении антигена CD20 можно различать два типа антител к CD20 (антитела к CD20 типа I и типа II) согласно Cragg M.S. и др., Blood 103, 2004, cc.2738-2743; и Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, cc.1045-1052 (см. таблицу 2).

Таблица 2:
Свойства антител к CD20 типа I и типа II
Антитела к CD20 типа I	Антитела к CD20 типа II
Эпитоп CD20 типа I	Эпитоп CD20 типа II
Локализуют CD20 в липидных «плотиках»	Не локализуют CD20 в липидных «плотиках»
Повышенный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)	Пониженный уровень CDC (в случае IgG1-изотипа)
ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)	ADCC-активность (в случае IgG1-изотипа)
Полная связывающая активность	Пониженная связывающая активность
Гомотипическая агрегация	Более сильная гомотипическая агрегация
Индукция апоптоза при перекрестном сшивании	Сильная индукция клеточной гибели без перекрестного сшивания

Одним из основных свойств антител к CD20 типа I и типа II является их механизм связывания. Так, антитела к CD20 типа I и типа II можно классифицировать по соотношению способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (клетки линии африканской лимфомы Беркитта) (АТСС № CCL-86).

Антитела к CD20 типа II характеризуются тем, что соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) составляет от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5. Примерами указанных антител к CD20 типа II являются, например, тозитумомаб (B1 IgG2a), гуманизированное антитело В-Ly1 изотипа IgG1 (химерное гуманизированное антитело изотипа IgG1 описано в WO 2005/044859), 11В8 IgG1 (описано в WO 2004/035607) и АТ80 IgG1. Предпочтительным антителом к CD20 типа II является моноклональное антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и гуманизированное антитело В-Ly1 (описанное в WO 2005/044859).

Антитела к CD20 типа I в отличие от антител типа II характеризуются тем, что соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) составляет от 0,8 до 1,2, предпочтительно от 0,9 до 1,1. Примерами указанных антител к CD20 типа I являются, например, ритуксимаб, 1F5 IgG2a (ECACC, гибридома; Press O.W. и др., Blood 69/2, 1987, cc.584-591), HI47 IgG3 (ECACC, гибридома), 2С6 IgG1 (описано в WO 2005/103081), 2F2 IgG1 (описано в WO 2004/035607 и WO 2005/103081) и 2Н7 IgG1 (описано в WO 2004/056312).

«Соотношение способностей антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86)» определяют методом прямой иммунофлуоресценции (измеряют среднюю интенсивность флуоресценции (MFI)) с помощью устройства FACSArray (фирма Becton Dickinson), используя указанное антитело к CD20, конъюгированное с Cy5, и ритуксимаб, конъюгированный с Cy5, на Raji-клетках (АТСС № CCL-86), согласно методу, описанному в примере 2, и рассчитывают следующим образом:

Соотношение способности связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86) = M F I ( C y 5 − а н т и т е л о   к   C D 20 ) M F I ( C y 5 − р и т у к с и м а б ) ⋅ у р о в е н ь   C y 5 − м е ч е н и я   ( C y 5 − р и т у к с и м а б ) у р о в е н ь   C y − м е ч е н и я   ( C y 5 − а н т и т е л о   к − C D 20 )

MFI обозначает среднюю интенсивность флуоресценции. «Уровень Cy5-мечения» в контексте настоящего описания означает количество меченных Cy5 молекул на молекулу антитела.

Как правило, для указанных антител к CD20 типа II характерно соотношение способностей указанного антитела к CD20 и ритуксимаба связывать CD20 на Raji-клетках (АТСС № CCL-86), составляющее от 0,3 до 0,6, предпочтительно от 0,35 до 0,55, более предпочтительно от 0,4 до 0,5.

Указанное антитело к CD20 типа II, предлагаемое в изобретении, обладает повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC).

Под «антителом, обладающим повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC) или «антителом с повышенной антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичностью (ADCC)» понимают антитело, характеристики которого описаны выше, обладающее повышенной ADCC при определении с помощью любого пригодного метода, известного обычным специалистам в данной области. Один из приемлемых анализов in vitro ADCC предусматривает, что:

1) в анализе используют клетки-мишени, для которых известно, что они экспрессируют антиген-мишень, распознаваемый антигенсвязывающей областью антитела;

2) в качестве эффекторных клеток в анализе используют мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС), выделенные из крови произвольно выбранного здорового донора;

3) анализ осуществляют согласно следующему протоколу:

I) выделяют РВМС с помощью стандартных процессов центрифугирования в градиенте плотности и суспендируют из расчета 5×10⁶ клеток/мл в RPMI-среде для культивирования клеток;

