Производство изомальтоолигосахаридов и их применение

Производство изомальтоолигосахаридов и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Приоритет

Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/376545, поданной 24 августа 2010, полное содержание которой включено в настоящий документ во всей полноте путем ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящая технология в целом относится к способам получения изомальтоолигосахаридов с помощью инвертазы, полученной из Aspergillus niger и/или Aspergillus oryzae, и их применению. Изомальтоолигосахариды в способах получают из углеводных субстратов.

Уровень техники

Следующее описание предоставлено для содействия пониманию читателем. Представленная информация и цитированная литература не являются известными в уровне техники.

Изомальтоолигосахариды (ИМО) являются смешанными связанными олигосахаридами, имеющими в своем составе смеси α-(1,4)- и/или α-(1,6) глюкозидных связей. ИМО включают в себя изомальтозу, панозу, изомальтотриозу, изомальтотетрозу, изопанозу и другие более разветвленные олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды, ксилоолигосахариды и гентиоолигосахариды. Производство ИМО происходит через сложный ферментативный процесс, посредством которого исходный сырьевой материал превращается в субстрат мальтозы, например в кукурузную патоку. Впоследствии ИМО синтезируются ферментативно-катализируемой трансглюкозидной реакцией.

ИМО принадлежат к группе олигосахаридов, классифицируемых как целесообразные для здоровья пищевые олигосахариды (ЦЗПО). ИМО связывают с улучшением здоровья при потреблении на регулярной основе, и иногда их называют “пребиотики”. Пребиотики - это определенные неусвояемые вещества, например диетические волокна, которые вызывают какой-либо биологический эффект у субъекта посредством стимулирования роста симбиотических или полезных микроорганизмов. ИМО можно применять в качестве подслащивающих продуктов, которые можно употреблять в пищу.

Сущность изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ получения композиции изомальтоолигосахарида, содержащей: (a) взаимодействие крахмальной суспензии с ожижающим ферментом; и (b) взаимодействие продукта (a) с мальтогенным ферментом и инвертазой, где мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие отдельно, последовательно или одновременно для получения изомальтоолигосахаридов.

В одном варианте осуществления мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие одновременно. В одном варианте осуществления суспензия содержит от 15% до 45% крахмала по весу. В одном варианте осуществления инвертаза составляет, по меньшей мере, 0,0009% по весу всех реагентов (b). В одном варианте осуществления инвертаза составляет менее 2% по весу всех реагентов (b). В одном варианте осуществления (b) проводится при pH выше 2 и ниже 10. В одном варианте осуществления (b) проводится при температуре выше 10°C и ниже 85°C.

В одном аспекте изомальтоолигосахариды выбраны из группы, состоящей из изомальтозы, разветвленной глюкозы, DP3 глюкозы, панозы, изомальтотриозы, изомальтотетриозы, изомальтопентаозы, изомальтогексаозы и изомальтогептозы или любого их сочетания. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, 10% произведенных изомальтоолигосахаридов составляет паноза. В одном варианте осуществления способ дополнительно содержит очистку изомальтоолигосахаридов.

В одном варианте осуществления ожижающим ферментом является альфа-амилаза. В одном варианте осуществления мальтогенным ферментом является бета-амилаза. В одном варианте осуществления инвертаза обладает трансглюкозидазной активностью. В одном варианте осуществления инвертаза является инвертазой Aspergillus. В одном варианте осуществления инвертаза Aspergillus является инвертазой Aspergillus niger. Дополнительно или альтернативно в некоторых вариантах осуществления инвертаза Aspergillus является инвертазой Aspergillus oryza.

В одном варианте осуществления суспензия образована из одного или нескольких видов крахмала или жидкости. В одном варианте осуществления один или несколько видов крахмала выбраны из группы, состоящей из кукурузного крахмала, рисового крахмала, пшеничного крахмала, тапиоки, картофельного крахмала, крахмала из сладкого картофеля, сагового крахмала, ячменного крахмала, обработанного нагреванием/кислотой крахмала, зернистого крахмала, воскообразного кукурузного крахмала, соргового крахмала, кукурузного крахмала с высоким содержанием амилазы, жидкой декстрозы и их сочетаний. В одном варианте осуществления крахмал является кукурузным крахмалом.

