Идентификация, оценка и лечение раковых заболеваний с генетической или приобретенной устойчивостью к ингибиторам alk

Идентификация, оценка и лечение раковых заболеваний с генетической или приобретенной устойчивостью к ингибиторам alk

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Тирозинкиназы - класс ферментов, катализирующих фосфорилирование остатков тирозина в белковых субстратах путем переноса концевой фосфатной группы с аденозинтрифосфата. Во многих случаях тирозинкиназы играют центральную роль в передаче сигнала для целого ряда функций клетки, включая пролиферацию клеток, канцерогенез и дифференцировку клеток.

EML4-ALK - гибридный белок с протеинтирозинкиназной активностью, который присутствует в ≈ 5% случаев немелкоклеточного рака легких (НМКРЛ) и образуется в результате малой инверсии в коротком плече 2-ой хромосомы человека (Soda, М. et al. (2007) Nature 448:561-566; Mano, H. (2008) Cancer Sci. 99:2349-2355). EML4-ALK подвергается конститутивной димеризации в результате взаимодействия между суперспирализованным доменом в участке EML4 каждого мономера, и вследствие этого приобретает выраженную онкогенную активность. У трансгенных мышей, которые экспрессируют EML4-ALK, в частности в клетках эпителия легких, образуются сотни аденокарциномных узелков в обоих легких вскоре после рождения, а пероральное введение специфического ингибитора тирозинкиназной активности ALK приводит к исчезновению таких узелков в легких (Soda, М. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:19893-19897). Перечисленные результаты указывают на важную роль EML4-ALK в канцерогенезе НМКРЛ, ассоциированного с этой гибридной киназой, и они дают дополнительное подтверждение применимости нацеленной на молекулы терапии ингибиторами ALK при данном раковом заболевании. Например, в настоящее время проводятся клинические исследования ингибитора тирозинкиназной активности ALK и MET - PF-02341066 в лечении EML4-ALK-положительного НМКРЛ, и промежуточные результаты указанных исследований являются многообещающими (Kwak, E.L. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27(suppl):15s (abstract 3509)). Однако подгруппа EML4-ALK-положительных опухолей не реагирует на указанный ингибитор, и молекулярная природа такого неуспеха лечения не известна.

Было показано, что наряду с PF-02341066 у пациентов с раком выраженной терапевтической активностью обладают и другие ингибиторы тирозинкиназ (ИТК). Например, иматиниб мезилат - ИТК, действующий на ABL1 и KIT, значительно улучшает исход заболевания у людей с хронической миелоидной лейкемией, положительной по гибридной киназе BCR-ABL1 или со стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта, положительными по KIT (Druker, B.J. et al. (2001) N. Engl. J. Med. 344:1031-1037; Heinrich, M.C. et al. (2008) J. din. Oncol. 26:5360-5367). Далее, гефитиниб и элотиниб, которе оба являются ИТК, действующими на рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), эффективны при лечении НМРКЛ, ассоциированного с активацией EGFR (Mok, T.S. et al. (2009) J. Clin. Oncol. 27:5080-2087; Mok, T.S. et al. (2009) N. Engl. J. Med. 361:947-957). К сожалению, существует подгруппа целевых опухолей, либо устойчивыз к соответствующим ИТК с начала лечения, либо приобритающих устойчивость к ним после первоначального ответа. В некоторых случаях неуспешного лечения были выявлены вторичные мутации в киназах-мишенях, которые напрямую или аллостерически влияют на форму АТФ-связывающего кармана, приводя к блокировке связывания ИТК (Deininger, М. et al. (2005) Blood 105:2640-2653; Kobayashi, S. et al. (2005) N. Engl. J. Med 352:786-792; Pao, W. et al. (2005) PLoS Med. 2:e73; Shah, N.P. et al. (2002) Cancer Cell 2:117-125). Соответственно, существует выраженая необходимость в идентификации мутаций, обуславливающих устойчивость тирозинкиназ, таких как EML4-ALK, с целью более успешной разработки композиций, наборов и способов идентификации, оценки, предупреждения и лечения нарушений, связанных с их аберрантной экспрессией и/или активностью.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены по меньшей мере композиция, способы и наборы для идентификации, оценки и лечения рака на основе идентификации новых мутаций в киназе анапластической лимфомы (ALK), придающих устойчивость к известным ингибиторам ALK. Такие мутации в ALK также имеют клиническую значимость для идентификации фармацевтических композиций, которые способны подходить по конфигурации анормальному АТФ-связывающему карману, формирующемуся вследствие новых мутаций в ALK, и ингибировать активность ALK.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ идентификации субъекта, страдающего раковым заболеванием или имеющего риск развития ракового заболевания, имеющего овышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK, включающий отбор пробы у пациента и анализа указанной пробы на присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, причем присутствие одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK указывает на то, что указанный субъект имеет повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ выявления у субъекта рака или риска развития ракового заболевания, обладающего повышенным риском нечувствительности к лечению ингибитором ALK, включающий отбор пробы у пациента и анализа указанной пробы, при котором определяют уровень экспрессии, структуру и/или активность одного или более полипептидов мутантных ALK, причем присутствие одного или более полипептидов мутантных ALK указывает на то, что указанный субъект имеет повышенный риск нечувствительности к лечению ингибитором ALK.

