Мыши, экспрессирующие легкую цепь с вариабельной областью альфа человека и константной областью мыши

Мыши, экспрессирующие легкую цепь с вариабельной областью альфа человека и константной областью мыши

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область применения изобретения

Генетически модифицированные мыши, которые содержат вариабельную последовательность лямбда (Vλ) легкой цепи мыши или человека, функционально связанную с константной областью легкой цепи мыши или человека (λ или каппа (κ)). Генетически модифицированные мыши, которые экспрессируют эпитоп-связывающие белки, которые содержат легкую цепь иммуноглобулина, содержащую вариабельный домен, полученный из вариабельного лямбда (hVλ) генного сегмента человека, соединительного лямбда (hJλ) генного сегмента человека, и константный домен легкой цепи (C_L) мыши. Генетически модифицированные мыши, содержащие вариабельную последовательность нуклеиновой кислоты неперегруппированной легкой цепи лямбда (λ) иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи мыши. Мыши, допускающие перегруппировку и экспрессию химерной легкой цепи λ человека/ C_L мыши из эндогенного локуса легкой цепи, которые содержат замену всех генных сегментов вариабельной области эндогенной легкой цепи мыши на один или несколько генных сегментов hVλ и один или несколько генных сегментов hJλ. Соматически видоизмененные антитела, содержащие домены hVλ и домены C_L мыши.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Мыши, которые экспрессируют антитела, являющиеся полностью человеческими, или частично человеческими и частично мышиными, известны в данной области. Например, описаны трансгенные мыши, которые экспрессируют полностью человеческие антитела из трансгенов, содержащих гены вариабельной области легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека. Также известны генетически модифицированные мыши, которые содержат замену эндогенных генных сегментов вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) и генных сегментов вариабельной области легкой цепи (LCVR) каппа (κ) мыши на генные сегменты HCVR и LCVR человека, и которые продуцируют химерные антитела с химерной каппа-цепью человек/мышь.

Легкие цепи антител кодируются одним из двух раздельных локусов: каппа (κ) и лямбда (λ). Легкие цепи антител мыши главным образом являются κ-типа. Соотношение использования κ и λ легкой цепи у человека составляет приблизительно 60:40, в то время как у мышей это соотношение составляет приблизительно 95:5. Несимметричное использование легких цепей κ у мыши, по имеющимся данным, поддерживается у генетически модифицированных мышей, способных экспрессировать полностью или частично человеческие антитела. Таким образом, мыши, которые продуцируют полностью или частично человеческие антитела, по-видимому, ограничены в использовании вариабельных лямбда.

В данной области существует необходимость в получении лямбда вариабельных областей, либо мыши, либо человека, для использования при получении эпитоп-связывающих белков. В данной области существует необходимость в мышах, которые продуцируют полностью или частично человеческие антитела, где мыши проявляют повышенное использование вариабельных областей лямбда (Vλ).

В данной области существует необходимость в мышах, которые продуцируют полностью или частично человеческие антитела, где мыши проявляют повышенное использование вариабельных областей лямбда (Vλ).

Краткое описание изобретения

Изобретение относится к генетически модифицированным мышам, эмбрионам, клеткам, тканям, а также конструкциям нуклеиновых кислот для видоизменения мышей, и к способам и композициям для получения и использования их. Изобретение относится к мышам и клеткам, которые продуцируют вариабельные области лямбда (λ) (человека или не относящиеся к человеческому роду) в связи с легкой цепью каппа (κ). Также изобретение относится к мышам и клеткам, которые продуцируют вариабельные области λ человека в связи с легкой цепью κ или λ, например, из эндогенного локуса легкой цепи мыши. Также изобретение относится к способам получения антител, которые содержат вариабельные области лямбда. Также изобретение относится к способам отбора тяжелых цепей, которые экспрессируются с родственными вариабельными областями лямбда.

Химерные и человеческие антигенсвязывающие белки (например, антитела), и нуклеиновые кислоты, кодирующие их, обеспечены при условии, если содержат соматически видоизмененные вариабельные области, в том числе антитела, которые имеют легкие цепи, содержащие вариабельные домены, полученные из генного сегмента Vλ и Jλ человека, слитого с константным доменом легкой цепи мыши.