В одном из аспектов изомальтоолигосахаридная композиция произведена способом получения изомальтоолигосахаридной композиции, включающим: (a) взаимодействие крахмальной суспензии с ожижающим ферментом; и (b) взаимодействие продукта (a) с мальтогенным ферментом и инвертазой, где мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие отдельно, последовательно или одновременно.

В одном аспекте пищевая добавка, содержащая изомальтоолигосахариды, получена способом получения изомальтоолигосахаридной композиции, включающим: (a) взаимодействие крахмальной суспензии с ожижающим ферментом; и (b) взаимодействие продукта (a) с мальтогенным ферментом и инвертазой, где мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие отдельно, последовательно или одновременно.

В одном аспекте пищевой продукт, содержащий, по меньшей мере, один пищевой ингредиент, и изомальтоолигосахариды обеспечены способом получения изомальтоолигосахаридной композиции, включающим: (a) взаимодействие крахмальной суспензии с ожижающим ферментом; и (b) взаимодействие продукта (a) с мальтогенным ферментом и инвертазой, где мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие отдельно, последовательно или одновременно.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - таблица, отображающая прерывистые и непрерывные реакции осахаривания.

Фиг. 2 - график, отображающий изменение содержания ИМО во время прерывистых и непрерывных реакций осахаривания.

Подробное описание

В настоящем документе раскрыты способы производства олигосахаридов, в частности ИМО. Дополнительно в настоящем документе раскрыты способы, стадии и реакции промышленного производства ИМО с использованием стадий, которые обеспечивают улучшенный способ выгодной выработки ИМО.

В следующем подробном описании не подразумевается, что показательные варианты осуществления, описанные в подробном описании, фигурах и формуле изобретения, являются ограничивающими. Могут быть использованы другие варианты осуществления без отклонения от характерных черт или выхода за рамки объекта изобретения, представленного здесь. В нижеследующем описании ряд терминов использован в широком значении. Термины, описанные далее, будут более полно понятны на основе всего описания изобретения. Элементы, префиксы и символы могут быть обозначены их принятой в СИ формой.

При использовании терминов в единственном числе значении в настоящем документе подразумевается “один или более”, за исключением случая, когда единичность однозначно указана. Таким образом, например, ссылка на “углевод” включает смесь двух или более углеводов, а также единичный углевод.

В используемом в настоящем документе значении термин “около” будет понят специалистами в данной области и будет различаться в некоторой области в зависимости от контекста, в котором он использован. Если термин используется в неясном для специалистов в данной области значении, исходя из контекста, в котором он используется, то “около” означает плюс или минус 10% конкретной величины.

В используемом в настоящем документе значении термин “углеводы” будет понятен специалистами в данной области, как включающий в себя полигидроксиальдегиды или кетоны и производные этих соединений. Углеводы могут включать соединения, составленные по меньшей мере из одного основного моносахаридного звена. Они могут быть классифицированы на простые углеводы и сложные углеводы. Простые углеводы - это моносахариды и дисахариды. Сложные углеводы - это полисахариды или крупные молекулы, составленные из прямых или разветвленных цепей моносахаридов.

В используемом в настоящем документе значении термин “сироп ожижения” или “ожиженный сироп” относится к углеводному субстрату, например крахмалу, который вступил в реакцию с ожижающим ферментом, таким как, но не ограниченным, α-амилазой. Сироп ожижения произведен посредством реакции ожижения.

В используемом в настоящем документе значении термин “реакция ожижения” относится к ферментативной или химической реакции, которая понижает вязкость и/или увеличивает текучесть одного или нескольких углеводов в смеси.

В используемом в настоящем документе значении термин “трансглюкозидный” или “трансглюкозидазный” относится к ферменту или активности, которая катализирует гидролитические и/или реакции переноса для образования новых α-1,6 связей. Эти ферменты включают, но не ограничиваются, трансглюкозидазами и инвертазами.

В используемом в настоящем документе значении термин “фермент ожижения” или “ожижающий фермент” может означать многие α-амилазы или другие амилазы. Ферменты ожижения воздействуют на вязкость и текучесть крахмала, т.е. флюидизацию крахмала. Характерные ожижающие крахмал ферменты включают в себя α-амилазы.

В используемом в настоящем документе значении термин “мальтогенный фермент” относится к ферменту, который катализирует производство мальтозы из более крупных углеводных полимеров. Мальтогенный фермент может быть одним или несколькими β-амилазами или другими амилазами. В мальтогенной реакции производится мальтоза.