Согласно некоторым вариантам реализации любого из аспектов настоящего изобретения указанный субъект ранее не подвергался лечению ингибитором ALK, или подвергался ранее лечению ингибитором ALK, и у него развилась по меньшей мере частичная устойчивость к ингибитору ALK (например, PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-a]пиррол[3,4-с]карбазол-8-ил[4-(диметиламино)бензил]карбамат, (1S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1Н-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2,2,1]гепт-5-ен-2-карбоксамид и NVP-TAE684). Согласно другим вариантам реализации указанное раковое заболевание выбирают из группы, состоящей из анапластической крупноклеточной лимфомы, нейробластомы, рака молочной железы, рака прямой и ободочной кишки, воспалительных миофибробластных опухолей и немелкоклеточного рака легких. Согласно другим вариантам реализации указанную пробу отбирают из группы, состоящей из мокроты, бронхоальвеолярного смыва, плеврального выпота, ткани, цельной крови, сыворотки, плазмы, соскоба слизистой щеки, слюны, спинномозговой жидкости, мочи, кала, циркулирующих клеток опухоли, циркулирующих нуклеиновых кислот и костного мозга. Согласно еще одному варианту реализации указанная проба включает клетки или ткани. Согласно некоторым вариантам реализации молекулы полинуклеотидов или одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из молекул полинуклеотидов мутантных ALK или полипептидов мутантных ALK, приведенных в таблице 1. Согласно другим вариантам реализации одну или более мутаций в ALK оценивают путем теста на гибридизацию нуклеиновых кислот. Согласно другим вариантам реализации одну или более мутаций в ALK оценивают посредством полимеразной цепной реакции. Согласно другим вариантам реализации уровень экспрессии полипептидов одной или более ALK определяют с использованием реагента, который специфически связывается с полипептидами одной или более ALK (например, антитело, производное антитела и фрагмент антитела). Согласно другим вариантам реализации количество, структуру и/или активность одного или более полипептидов мутантных ALK сравнивают с контрольным образцом. Согласно некоторым другим вариантам реализации мутации в одной или более ALK оценивают в первый момент времени и по меньшей мере в один последующий момент времени. Согласно другим вариантам реализации указанная проба содержит эмбриональную или соматическую геномную ДНК.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения пациента, страдающего раковым заболеванием, или с риском развития ракового заболевания, включающий отбор пробы у указанного пациента, анализа указанной пробы с целью выявления присутствия одной или более молекул полинуклеотидов мутантных ALK, как указано в Таблице 1, и введения указанному пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора ALK. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ингибитор ALK выбирают из группы, состоящей из PF-02341066, PDD, 2-метил-11-(2-метилпропил)-4-оксо-4,5,6,11,12,13-гексагидро-2H-индазол[5,4-а]пиррол[3,4-с]карбазол-8-ил [4-(диметиламино)бензил]карбамата, (1 S,2S,3R,4R)-3-({5-хлор-2-[(1-этил-2,3,4,5-тетрагидро-6-метокси-2-оксо-1H-1-бензазепин-7-ил)амино]-4-пиримидинил}амино)бицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-карбоксамида и NVP-TAE684. Согласно другим вариантам реализации указанный субъект ранее не подвергался лечению ингибитором ALK, или ранее подвергался лечению ингибитором ALK, и у него развилась по меньшей мере частичная устойчивость к указанному ингибитору ALK.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен набор для определения хемочувствительности пациента с раковым заболеванием к лечению ингибитором ALK, включающий: реагент, который специфически связывается с молекулами полинуклеотидов или полипептидами одной или более мутантных ALK; и инструкцию по применению. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор включает дополнительно ингибитор ALK. Согласно другим вариантам реализации указанный реагент включает один или более полинуклеотидных зондов, каждый из которых содержит полинуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности нуклеотида, представленной в Таблице 1, или комплементарную последовательности нуклеотида, кодирующего полипептид, представленный в Таблице 1 (например, олигонуклеотиды, молекулы кДНК, молекулы РНК и синтетические генные зонды, содержащие нуклеотидные основания). Согласно некоторым другим вариантам реализации указанные зонды включают полинуклеотиды длиной от 50 до 10⁷ нуклеотидов. Согласно другим вариантам реализации указанный реагент включает антитело и производное антитела, и фрагмент антитела к полипептиду, кодируемому одной или более последовательностями полинуклеотидов, приведенными в Таблице 1.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ определения того, модулирует ли исследуемое соединение активность одного или более полипептидов мутантных ALK, включающий осуществление контакта клеток млекопитающих, трансфецированных конструкцией, кодирующей один или более полипептидов мутантных ALK, с тестируемым соединением и оценку активности одного или более полипептидов мутантных ALK в указанных клетках млекопитающих, причем в случае значительной модуляции активности в присутствии тестируемого соединения по сравнению с контрольным экспериментом тестируемое соединение идентифицируют как модулятор одного или более полипептидов мутантных ALK. Согласно некоторым вариантам реализации молекулы полинуклеотидов или одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из молекул полинуклеотидов или полипептидов мутантных ALK, приведенных в таблице 1. Согласно другому варианту реализации указанный контроль включает клетки млекопитающего, экспрессирующие полипептид ALK дикого типа, выбранный из группы, состоящей из полипептидов, приведенных в Таблице 1. Согласно некоторым другим вариантам реализации активность одного или более полипептидов мутантных ALK выбирают из группы, состоящей из связывания АТФ, тирозинкиназной активности, пролиферации раковых клеток, роста опухоли, количества опухолей, апоптоза и метастазирования опухоли. Согласно некоторым другим вариантам реализации указанный контрольный эксперимент включает клетки млекопитающего, экспрессирующие один или более полипептидов мутантных ALK в отсутствие исследуемого соединения, причем экспрессию пределяют, например, по активности одного или более полипептидов мутантных ALK (например, связывание АТФ, тирозинкиназную активность, пролиферацию раковых клеток, рост опухоли, количество опухолей, апоптоз и метастазирование опухоли).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 показаны новые мутации в ALK согласно настоящему изобретению, ассоциированные с устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназ ALK. На Фигуре 1 представлено схематическое изображение белка EML4-ALK. Указаны положения двух мутаций de novo в киназном домене, положения для праймеров ПЦР для амплификации киназного домена или гибридной ДНК показаны закрашенными и незакрашенными стрелками выше, соответственно. На Фигуре 1 показаны результаты глубокого секвенирования кДНК киназного домена в ALK. Продукты ПЦР длиной ~1000 п.о. из линии клеток НМКРЛ Н2228 или из образца с идентификационными номерами J-#1, J-#12, J-#113, J-#127 или LK-#33 секвенировали с использованием системы GAII. Значения, указывающие общее количество считываний (Total) и некомплементарных считываний (Mismatch), показаны в каждом положении киназного домена кДНК синими и красными ромбами, соответственно. На вкладках в увеличенном масштабе показана 5'-область кДНК для J-#1 и J-#113 (обозначены зелеными прямоугольниками). На Фигуре 1 показаны электрофореграммы для клонов кДНК ALK, окружающих положения G4374 и С4493. ПЦР проводили с кДНК, приготовленными из мокроты, полученной перед лечением (начальное состояние), и из клеток плеврального выпота, полученных после рецидива (Рецидив). Замененные нуклеотиды А показаны красным.