В одном из аспектов, изобретение относится к мыши, которая экспрессирует последовательность вариабельной области λ человека на легкой цепи, которая включает константную область мыши. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует последовательность вариабельной области λ человека на легкой цепи, которая содержит константную область κ. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует из эндогенного локуса легкой цепи мыши легкую цепь, которая содержит последовательность вариабельной области λ человека. В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит перегруппированный ген легкой цепи, который содержит последовательность вариабельной области λ человека, связанную с последовательностью константной области мыши; в одном из вариантов осуществления последовательность константной области мыши представляет собой константную последовательность λ; в одном из вариантов осуществления последовательность константной области мыши представляет собой константную последовательность κ.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, где мышь содержит неперегруппированный генный сегмент легкой цепи λ человека (hVλ) и J-сегмент λ человека (hJλ). В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и hJλ находятся в локусе легкой цепи мыши. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ находятся в трансгене и функционально связаны с последовательностью константной области человека или мыши. В одном из вариантов осуществления неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ находятся на эписоме. В одном из вариантов осуществления мышь способна продуцировать иммуноглобулин, который содержит легкую цепь, полученную из последовательности неперегруппированного hVλ и последовательности hJλ, и последовательности нуклеиновой кислоты константной области (C_L) легкой цепи мыши. Таким образом изобретение относится к способам и композициям для получения и использования генетически модифицированных мышей. Изобретение относится к антителам, которые содержат (а) вариабельный домен тяжелой цепи человека (hV_H), слитый с константной областью тяжелой цепи мыши, и (b) Vλ человека, слитый с доменом C_L мыши; в том числе, к антителам, в которых один или несколько вариабельных доменов соматически видоизменены, например, во время селекции антитела или иммунных клеток в мыши по данному изобретению. В одном из вариантов осуществления данные неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ функционально связаны с константной областью κ (Сκ) человека или мыши. В одном из вариантов осуществления данные неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ функционально связаны с константной областью λ (Сλ) человека или мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, содержащей в своей зародышевой линии, в эндогенном локусе легкой цепи мыши, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека, где последовательность вариабельной области лямбда человека экспрессируется в легкой цепи, которая содержит последовательность гена константной области иммуноглобулина мыши.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус λ. В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ.

В одном из вариантов осуществления мышь лишена эндогенной вариабельной последовательности легкой цепи в эндогенном локусе легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления все, или практически все, эндогенные генные сегменты вариабельной области легкой цепи мыши заменены одним или несколькими генными сегментами вариабельной области λ человека.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека содержит последовательность Jλ человека. В одном из вариантов осуществления, последовательность Jλ человека выбрана из группы, состоящей из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека содержит фрагмент кластера А локуса легкой цепи человека. В конкретном варианте осуществления, фрагмент кластера А локуса легкой цепи λ человека простирается от hVλ3-27 через hVλ3-1 включительно.

В одном из вариантов осуществления, последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека содержит фрагмент кластера В локуса легкой цепи человека. В конкретном варианте осуществления, фрагмент кластера В локуса легкой цепи λ человека простирается от hVλ5-52 через hVλ1-40 включительно.

В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека содержит геномный фрагмент кластера А и геномный фрагмент кластера В. В одном из вариантов осуществления последовательность вариабельной области легкой цепи λ человека содержит по меньшей мере один генный сегмент кластера А и по меньшей мере один генный сегмент кластера В.

В одном из вариантов осуществления более чем 10% интактного набора легкой цепи мыши получено из по меньшей мере двух генных сегментов hVλ, отобранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, и 9-49. В одном из вариантов осуществления более чем 20% интактного набора легкой цепи мыши получено из по меньшей мере трех генных сегментов hVλ, выбранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, и 9-49. В одном из вариантов осуществления более чем 30% интактного набора легкой цепи мыши получено из по меньшей мере, трех генных сегментов hVλ, выбранных из 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, и 9-49.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует легкую цепь иммуноглобулина, которая содержит вариабельную последовательность λ человека, слитую с константной областью мыши, где мышь демонстрирует соотношение использования κ к использованию λ приблизительно 1:1.

В одном из вариантов осуществления легкая цепь иммуноглобулина экспрессируется из эндогенного локуса легкой цепи мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит последовательность вариабельной области легкой цепи λ (Vλ) и по меньшей мере одну J-последовательность (J), прилегающую к последовательности константной области легкой цепи κ мыши.

В одном из вариантов осуществления у мыши отсутствует функциональный генный сегмент Vκ мыши и/или генный сегмент Jκ мыши.

В одном из вариантов осуществления Vλ представляет собой Vλ человека (hVλ), и J представляет собой Jλ человека (hJλ). В одном из вариантов осуществления данные hVλ и hJλ представляют собой неперегруппированные генные сегменты.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит совокупность неперегруппированных генных сегментов hVλ и по меньшей мере один генный сегмент hJλ. В конкретном варианте осуществления совокупность неперегруппированных генных сегментов hVλ составляют по меньшей мере 12 генных сегментов, по меньшей мере 28 генных сегментов или по меньшей мере 40 генных сегментов.

В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один генный сегмент hJλ выбран из группы, имеющей в своем составе Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи λ мыши делетирован полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления последовательность константной области легкой цепи κ мыши находится в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши.