В используемом в настоящем документе значении термин “инвертаза” или “инвертазы” относится к классам ферментов, которые катализируют гидролитические и реакции переноса для образования новых α-1,6 связей. Инвертазы катализируют синтез сахаров посредством переноса моносахаридов реакцией трансгликозилирования. Например, инвертаза, пригодная для способов переноса по настоящему изобретению, обладает трансглюкозидазной активностью, т.е. она катализирует гидролиз сахаридов посредством гидролиза глюкозидных связей. Инвертаза может быть растительной, животной, бактериальной или грибковой инвертазой. В одном варианте осуществления инвертаза является инвертазой вида Aspergillus. В качестве не ограничивающих примеров в некоторых вариантах осуществления инвертазы получены из Aspergillus niger и/или Aspergillus oryza. В используемом в настоящем документе значении термин “инвертаза с трансглюкозидазной активностью” или “инвертаза технологии по настоящему изобретению” относится к инвертазе, которая способна катализировать реакцию осахаривания.

В используемом в настоящем документе значении термин “реакция осахаривания” или “осахаривание” относится к процессу превращения сиропа ожижения в ИМО посредством мальтогенной и трансглюкозидной реакции. Реакции осахаривания, описанные в настоящем документе, могут происходить в одну или несколько стадий, где стадии или реакции происходят отдельно, последовательно или одновременно.

Способы производства ИМО

Настоящая технология содержит улучшенный способ производства ИМО. Улучшенный способ производства ИМО происходит, когда углеводный субстрат подвергается воздействию ожижающего фермента в дополнение к отдельным, последовательным или одновременным реакциям осахаривания для получения ИМО продукта.

В одном аспекте настоящая технология обеспечивает способ получения изомальтоолигосахаридной композиции, включающий стадии: (a) взаимодействие крахмальной суспензии с ожижающим ферментом; и (b) взаимодействие продукта со стадии (a) с мальтогенным ферментом и инвертазой, где мальтогенный фермент и инвертазу вводят во взаимодействие отдельно, последовательно или одновременно для получения изомальтоолигосахаридов.

В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают в себя реакцию первичного осахаривания и реакцию вторичного осахаривания или единовременную реакцию осахаривания. В одном варианте осуществления реакция первичного осахаривания приводит к производству мальтогенного продукта, то есть мальтозы или мальтозного сиропа. Реакция вторичного осахаривания включает в себя применение одного или нескольких ферментов, таких как инвертаза с трансглюкозидной активностью, к мальтогенному продукту, тем самым некоторая часть или весь мальтогенный продукт преобразуется в ИМО. В одном варианте осуществления превращение сырьевого материала, т.е. крахмального сиропа, в мальтозу происходит во время первой реакции осахаривания, т.е. мальтогенной реакции. Производство ИМО происходит во время второй реакции осахаривания, т.е. трансглюкозидной реакции, где во время реакции применяется инвертаза с трансглюкозидной активностью.

Субстраты

В способах по настоящему изобретению используется углеводный субстрат. Как описано в настоящем документе, термин “углевод” или ”углеводный субстрат” относится к, но не ограничен, крахмалу, природному немодифицированному крахмалу, кукурузному крахмалу, пшеничному крахмалу, крахмалу тапиоки, картофельному крахмалу, крахмалу сладкого картофеля, саговому крахмалу, ячменному крахмалу, рисовому крахмалу, обработанному нагреванием/кислотой крахмалу (декстрин), зернистому крахмалу, воскообразному кукурузному крахмалу, сорговому крахмалу, крахмалу с высоким содержанием амилозы, жидкой декстрозе с высоким содержанием твердого компонента и их сочетаний.

В одном варианте осуществления углеводный субстрат является крахмальным субстратом. Крахмальный субстрат может быть, но не ограничен, кукурузным крахмалом. В одном варианте осуществления углеводный субстрат является крахмальной суспензией. Как описано в настоящем изобретении, термин “суспензия” относится к водной смеси, содержащей нерастворимые компоненты, такие как, но не ограничены, крахмальные гранулы. Иногда термины термин “суспензия”, или “сироп”, или “взвесь” используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Как описано в настоящем документе термин “крахмальный субстрат” или “крахмальная суспензия” относится к жидкому раствору в сочетании с крахмалом, где крахмал является любым материалом, составленным из сложных полисахаридных углеводов общей формулой (C₆H₁₀O₅)x, где X может быть любым числом. Жидкость может быть водным растворителем, например водой.