II) выращивают клетки-мишени с помощью стандартных методов культивирования тканей, собирают клетки на экспоненциальной фазе роста, жизнеспособность которых превышает 90%, отмывают в RPMI-среде для культивирования клеток, метят ⁵¹Cr (100 мкКи), отмывают дважды в среде для культивирования клеток и ресуспендируют в среде для культивирования клеток с плотностью 10⁵ клеток/мл;

III) осуществляют трансфекцию, используя по 100 мкл указанной выше конечной суспензии клеток-мишеней на каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета;

IV) осуществляют серийное разведение антитела от 4000 до 0,04 нг/мл в среде для культивирования клеток и добавляют по 50 мкл образовавшихся растворов антитела к клеткам-мишеням в 96-луночном титрационном микропланшете, оценивают в трех повторностях антитело в различных концентрациях, покрывающих весь диапазон указанных выше концентраций;

V) для контроля максимального высвобождения (MR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл 2%-ного (VN) водного раствора неионогенного поверхностно-активного вещества (Nonidet, фирма Sigma, Сент-Люис) вместо раствора антитела (пункт IV, выше);

VI) для контроля спонтанного высвобождения (SR) в 3 дополнительные лунки в планшете, содержащие меченые клетки-мишени, вносят по 50 мкл RPMI-среды для культивирования клеток вместо раствора антитела (пункт IV, выше);

VII) затем 96-луночный титрационный микропланшет центрифугируют при 50×g в течение 1 мин и инкубируют в течение 1 ч при 4°С;

VIII) добавляют по 50 мкл суспензии РВМС (пункт I, выше) в каждую лунку для обеспечения соотношения эффекторная клетка:клетка-мишень 25:1, и планшеты помещают в инкубатор в атмосферу, содержащую 5% CO₂, на 4 ч при 37°С;

IX) собирают бесклеточный супернатант из каждой лунки и количественно оценивают высвободившуюся в эксперименте радиоактивность (ER) с помощью гамма-счетчика;

X) рассчитывают процент удельного лизиса для каждой концентрации антитела с помощью формулы (ER-MR)/(MR-SR)×100, где ER представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для указанной концентрации антитела, MR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для MR-контролей (см. пункт V, выше), а SR представляет собой среднюю радиоактивность (см. пункт IX, выше), определенную для SR-контролей (см. пункт VI, выше);

4) определяют «повышенный уровень ADCC» или по повышению максимального процента удельного лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела, и/или по снижению концентрации антитела, требуемой для достижения половины от максимального процента специфического лизиса, обнаруженного в указанном выше диапазоне концентраций антитела. Повышение уровня ADCC определяют относительно уровня ADCC, измеренного с помощью описанного выше анализа, опосредуемого таким же антителом, полученным с использованием такого же типа клеток-хозяев, с использованием таких же стандартных методов очистки, приготовления форм и хранения, которые хорошо известны специалистам в данной области, но которое не получено с использованием клеток-хозяев, сконструированных так, что они сверхэкспрессируют GnTIII.

Указанную «повышенную (повышенный уровень) ADCC» можно получать путем гликоинженерии указанных антител, что означает повышение встречающихся в естественных условиях опосредуемых клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем инженерии их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana, P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180 и в US 6602684.

Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (CDC)» относится к лизису человеческих опухолевых клеток-мишеней антителом, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. CDC предпочтительно оценивают путем обработки препарата экспрессирующих CD20 клеток антителом к CD20, предлагаемым в изобретении, в присутствии комплемента. Считается, что имеет место CDC, если антитело при его использовании в концентрации 100 нМ индуцирует лизис (гибель клеток) 20% или более опухолевых клеток в течение 4 ч. Анализ предпочтительно осуществляют с помощью меченных ⁵¹Cr или Eu опухолевых клеток и оценивают высвобождение ⁵¹Cr или Eu. В качестве контроля опухолевые клетки-мишени инкубируют с комплементом без антитела.

Как правило, антитела к CD20 типа II изотипа IgG1 характеризуются наличием CDC-активности. Антитела к CD20 типа II обладают пониженной CDC (в случае изотипа IgG1) по сравнению с антителами типа I изотипа IgG1. Предпочтительно антитела к CD20 типа II представляют собой антитела изотипа IgG1.