На Фигуре 2 показаны геномные последовательности, окружающие положения, соответствующие G4374 и С4493 в кДНК ALK. Геномную ДНК, выделенную из клеток в плевральном выпоте пациента, подвергали 35 циклам ПЦР при 94°С в течение 15 с, при 60°С в течение 30 с и при 68°C в течение 2 мин, с применением ДНК-полимеразы Taq с платиной («Invitrogen», Карлсбад, Калифорния) и следующих праймеров (5'-GGTAAGAAGTGGCTCACTCTTGAG-3' и 5'-CACAACAACTGCAGCAAAGACTGG-3'), и продукты лигировали в плазмиду pT7Blue-2 («Takara Bio»), Вставки плазмид затем секвенировали на устройстве Genetic Analyzer 3130×1, в результате чего были идентифицированы клоны ПЦР, содержащие изменения в G4374A (левая панель) или С4493А (правая панель). Замененные нуклеотиды А показаны красным.

На Фигуре 3 показаны результаты обработки клеток BA/F3 ингибитором PF-02341066. Клетки BA/F3, экспрессирующие EML4-ALK (дикого типа), EML4-ALK(C1156Y), EML4-ALK(L1196M) или двойной мутантный EML4-ALK(C1156Y/L1196M), инкубировали в присутствии указанных концентраций PF-02341066 в течение 48 ч, после чего оценивали морфологию клеток при помощи фазово-контрастной микроскопии. Масштабная метка 20 мкм.

На Фигуре 4 показаны свойства новых мутаций ALK согласно настоящему изобретению, ассоциированные с устойчивостью к ингибиторам тирозинкиназы ALK. На Фигуре 4А указано число клеток BA/F3, экспрессирующих EML4-ALK (дикого типа), EML4-ALK(C1156Y), EML4-ALK(L1196M) или EML4-ALK(C1156Y/L1196M) с двойной мутацией, определенное после инкубации 5×10⁵ клеток в течение 48 ч с указанными концентрациями PF-02341066. Процент жизнеспособных клеток указан относительно числа клеток BA/F3, экспрессирующих EML4-ALK дикого типа. Данные представлены как среднее ± СО (стандартное отклонение) для трех отдельных экспериментов. На Фигуре 4В показано действие PF-02341066 на фосфорилирование тирозина в диком типе или в мутантных формах EML4-ALK. Клетки BA/F3, экспрессирующие EML4-ALK дикого типа или его мутанты с меткой FLAG, подвергали воздействию указанных концентраций PF-02341066 в течение 15 ч, после чего EML4-ALK подвергали иммунопреципитации из лизатов клеток и проводили иммуноблоттинг с антителами, специфичными к Tyr¹⁶⁰⁴-фосфорилированному ALK или к эпитопу FLAG (ALK). В качестве отрицательного контроля исследовали клетки, экспрессировавшие неактивный мутантный EML4-ALK (КМ). На Фигуре 4С показан анализ киназной активности in vitro для EML4-ALK дикого типа или его мутантных вариантов с меткой FLAG, иммунопреципитированных из лизата клеток BA/F3 (не обработанных ингибитором ALK). Указанные иммунопреципитаты инкубировали с [γ-³²Р]АТФ, синтетическим пептидом и указанными концентрациями PF-02341066. Фосфорилирование преципитатов пептидных субстратов оценивали раздельно методом иммуноблоттинга с антителами к FLAG (нижняя панель).