В одном варианте осуществления крахмальная суспензия включает в себя один или несколько видов крахмала. Как описано в патенте США № 7638151 одним из видов форм крахмала является амилоза, полисахарид с линейной цепью. Другие виды крахмала включают амилопектин, полисахарид с разветвленной цепью. Амилоза содержит в себе длинные неразветвленные цепи, в которых все D-глюкозные единицы связаны α-(1,4)-связями, то есть "α-(1,4)-связями" или "1,4-α-D-глюкозильными связями". Амилопектин сильно разветвлен, при этом глюкозидные связи основной цепи являются α-(1,4)-связями, тогда как точки ветвления обеспечены α-(1,6)-связями. В используемом в настоящем документе значении термин “связь” или “связи” относится к ряду углеродных групп, к которым присоединена глюкоза или другая молекула.

Префиксы α (альфа) и β (бета) означают, является ли связь соответственно аксиальной или экваториальной по отношению к углеродному кольцу. Таким образом, альфа-связь является экваториальной по отношению к углеродному кольцу, бета-связь - аксиальной.

В одном варианте осуществления количество или концентрация крахмального субстрата, т.е. концентрация крахмальной суспензии, может быть водной суспензией, имеющей концентрацию в пределах 1-60%, 5-45%, 10-40%, 20-40% или 25-35% нерастворимых твердых веществ (“тв”). Как описано в настоящем документе, термин “нерастворимые твердые вещества” или “тв” относится к процентному содержанию твердого вещества, т.е., крахмалу, которое суспендировано в растворе. В одном варианте осуществления pH суспензии находится в пределах 1,0-9,0, 2,0-8,0, 3,0-7,5, 4,0-6,5 или 4,5-6,0. В другом варианте осуществления pH суспензии находится в пределе 5,8-6,1. В одном аспекте настоящая технология обеспечивает концентрацию или плотность крахмальной суспензии в пределах 5-25, 10-25, 15-23 или 18-22°Be. В одном варианте осуществления плотность суспензии находится в пределах 19-22°Be. В используемом в настоящем документе значении “°Be” или "Боме" плотность измеряется как функция определенной силы тяжести крахмального сиропа при определенной температуре.

Реакция ожижения

В одном варианте осуществления крахмальный сироп вводится во взаимодействие с ожижающим ферментом, тем самым получая сироп ожижения. В одном варианте осуществления ожижение может включать в себя ферментативный гидролиз основных компонентов крахмала. В одном варианте осуществления амилоза может быть гидролизована α-амилазами, например α-(1,4)-глюкан-4- глюканогидролазой. α-амилазы гидролизируют α-(1,4)-связи с продуктом в виде смеси глюкозы, мальтозы, мальтотриозы и высших сахаров. См., например, патент США № 4113509. Амилоза может также быть гидролизована β-амилазой. β-амилазы последовательно расщепляют мальтозные звенья, начиная с невосстанавливающего конца для количественного выхода мальтозы. α и β-амилазы также гидролизируют амилопектин. Ни α, ни β-амилазы не могут гидролизовать α-(1,6)-связи и точках ветвления амилопектина. Конечным продуктом исчерпывающего воздействия β-амилазы на амилопектин является крупный, высокоразветвленный или β-ограниченный декстрин. Деветвящий фермент, например пуллуланаза, α-(1,6)-глюкан-6-глюкангидролаза или α-(1,6)-глюкозидаза, может гидролизовать α-(1,6)-связи в точках ветвления. В используемом в настоящем документе значении термин “деветвящий фермент” относится к ферментам, которые катализируют гидролиз α-(1,6)-связей. Показательным деветвящим ферментом является пуллуланаза, также известная как α-декстрин-эндо-(1,6)-α-глюкозидаза, ограничивающая декстриназа, деветвящий фермент или (1,6)-глюканогидролаза, см., например, Schülein и др., Characterization of a New Class of Thermophilic Pullulanases from Bacillus acidopullulyticus, Annals of the New York Academy of Sciences, том 434, выпуск 1, стр. 271-74 (2006).