Антитело «ритуксимаб» (референс-антитело; пример антитела к CD20 типа I) представляет собой созданное с помощью генетической инженерии химерное человеческое/мышиное содержащее человеческую гамма-1 константную область моноклональное антитело к человеческому антигену CD20. Химерное антитело содержит человеческие гамма-1 константные области и идентифицировано под названием «С2В8» в US 5736137 (Anderson K.С. и др.), выданном 17 апреля 1998 г. на имя фирмы IDEC Pharmaceuticals Corporation. Ритуксимаб разрешен для лечения пациентов, страдающих рецидивирующей или рефракторной, низкой степени злокачественности или фолликулярной, CD20-позитивной, В-клеточной неходжкинской лимфомой. Изучение механизма действия в опытах in vitro продемонстрировало, что ритуксимаб обладает зависимой от человеческого комплемента цитотоксичностью (CDC) (Reff M.E. и др., Blood 83(2), 1994, сс.435-445). Кроме того, он обладает выраженной активностью в анализах по оценке антитело-обусловленной клеточнозависимой цитотоксичности (ADCC).

Понятие «гуманизированное антитело В-Ly1» относится к гуманизированному антителу В-Ly1, описанному в WO 2005/044859 и WO 2007/031875, которое получали из мышиного моноклонального антитела к CD20 В-Ly1 (вариабельная область мышиной тяжелой цепи (VH): SEQ ID NO:1; вариабельная область мышиной легкой цепи (VL): SEQ ID NO:2- см. Poppema S. и Visser L., Biotest Bulletin 3, 1987, cc.131-139;) путем химеризации с человеческой константной областью из IgG1 и последующей гуманизации (см. WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Эти «гуманизированные антитела В-Ly1» описаны подробно в WO 2005/044859 и WO 2007/031875.

Предпочтительно «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из SEQ ID NO:3 - SEQ ID No.20 (B-HH2 - B-HH9 и B-HL8 - B-HL17, которые описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Наиболее предпочтительными являются SEQ. ID NO:3, 4, 7, 9, 11, 13 и 15 (B-HH2, В-НН3, В-НН6, В-НН8, B-HL8, B-HL11 и B-HL13, которые описаны в WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Предпочтительно «гуманизированное антитело В-Ly1» имеет вариабельную область легкой (VL), которая представлена в SEQ ID NO:20 (B-KV1 WO 2005/044859 и WO 2007/031875). Кроме того, гуманизированное антитело В-Ly1 предпочтительно представляет собой антитело изотипа IgG1. Указанные гуманизированные антитела В-Ly1, предлагаемые в изобретении, созданы с помощью гликоинженерии (GE) в Fc-области согласно методам, описанным в WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/031875, у Umana P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180 и WO 99/154342. Указанные «созданные с помощью гликоинженерии гуманизированные антитела В-Ly1» имеют измененную схему гликозилирования в Fc-области, предпочтительно имеют пониженный уровень фукозных остатков. Предпочтительно по меньшей мере 40% или более (в одном из вариантов осуществления изобретения от 40% до 60%, в другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере 50%, а в еще одном варианте осуществления по меньшей мере 70% или более) олигосахаридов Fc-области являются нефукозилированными. Кроме того, олигосахариды Fc-области предпочтительно являются бисекционными.

Олигосахаридный компонент может оказывать существенное влияние на свойства, имеющие отношение к эффективности терапевтического гликопротеина, включая стабильность, устойчивость к воздействию протеаз, взаимодействия с иммунной системой, фармакокинетические параметры и специфическую биологическую активность. Указанные свойства могут зависеть не только от присутствия или отсутствия олигосахаридов, но также от их специфических структур. Можно сделать определенные обобщения, касающиеся зависимости структуры олигосахарида и функции гликопротеина. Например, некоторые структуры олигосахарида опосредуют быстрый клиренс гликопротеина из кровотока в результате взаимодействий со специфическими связывающими углеводы белками, а другие могут связываться антителами и запускать нежелательные иммунные реакции (Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).

Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для производства терапевтических гликопротеинов благодаря их способности гликозилировать белки с получением наиболее приемлемой для применения на человеке формы (dimming D.A. и др., Glycobiology 1, 1991, cc.115-130; Jenkins N. и др., Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981). Бактерии очень редко гликозилируют белки, и подобно другим типам обычных хозяев, таких как клетки дрожжей, нитчатых грибов, насекомых и растений, обеспечивают схемы гликозилирования, ассоциированные с быстрым клиренсом из кровотока, нежелательными иммунными взаимодействиями и в некоторых случаях пониженной биологической активностью. Среди клеток млекопитающих клетки яичника китайского хомячка (СНО) нашли наиболее широкое применение в течение двух последних десятилетий. Помимо обеспечения приемлемых схем гликозилрования эти клетки позволяют устойчиво получать генетически стабильные, высокопродуктивные клональные клеточные линии. Их можно культивировать, достигая высокой плотности, в простых биореакторах с использованием бессывороточных сред, и на их основе можно разрабатывать безопасные и воспроизводимые биопроцессы. Другими обычно применяемыми клетками животных являются клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки мышиной миеломы NSO и SP2/0. В последние годы изучали также возможность производства в трансгенных животных (Jenkins N. и др.. Nature Biotechnol. 14, 1996, cc.975-981).