На Фигуре 5 показана модель трехмерной структуры киназного домена ALK. Положения аминокислот в ALK были перенесены на кристаллическую структуру рецептора инсулина со связанным аналогом АТФ ((ID «lir3» в Японской Базе данных структур белков, доступен на международном интернет-сайте pdbj.org/index.html). На правой панели показана структура белка, наблюдаемая с левой стороны модели на левой панели. α-Спирали и β-слои показаны малиновым и оранжевым, соответственно. Также указаны положения спирали аС, Cys¹¹⁵⁶ и Leu¹¹⁹⁶.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, по крайней мере частично, на идентификации определенных областей генома, включая, например, мутации в киназе анапластической лимфомы (ALK), ассоциированные с прогнозированием эффективности лечения рака ингибиторами ALK. В частности, в настоящей заявке были идентифицированы мутации в гене ALK (например, мутации в гене, кодирующем полипептид EML4-ALK), которые могут приводить к образованию полипептидов, по меньшей мере частично устойчивых к терапии ингибиторами ALK. Также согласно настоящему изобретению предложены способы идентификации таких специфических областей в геноме при помощи технологий, известных в технике, включая микрочипы на основе олигонуклеотидов (Brennan, et al. (2004) Cancer Res. 64(14):4744-8; Lucito, et al. (2003) Genome Res. 13:2291-2305; Bignell et al. (2004) Genome Res. 14:287-295; Zhao, et al (2004) Cancer Research, 64(9):3060-71), но не ограничиваясь ими, и другие способы, описанные в настоящей заявке, включая, например, способы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и прямом секвенировании. Также согласно настоящему изобретению предложены диагностические наборы для применения в указанных способах.

Разные аспекты настоящего изобретения описаны более подробно в следующих подразделах.

I. Определения

Формы единственного числа в настоящей заявке относятся к одному или более обозначенным грамматическим объектам. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или более одного элемента.

Термин «измененное количество» или «измененный уровень» маркера относится к повышенному или пониженному числу копий маркера или участка хромосомы, таких как мутации гена ALK и/или продукта гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1), и/или повышенный или пониженный, по сравнению с уровнем экспрессии или числом копий в контрольном образце, уровень экспрессии маркерного гена или генов в образце рака. Термин «измененное количество» маркера также включает повышенный или пониженный уровень белка - маркера в пробе, например, в пробе рака, по сравнению с уровнем белка - маркера в нормальном, контрольном образце.

Термин «измененный уровень экспрессии» мутаций гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) относится к уровню экспрессии или числу копий маркера в тестируемом образце, таком как образец, отобранный у пациента, страдающего раковым заболеванием, которые выше или ниже стандартной ошибки способа анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, и может по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять раз или более превышать уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) в контрольном образце (например, в образце от здорового субъекта, не страдающего ассоциированным заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированного гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) для нескольких контрольных образцов. Измененный уровень экспрессии больше или меньше стандартной ошибки способа анализа, применяемого для оценки экспрессии или числа копий, и может по меньшей мере в два, по меньшей мере в три, по меньшей мере в четыре, по меньшей мере в пять или по меньшей мере в десять раз или более превышать уровень экспрессии или число копий мутированных генов ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) в контрольном образце (например, в образце от здорового субъекта, не страдающего ассоциированным заболеванием), или средний уровень экспрессии или число копий мутированного гена ALK и/или продуктов гена (например, маркеры, указанные в Таблице 1) для нескольких контрольных образцов.

Термин «измененная активность» маркера относится к активности маркера, которая повышена или понижена при заболевании, например, в пробах раковой опухоли, по сравнению с активностью указанного маркера в норме, в контрольной пробе. Измененная активность может быть, например, результатом измененной экспрессии маркера, измененного уровня белка - маркера, измененной структуры маркера или, например, измененного взаимодействия с другими белками, участвующими в том же или другом пути передачи сигнала в качестве маркера.

Термин «измененная структура» маркера относится к наличию мутации или мутаций в гене маркера или в белке - маркере, например, мутаций, которые влияют на экспрессию или активность маркера, по сравнению с нормальным геном или белком дикого типа. Например, мутации включают мутации типа межхромосомных и внутрихромосомных перестроек, замен, делеций и вставок. Мутации могут иметь место в кодирующей или некодирующей области указанного маркера.