В одном аспекте ожижающий фермент является ферментом, полученным, выделенным или экстрагированным из бактериального, грибкового, растительного или другого источника. В одном варианте осуществления бактериальным источником является α-амилаза вида Bacillus. В одном варианте осуществления α-амилаза получена из вида Bacillus, включая полученные из, по меньшей мере, одного бактериального источника, выбранного из B. subtilis, B. licheniformis, B. stearothemophilus, B. coagulans, B. Amyloliquefaciens и B. lentus. В одном варианте осуществления ожижающим ферментом является α-амилаза из B. licheniformis или B. Stearothermophilus. В другом варианте осуществления в качестве ожижающего фермента используются амилазы, отличные от α-амилазы. В одном варианте осуществления рассматриваются амилазы, характеризуемые повышенной окислительной или термостабильностью, включая мутанты, генетически модифицированные амилазы или варианты амилаз, описанные в патенте США № 5763385, 5824532, 5958739, и 6008026. В одном варианте осуществления ожижающим ферментом является устойчивая к нагреванию α-амилаза.

В одном варианте осуществления ожижающий фермент вводится во взаимодействие с крахмальной суспензией для понижения вязкости ожиженного или солюбилизированного крахмала. Нерастворимые компоненты крахмала преобразуются в растворимые материалы посредством декстринизации. В используемом в настоящем документе значении термин “декстринизация” относится к преобразованию крахмала в растворимые полисахариды или олигосахариды. В одном варианте осуществления один или несколько ожижающих ферментов могут быть добавлены к суспензии вручную или автоматически, в количествах 0,0001-10%, 0,001-5% или 0,01-1% (массовая доля тв). В одном варианте осуществления ожижающий фермент может быть добавлен к суспензии в количествах 0,40-0,70%, 0,50-0,60% или 0,55% (массовая доля тв). В одном варианте осуществления ожижающий фермент может быть добавлен к суспензии в количестве 0,55% (массовая доля тв).

В одном варианте осуществления концентрации фермента для ожижения находятся в пределах 0,0001-10%, 0,001-5% или 0,005-1% (массовая доля тв) ожижающего фермента к тв крахмальной суспензии. В одном варианте осуществления концентрации фермента для ожижения находятся в пределах 0,015-0,035% или 0,022-0,025% (массовая доля тв) ожижающего фермента к тв крахмальной суспензии. В другом варианте осуществления применяются концентрации фермента для ожижения в пределах 0,04-0,07%, 0,05-0,06% или 0,04-0,05% (массовая доля тв). В одном варианте осуществления концентрация фермента для ожижения составляет 0,045% (массовая доля тв) ожижающего фермента к тв крахмальной суспензии.

В одном варианте осуществления ожижающий фермент взаимодействует с крахмальной суспензией в течение 15-210 минут (“мин”), 60-210 мин, 90-180 мин или 120-150 мин, при подходящей температуре. В одном варианте осуществления ожижающий фермент взаимодействует с крахмальной суспензией в течение 130 мин при подходящей температуре. Ожижающий фермент может быть добавлен к суспензии вручную или автоматически при температурах между 90-125°C, 95-115°C, 100-110°C или 100-108°C. В одном варианте осуществления pH реакции ожижения поддерживается в пределах 4,0-8,0, 5,0-7,0 или 5,8-6,1. Специалист в данной области должен сознавать, что pH реакции ожижения, при необходимости, может поддерживаться посредством использования и применения подходящих количеств кислоты и основания, например, хлористоводородной кислоты ("HCl") или гидроксида натрия ("NaOH"). В одном варианте осуществления ожиженный сироп, содержащий предшественники ИМО, произведен реакцией ожижения.

Мальтогенная реакция

В одном варианте осуществления крахмальный сироп вводится во взаимодействие с ожижающим ферментом и затем мальтогенным ферментом, тем самым продуцируя мальтозу. В одном варианте осуществления крахмальный сироп вводится во взаимодействие с ожижающим ферментом, содержащим мальтогенные ферментативные функции, тем самым продуцируя ожиженный сироп, содержащий мальтозу. В используемом в настоящем документе значении термин “мальтогенный фермент” относится к ферменту, преобразующему углеводы в мальтозу и производные таковой. Показательные мальтогенные ферменты включают, но не ограничены, полученными из грибков, бактерий и растений α-амилазами и β-амилазами. Термин “мальтоза” в используемом в настоящем документе значении относится к дисахариду, имеющему два глюкозильных остатка, связанных α-(1,4)-D-глюкозидной связью. В одном варианте осуществления мальтоза получена из обогащенной мальтозой суспензии или сиропа, т.е., ожиженного сиропа.