Все антитела содержат углеводные структуры в консервативных положениях в константных областях тяжелой цепи, при этом каждый изотип характеризуется различной организацией N-связанных углеводных структур, которые оказывают различное действие на сборку, секрецию и функциональную активность белка (Wright А. и Monison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32).Структура присоединенного N-связанного углевода значительно варьируется в зависимости от степени процессирования и может включать имеющие высокое содержание маннозы, множество разветвлений, а также биантенные сложные олигосахариды (Wright А. и Morrison S. L., Trends Biotech. 15, 1997, cc.26-32). Как правило, имеет место гетерогенный процессинг структур коровых олигосахаридов, присоединенных в конкретном сайте гликозилирования, в результате чего даже моноклональные антитела существует в виде нескольких гликоформ. Было установлено также, что основные различия в гликозилировании антител имеют место между клеточными линиями, и даже небольшие различия требуют выращивания данной клеточной линии в других условиях культивирования (Lifely M. R. и др., Glycobiology 5(8), 1995, cc.813-22).

Одним из путей достижения значительного повышения эффективности при сохранении простого процесса получения и, который, по-видимому, может обеспечить отсутствие значительных нежелательных побочных действий, является усиление встречающихся в естественных условиях обусловленных клеткой эффекторных функций моноклональных антител путем конструирования их олигосахаридного компонента согласно методу, описанному у Umana P. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и US 6602684. Антитела IgG1-типа, которые наиболее часто применяют в иммунотерапии рака, представляют собой гликопротеины, имеющие консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn297 в каждом СН2-домене. Два сложных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn297, располагают между СН2-доменами, формируя обширный контакт с полипептидным каркасом, и их присутствие является важным для того, чтобы антитело могло осуществлять эффекторные функции, такие как антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC) (Lifely M.R. и др., Glycobiology 5, 1995, cc.813-822; Jefferis R. и др., Immunol. Rev. 163, 1998, cc.59-76; Wright А. и Morrison S.L., Trends Biotechnol. 15, 1997, cc.26-32).

Ранее было установлено, что сверхэкспрессия β(1,4)-N-ацетилглюкозаминтрансферазы III («GnTIII»), т.е. гликозилтрансферазы, катализирующей образование бисекционных олигосахаридов, значительно повышает in vitro ADCC-активность антинеобластомного химерного моноклонального антитела (chCE7), продуцируемого сконструированными СНО-клетками (см. Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180; и WO 99/154342, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Антитело chCE7 принадлежит к большому классу неконъюгированных моноклональных антител, которые обладают высоким уровнем аффинности и специфичности в отношении опухолей, но обладают слишком низкой эффективностью для их клинического применения при производстве в стандартных применяемых в промышленности индустриальных клеточных линиях, в которых отсутствует фермент GnTIII (Umana Р. и др., Nature Biotechnol. 17, 1999, cc.176-180). В этом исследовании впервые было продемонстрировано, что значительное повышение ADCC-активности можно достигать путем создания продуцирующих антитела клеток, которые экспрессируют GnTIII, что приводит также к повышению относительного содержания ассоциированных с константной областью (Fc) бисекционных олигосахаридов, включая бисекционные нефукозилированные олигосахариды, по сравнению с уровнями, характерными для встречающихся в естественных условиях антител.

Подразумевается, что понятие «экспрессия антигена CD20» относится к значительному уровню экспрессии антигена CD20 в клетке, предпочтительно на клеточной поверхности Т- или В-клетки, более предпочтительно В-клетки, из опухоли или рака соответственно, предпочтительно из опухоли, не относящейся к плотным опухолям. Пациентов, которые имеют «рак, при котором происходит экспрессия CD20», можно выявлять с помощью стандартных анализов, известных в данной области. Например, экспрессию антигена CD20 оценивают иммуногистохимическим (ИГХ) методом, FACS или путем выявления с помощью ПЦР соответствующей мРНК.

Понятие «рак, при котором происходит экспрессия CD20» в контексте настоящего описания относится ко всем видам раковых клеток, для которых характерна экспрессия антигена CD20. Указанный рак, при котором происходит экспрессия CD20, может представлять собой, например, лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карциному фаллопьевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягкой ткани, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточную карциному, карциному почечных лоханок, мезотелиому, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоль позвоночника, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шваномы, эпендимомы, мебуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, в том числе устойчивые варианты любого из указанных выше видов рака или комбинаци