Термин «киназа анапластической лимфомы» или «ALK» взаимозаменяемо применяется в настоящей заявке и относится к нативной киназе анапластической лимфомы, а также к определенным ее вариантам и мутантам, полученным из одного источника (например, грызуны, люди и другие млекопитающие). Согласно некоторым вариантам реализации белок ALK соответствует идентификационному номеру NCBI Ref Seq NP_004295. Если не указано иное, данные термины относятся к белку человека. Также аббревиатура «ALK» в настоящей заявке может относиться к гену, кодирующему ALK. Согласно некоторым вариантам реализации последовательность нуклеотидов ALK соответствует идентификационному номеру NCBI Ref Seq NP_004304.3 и номеру доступа в системе GenBank 29029631, причем специалист в данной области техники может без труда идентифицировать в указанной системе значимые последовательности (например, кодирующие, 5'UTR, 3'UTR, инициацию транскрипции, инициацию трансляции, терминацию транскрипции, терминацию трансляции и др. последовательности).

Кроме того, термины «киназа анапластической лимфомы» или «ALK» в настоящей заявке также могут включать гибридные киназы ALK и их варианты, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Такие гибридные киназы ALK и их варианты обладают активностью киназы ALK и могут содержать мутации, описываемые в настоящей заявке, придающие киназе ALK устойчивость к ингибиторам ALK. К репрезентативным примерам можно отнести EML4-ALK Вариант 1 (АВ274 722.1; BAF73611.1), EML4-ALK Вариант 2 (АВ275889.1; BAF73612.1), EML4-ALK Вариант За (АВ374361.1; BAG55003.1), EML4-ALK Вариант 3b (AB374362.1; BAG55004.1), EML4-ALK Вариант 4 (АВ374363.1; BAG75147.1), EML4-ALK Вариант 5а (АВ374364.1; BAG75148.1), EML4-ALK Вариант 5b (AB374365.1; BAG75149.1), EML4-ALK Вариант 6 (АВ462411.1; ВАН57335.1), EML4-ALK Вариант 7 (АВ462412.1; ВАН57336.1), KIF5B-ALK (AB462413.1; ВАН57337.1), NPM-ALK, TPM3-ALK, TFGXL-ALK, TFGL-ALK, TFGS-ALK, ATIC-ALK, CLTC-ALK, MSN-ALK, TPM4-ALK, MYH9-ALK, RANBP2-ALK, AL017-ALK и CARS-ALK (см. например, публикацию Pulford et al., (2004) J. Cell. Physiol. 199:330-358, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию). Кроме того, специалист в данной области технике должен понимать, что варианты киназы ALK могут возникать в зависимости от конкретного события объединения киназы ALK и ее партнера по слиянию (например EML4 может объединять в себе по меньшей мере экзон 2, 6а, 6b, 13, 14 и/или 15, как описано, например в публикации Horn and Рао, (2009) J. Clin. Oncol. 27:4247-4253, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию). Например, репрезентативные последовательности ALK, предложенные в настоящем изобретении, следующие:

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией в кодоне TGC (4373-4375), кодирующей аминокислоту, отличную от цистеина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией в кодоне СТО (4493-4495), кодирующей аминокислоту, отличную от лейцина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией G4374A или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность кДНК дикого типа с мутацией С4493А или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Cysll56Xaa, где Хаа - это аминокислота, отличная от цистеина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Leull96Xaa, где Хаа - это аминокислота, отличная от лейцина, или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Cysll56Tyr или с соответствующей мутацией в его гомологе

Последовательность белка дикого типа с мутацией Leull96Met mutation или с соответствующей мутацией в его гомологе