В некоторых вариантах осуществления реакции осахаривания включают в себя гидролиз ожиженных углеводных субстратов, т.е., сиропа ожижения. Реакции осахаривания включают мальтогенную реакцию и трансглюкозидную реакцию, где реакции могут протекать отдельно, последовательно или одновременно. Реакции осахаривания обычно выполняются добавлением одного или нескольких ферментов осахаривания к сиропу ожижения. В одном варианте осуществления один или несколько ферментов, выбранных из группы β-амилазы, трансглюкозидазы, инвертазы, пуллуланазы и их комбинаций, взаимодействуют с ожиженным сиропом для получения ИМО или предшественников ИМО. В используемом в настоящем документе значении термин “предшественники ИМО” относится к композиции, содержащей любой составной компонент ИМО, который требуется для образования ИМО. В одном варианте осуществления предшественником ИМО является мальтоза или производные таковой.

В некоторых вариантах осуществления гидролиз ожиженного сиропа проводится в присутствии мальтогенного фермента. В одном варианте осуществления мальтогенным ферментом является β-амилаза. Наряду с тем, что некоторые α-амилазы являются мальтогенными настолько, что взаимодействие α-амилазы с крахмальным субстратом может производить мальтозу, использование β-амилаз обладает тем преимуществом, что их взаимодействие с различными крахмалами обеспечивает повышенное количество предшественников ИМО, т.е. мальтозы с исключением других сахаридов, таких как глюкоза, см., например, патенты США № 4970158 и 4647538. В одном варианте осуществления β-амилаза является растительным, микробным ферментом или термостабильной бактериальной β-амилазой. Специалистам в данной области должно быть без труда понятно, что подходящая β-амилаза может быть природной, так же как и рекомбинатной и мутантной β-амилазой. В используемом в настоящем документе значении термин “β-амилаза” относится к ферментам, которые катализируют гидролиз α-(l,4)-глюкозидных связей в полисахаридах для отщепления последующих мальтозных звеньев с невосстанавливающего конца сахаридных цепей, см., например, патент США № 7638151.

В одном варианте осуществления мальтогенная реакция проводится, по меньшей мере, 12, 20, 72 или 120 часов ("ч"). В одном варианте осуществления мальтогенная реакция выполняется при температурах, изменяющихся в пределах от 40°C, 50°C, 55°C, 60°C и 65°C до 90°C. В одном варианте осуществления мальтогенная реакция происходит при температуре в пределах 60-65°C. В одном варианте осуществления мальтогенная реакция происходит при кислотном pH между 4,0-, 5,0-, 5,5-, 6,0- и 7,0. В одном варианте осуществления pH мальтогенной реакции находится в пределах 5,0-5,5. Специалист в данной области должен осознавать, что pH мальтогенной реакции, при необходимости, может поддерживаться посредством использования подходящих количеств кислоты или основания, например, хлористоводородной кислоты ("HCl") или гидроксида натрия ("NaOH").

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают в себя подходящее количество мальтогенного фермента, применяемого в течение мальтогенной реакции, в зависимости от количества растворенной мальтозы, присутствующей в сиропе ожижения. С этой целью после ожижения углевода, т.е. крахмала, определяется содержание растворенной мальтозы в сиропе ожижения и применяется подходящее количество мальтогенного фермента для мальтогенной реакции. Количество мальтогенного фермента изменяется в пределах от 0,0001-10% (массовая доля), или от 0,0005-1% (массовая доля), или от 0,001% до 0,25% (массовая доля) в зависимости от особенностей мальтогенного фермента, который должен быть добавлен и общего веса сиропа ожижения, т.е. содержания твердых веществ в сиропе.

В одном варианте осуществления во время мальтогенной реакции применяется 0,0001-10% (массовая доля) пуллуланазы для реакции осахаривания. В одном варианте осуществления во время мальтогенной реакции применяется 0,001-1% (массовая доля) пуллуланазы для реакции осахаривания. В другом варианте осуществления во время мальтогенной реакции применяется 0,05-0,1% (массовая доля) пуллуланазы для реакции осахаривания.