Термин «мутации ALK» относится к изменениям последовательности нуклеиновой кислоты и/или белка относительно эталонной последовательности киназы анапластической лимфомы. Однако согласно некоторым вариантам реализации термин «мутации ALK» может относиться к специфическим мутациям киназы анапластической лимфомы, являющимся прогностическими в отношении ответа на лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD). Например, мутации аминокислоты цистеина в положении 1156 (С1156) и/или аминокислоты лейцина в положении 1196 (L1196) в белке ALK дикого типа (NP_004295) с их заменой на другую аминокислоту согласно настоящему описанию придает устойчивость к ингибиторам ALK. Согласно одному варианту реализации в положении С1156 находится аминокислота тирозин и/или в положении L1196 находится аминокислота метионин. Также специалисты в данной области техники должны понимать, что положения аминокислот, соответствующие мутациям «С1156» и «L1196» в белке ALK дикого типа, будут иметь номера, отличные от номеров в эталонной последовательности (например, гомологи ALK, гибридные белки ALK и др.), что не должно влиять на их прогностическую ценность в отношении ответа на лечение ингибиторами ALK (например, PF-02341066 и/или PDD). Специалист в данной области техники также должен понимать, что существует установленное и четко определенное соответствие между последовательностью аминокислот в конкретном белке и последовательностью нуклеотидов, которая может кодировать указанный белок, что определяется генетическим кодом (приводится ниже). Аналогично, существует установленное и четко определенное соответствие между последовательностью нуклеотидов в конкретной нуклеиновой кислоте и последовательностью аминокислот, кодируемой указанной нуклеиновой кислотой, что определяется генетическим кодом.

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Аланин(Аlа, A)	GCA, GCC, GCG, GCT
Аргинин(Arg, R)	AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
Аспарагин (Asn, N)	ААС, ААТ
Аспарагиновая кислота(Asp, D)	GAC, GAT
Цистеин(Cys, С)	TGC, TGT
Глутаминовая кислота(Glu, E)	GAA, GAG
Глутамин(Gin, Q)	CAA, CAG
Глицин(Gly, G)	GGA, GGC, GGG, GGT
Гистидин(His, Н)	САС, CAT
Изолейцин(Ilе, I)	АТА, АТС, АТТ
Лейцин(Leu, L)	СТА, СТС, CTG, CTT, ТТА, TTG
Лизин(Lys, К)	ААА, AAG
Метионин(Met, М)	ATG
Фенилаланин(Phe, F)	ТТС, ТТТ
Пролин(Pro, Р)	ССА, ССС, CCG, ССТ
Серин(Ser, S)	AGC, AGT, ТСА, ТСС, TCG, ТСТ
Треонин (Thr, Т)	АСА, АСС, ACG, ACT
Триптофан (Trp, W)	TGG
Тирозин (Tyr, Y)	ТАС, ТАТ
Валин (Val, V)	GTA, GTC, GTG, GTT
Сигнал терминации (стоп-кодон)	ТАА, TAG, TGA

Важным и хорошо известным свойством генетического кода является его избыточность, что значит, что для большинства аминокислот, применяемых при построении белков, может применяться более одного триплета (например, как проиллюстрировано выше). Следовательно, несколько разных последовательностей нуклеотидов может кодировать конкретную последовательность аминокислот. Такие последовательности нуклеотидов считаются функционально эквивалентными, поскольку они приводят к образованию одной и той же последовательности аминокислот во всех организмах (хотя определенные организмы могут транслировать некоторые последовательности более эффективно, чем другие). Кроме того, иногда в конкретной последовательности нуклеотидов может находиться метилированный вариант пурина или пиримидина. Такое метилирование не влияет на взаимосвязь кодирования между кодоном из трех нуклеотидов и соответствующей аминокислотой. Кроме того, специалист в данной области техники также должен понимать на основании соответствующей таблицы кодонов, как мутировать нуклеотиды в специфическом кодоне, чтобы специфически изменить кодируемую аминокислоту. Например, кодон для Cys-1156 - «TGC», а кодон для Tyr может быть «ТАТ» или «ТАС». Таким образом, замена одного нуклеотида с G на А во 2-ом положении указанного кодона приведет к кодированию тирозина вместо цистеина. Специалист в данной области техники может провести аналогичные манипуляции и разработать другие мутации.

Термин «связывающее соединение» должен относиться к связывающей композиции, такой как малая молекула, антитело, пептид, пептидный или непептидный лиганд, белок, олигонуклеотид, аналог олигонуклеотида, такой как нуклеиновая кислота пептид, лектин или любая другая молекула, которая способна специфически связываться с целевым белком или молекулой, или образовывать стабильный комплекс с анализируемым веществом, такой как комплекс с белками.

Термин «связывающая частица» относится к любой молекуле, к которой можно напрямую или не напрямую присоединить молекулярные метки, которые способны специфически связываться с анализируемым веществом. Связывающие частицы включают, без ограничений, антитела, связывающие антитела композиции, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты и органические молекулы, обладающие молекулярной массой приблизительно до 1000 Дальтон и содержащие атомы, выбранной из группы, состоящей из водорода, углерода, кислорода, азота, серы и фосфора.

Термин «биомаркер» или «маркер» означает ген, мРНК или белок, который может подвергаться изменению, причем указанное изменение ассоциировано с раком. Указанное изменение может касаться количества, структуры и/или активности в ткани или клетках раковой опухоли в сравнении с количеством, структурой и/или активностью в нормальной или здоровой ткани или клетках (например, в контроле), и ассоциировано с заболеванием, таким как рак, например, маркер согласно настоящему изобретению, который ассоциирован с раком или является прогностическим фактором в отношении чувствительности к противораковым средствам, может содержать измененную последовательность нуклеотидов, хромосомную транслокацию, внутрихромосомную инверсию, измененное число копий, уровень экспрессии, уровень белка, активность белка или статус метилирования, в ткани или клетках раковой опухоли по сравнению с нормальной, здоровой тканью или клетками. Кроме того, термин «маркер» включает молекулу, структура которой изменена, например, мутирована (содержит мутации), например, отличается от последовательности дикого типа на уровне нуклеотидов или аминокислот, например, вследствие замены, делеции или вставки, когда присутствует в ткани или клетках, ассоциированных с заболеванием, таким как рак.

Термин «рак» или «опухоль» относится к наличию клеток, обладающих свойствами, типичными для клеток, вызывающих рак, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертность, потенциал метастазирования, высокая скорость роста и пролиферации и некоторые характерные морфологические особенности. Раковые клетки часто существуют в форме опухоли, но такие клетки могут существовать в организме животного и по отдельности, или могут быть не образующие опухоли раковые клетки, такие как клетки лейкемии. Применяемый в настоящей заявке термин «рак» включает как предраковые, так и раковые состояния. Рак включает в себя рак В-клеток, например, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, например, болезнь альфа-цепей, болезнь гамма-цепей, болезнь мю-цепей, доброкачественную моноклональную гаммапатию, амилоидоз иммуноцитов, меланомы, рак молочной железы, рак легких (такой как немелкоклеточная карцинома легких или НМКРЛ), рак бронхов, рак прямой и ободочной кишки, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак мозга или центральной нервной системы, рак периферической нервной системы, рак пищевода, рак шейки матки, рак матки или эндометрия, рак ротовой полости или глотки, рак печени, рак почек, рак яичек, рак желчных протоков, рак тонкой кишки или червеобразного отростка, рак слюнных желез, рак щитовидной железы, рак надпочечников, остеосаркому, хондросаркому, рак органов кроветворения, аденокарциномы, воспалительные опухоли из фибробластов, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST), рак ободочной кишки, множественную миелому (ММ), миелодиспластический синдром (МДС), миелопролиферативные расстройства (МПР), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), истинную полицитемию, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому (НХЛ), саркому мягких тканей, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, остеолитическая саркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, плоскоклеточный рак, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, гипернефрому, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональный рак, нефрому, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, гранулобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, фолликулярную лимфому, диффузную В-крупноклеточную лимфому, печеночно-клеточную карциному, рак щитовидной железы, рак желудка, рак головы и шеи, разновидности мелкоклеточного рака, идиопатическую тромбоцитопению, агногенную миелоидная метаплазия, синдром гиперэозинофилии, системный мастоцитоз, системную гиперэозинофилию, хронический эозинофильный лейкоз, разновидности нейроэндокринного рака, карциноиды и подобные, но не ограничиваясь ими.

Термин «химиотерапевтический препарат» относится к химическому веществу, такому как цитотоксический или цитостатический препарат, который применяют для лечения патологического состояния, например, рака.

Термин «комплементарный» относится к широкой концепции комплементарности последовательностей между областями двух цепей нуклеиновых кислот или между областями одной и той же цепи нуклеиновой кислоты. Известно, что остаток аденина первой области нуклеиновой кислоты может образовывать специфические водородные связи («спаривание оснований») с остатком второй об