В одном варианте осуществления мальтогенный фермент и/или пуллуланаза могут быть добавлены в реакцию первичного осахаривания или мальтогенную реакцию в концентрации 0,001-1% (массовая доля) при относительной плотности по Бриксу между 35-40°Bx. Как описано в настоящем документе термин “относительная плотность по Бриксу”, “Брикс” или "°Bx", относится к широко известной шкале ареометра для измерения содержания сахара в растворе при заданной температуре. Таким образом, единица измерения °Bx относится к измерению солюбилизированных сахаров в растворе. Шкала Брикса измеряет количество грамм сахарной составляющей на 100 грамм водного раствора сахара (общее содержание твердого солюбилизированного вещества). Например, измерение 1,0°Bx относится к 10 мг/мл сахара в растворе. В одном варианте осуществления между 0,01-0,1% (массовая доля) мальтогенного фермента и/или пуллуланазы применяется к 35-40°Bx первичной реакции осахаривания или мальтогенной реакции. В одном варианте осуществления β-амилаза является мальтогенным ферментом, применяемым в первичной реакции осахаривания. В одном варианте осуществления как β-амилаза, так и пуллуланаза применяются в первичной реакции осахаривания.

В одном варианте осуществления β-амилаза применяется к 35-40°Bx первичной реакции осахаривания или мальтогенной реакции в присутствии или отсутствии пуллуланазы, в концентрации между 0,005-5%, 0,01-1% или 0,02-0,05% (массовая доля). В другом варианте осуществления пуллуланаза применяется к 35-40 °Bx первичной реакции осахаривания или мальтогенной реакции в концентрации между 0,005-5%, 0,01-1% или 0,02-0,05% (массовая доля). В одном варианте осуществления пуллуланаза применяется к 35-40°Bx первичной реакции осахаривания или мальтогенной реакции в концентрации 0,025% (массовая доля).

В некоторых вариантах осуществления мальтогенная реакция продолжается в течение 10-100 часов ("ч"). В одном варианте осуществления мальтогенная реакция продолжается в течение 15-30 ч. В одном варианте осуществления мальтогенная реакция продолжается в течение 20-24 ч. В одном варианте осуществления мальтогенная реакция происходит при температуре между 50-70°C. В другом варианте осуществления мальтогенная реакция происходит при щелочном pH. В одном варианте осуществления pH мальтогенной реакции находится в пределах между 4,0-7,0. В одном варианте осуществления мальтогенная реакция происходит при pH между 5,5-5,8. Специалисты в данной области должны сознавать, что pH мальтогенной реакции, при необходимости, может поддерживаться посредством использования и применения подходящих количеств кислоты и основания, например, хлористоводородной кислоты ("HCl") или гидроксида натрия ("NaOH").

Трансглюкозидная реакция

Перенос глюкозных звеньев и их производных может происходить в присутствии трансглюкозидного фермента. Мальтогенная реакция и трансглюкозидная реакция могут происходить отдельно, последовательно или одновременно в зависимости от ферментов осахаривания, которые применяются в конкретной реакции. В одном варианте осуществления одновременная реакция осахаривания происходит в присутствии инвертазы. В одном варианте осуществления одновременная реакция осахаривания включает в себя мальтогенную реакцию и трансглюкозидную реакцию. Например, трансглюкозидная реакция может происходить вместе с мальтогенной реакцией, тем самым приводя к одновременной реакции осахаривания. В используемом в настоящем документе значении “одновременная реакция осахаривания” относится к реакции первичного осахаривания и реакции вторичного осахаривания, которые происходят близко во времени и пространстве. В одновременной реакции осахаривания продукт реакции первичного осахаривания непосредственно доступен для использования в качестве субстрата в реакции вторичного осахаривания. В одном варианте осуществления одновременная реакция осахаривания происходит в присутствии мальтогенного фермента и инвертазы, обладающей трансглюкозидной активностью. Другой аспект настоящей технологии раскрывает инвертазу, которая реагирует с мальтогенным субстратом. В одном варианте осуществления инвертаза с трансглюкозидной активностью реагирует с мальтогенным субстратом.

В одном варианте осуществления трансглюкозидная реакция проводится последовательно посредством добавления одного или более ферментов осахаривания к продукту мальтогенной реакции. В одном варианте осуществления один или несколько ферментов выбраны из группы: β-амилаза, трансглюкозидаза, инвертаза, пуллуланаза и их сочетания, и вводятся во взаимодействие с сиропом ожижения или продуктом мальтогенной реакции для получения ИМО в ходе трансглюкозидной реакции. В одном варианте осуществления инвертаза является трансглюкозидным ферментом, взаимодействующим с сиропом ожижения для получения ИМО в ходе трансглюкозидной реакции. В другом варианте осуществления инвертаза вида Aspergillus является трансглюкозидным ферментом, взаимодействующим с сиропом ожижения для получения ИМО в ходе трансглюкозидной реакции.

В другом варианте осуществления трансглюкозидная реакция катализируются двумя или несколькими ферментами. Например, в реакции осахаривания может быть использовано сочетание инвертазы с трансглюкозидазной активностью и трансглюкозидазы ("ТГ"). В одном варианте осуществления трансглюкозидным ферментом является ТГ вида Aspergillus. В одном варианте осуществления трансглюкозидным ферментом является ТГ Aspergillus niger. Несмотря на то, что ТГ, ранее описанная в настоящем документе, может выполнять функцию трансглюкозидазы, использование инвертазы может быть предпочтительно потому, что ее взаимодействие с различными основанными на крахмале и мальтозе субстратами обеспечивает повышенную выработку ИМО по сравнению с традиционными методами использования ТГ.

В одном варианте осуществления трансглюкозидная реакция, т.е., реакция вторичного осахаривания, проводится в течение 10-100 ч. В одном варианте осуществления реакция вторичного осахаривания происходит в течение 30-90 ч. В одном варианте осуществления реакция вторичного осахаривания происходит в течение 48-72 ч. В одном варианте осуществления реакция вторичного осахаривания нагревается в течение 10-100 ч, 30-90 ч или 48-72 ч при температуре в пределах 50-70°C. В другом варианте осуществления реакция вторичного осахаривания нагревается в течение 10-100 ч, 30-90 ч или 48-72 ч при температуре в пределах 55-65°C. В одном варианте осуществления реакция вторичного осахаривания происходит при температуре 60-65°C. В одном варианте осуществления реакция происходит при pH в пределах 4,0-, 5,0-, 5,5-, 6,0- и 7,0. В одном варианте осуществления pH реакции вторичного осахаривания находится в пределах 5,0-5,5. Специалист в данной области должен сознавать, что pH реакции вторичного осахаривания, при необходимости, может поддерживаться посредством использования и применения подходящих количеств кислоты и основания, например, хлористоводородной кислоты ("HCl") или гидроксида натрия ("NaOH").

В некоторых вариантах осуществления подходящее количество инвертазы применяется к одновременной реакции осахаривания в зависимости от количества субстрата в ожиженном сиропе. При этом после ожижения углевода, т.е. крахмала, может быть определено содержание растворенной мальтозы в сиропе и применено подходящее количество фермента для одновременной реакции осахаривания. Количество фермента будет изменяться в зависимости от общего веса сиропа ожижения, т.е. содержания сухого твердого вещества. В добавление к применению инвертазы также применяются один или несколько мальтогенных ферментов для одновременной реакции осахаривания.

В одном варианте осуществления применяется 0,0001-10% (массовая доля) инвертазы в качестве фермента осахаривания для реакции осахаривания. В одном варианте осуществления применяется между 0,001-5% (массовая доля) инвертазы в качестве фермента осахаривания для реакции осахаривания. В одном варианте осуществления применяется 0,01-1% (массовая доля) инвертазы для реакции осахаривания. В одном варианте осуществления применяется между 0,05-0,5% (массовая доля) инвертазы для реакции осахаривания. В другом варианте осуществления применяется 0,16% (массовая доля) инвертазы для реакции осахаривания.

Ферменты для осахаривания могут вноситься в одновременную реакцию осахаривания вручную или автоматически, как отдельно, так и в сочетаниях, в описанных ранее концентрациях, где плотность по Бриксу сиропа ожижения находится в пределах 35-40°Bx. В одном варианте осуществления плотность по Бриксу ожиженного сиропа составляет 36°Bx. В одном аспекте реакция осахаривания преобразует некоторое количество или весь мальтогенный продукт в ИМО.

Очистка ИМО и их применение

В некоторых вариантах осуществления способы настоящего изобретения включают стадию удаления посторонних веществ из ИМО реакций. Посторонние вещества включают, но не ограничиваются, непрореагировавшие исходные вещества и денатурированные белки, углеводы и крахмал. В некоторых вариантах осуществления очистка включает, но не ограничивается, фильтрацию, осаждение и коагуляцию, включая вариации и их сочетания. В одном варианте осуществления ИМО сироп фильтруется с использованием фильтрующего устройства. Фильтрующие устройства, которые оказывают давление и содействуют фильтрации, включают: барабанные фильтры, барабанные вращающиеся фильтры, перлитный, целитный фил