В одном из вариантов осуществления, приблизительно от 10% приблизительно до 45% В-клеток мыши экспрессируют антитело, которое содержит легкую цепь, содержащую вариабельный домен легкой цепи λ (Vλ) человека и константный домен легкой цепи κ (Сκ) мыши.

В одном из вариантов осуществления вариабельный домен λ человека получен из перегруппированной последовательности hVλ/hJλ, выбранной из группы, имеющей в своем составе 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 и 1-51/1.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит межгенную область Vκ-Jκ человека из локуса легкой цепи κ человека, где межгенная область Vκ-Jκ человека сопряжена с последовательностью Vλ и последовательностью J. В конкретном варианте осуществления межгенная область Vκ-Jκ человека расположена между последовательностью Vλ и J-последовательностью.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая содержит (а) по меньшей мере от 12 до по меньшей мере 40 неперегруппированных генных сегментов вариабельной области легкой цепи λ человека и, по меньшей мере, один генный сегмент Jλ человека в эндогенном локусе легкой цепи мыши; (b) межгенную область Vκ-Jκ человека, расположенную между по меньшей мере от 12 до, по меньшей мере 40 генными сегментами вариабельной области легкой цепи человека, и по меньшей мере одной последовательностью Jλ человека; где мышь продуцирует антитело, содержащее легкую цепь, содержащую домен Vλ человека и домен Cκ мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, которая экспрессирует антитело, содержащее легкую цепь, которая содержит вариабельную последовательность λ и константную последовательность κ.

В одном из вариантов осуществления мышь демонстрирует использование κ и использование λ в соотношении приблизительно 1:1.

В одном из вариантов осуществления популяция незрелых В-клеток, полученная из костного мозга мыши, демонстрирует использование κ и использование λ в соотношении приблизительно 1:1.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, где мышь содержит неперегруппированные генные сегменты Vλ и Jλ иммуноглобулина, функционально связанные с локусом легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши.

В одном из вариантов осуществления генные сегменты Vλ и/или Jλ представляют собой генные сегменты человека. В одном из вариантов генные сегменты Vλ и/или Jλ представляют собой генные сегменты мыши, и C_L представляет собой Cκ мыши.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус легкой цепи κ. В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус легкой цепи λ.

В одном из вариантов осуществления неперегруппированные генные сегменты Vλ и Jλ находятся в эндогенном локусе легкой цепи мыши.

В одном из вариантов осуществления неперегруппированные генные сегменты Vλ и Jλ иммуноглобулина находятся в трансгене.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит замену одного или нескольких генных сегментов V, D, и/или J тяжелой цепи на один или более сегментов генов V, D и/или J человека в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит неперегруппированный генный сегмент вариабельной области легкой цепи λ (Vλ) и J-генный сегмент λ (Jλ) иммуноглобулина человека в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит ген Cλ мыши.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельного гена легкой цепи («локус V_L») содержит по меньшей мере один генный сегмент Vλ (hVλ) человека. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один генный сегмент Jλ (hJλ) человека. В другом варианте осуществления локус V_L содержит до четырех генных сегментов hJλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит сопредельную последовательность, содержащую геномную последовательность λ человека и κ человека.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельного гена легкой цепи κ («локус κ») содержит по меньшей мере один генный сегмент Vλ человека (hVλ). В одном из вариантов осуществления локус κ содержит по меньшей мере один генный сегмент Jλ человека (hJλ). В одном из вариантов осуществления локус κ содержит до четырех генных сегментов hJλ. В одном из вариантов осуществления локус κ содержит по меньшей мере один hVλ и по меньшей мере один hJλ, и лишен, или практически лишен, функционального генного сегмента области Vκ, и лишен, или практически лишен, функционального генного сегмента области Jκ. В одном из вариантов осуществления мышь не содержит функционального генного сегмента области Vκ. В одном из вариантов осуществления мышь не содержит функционального генного сегмента области Jκ.

В одном из вариантов осуществления локус вариабельных генов легкой цепи λ («локус λ») содержит по меньшей мере один генный сегмент hVλ. В одном из вариантов осуществления локус λ содержит по меньшей мере один генный сегмент Jλ человека (hJλ). В другом варианте осуществления локус λ содержит до четырех генных сегментов hJλ.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит некоторое количество hVλ. В одном из вариантов осуществления совокупность hVλ выбрана таким образом, чтобы приводить к экспрессии спектра вариабельной области легкой цепи λ, который воспроизводит приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80% или приблизительно 90%, или более от использования Vλ, наблюдаемого у человека. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит генные сегменты hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, и их комбинацию.

В одном из вариантов осуществления hVλ включают 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления локус V_L содержит смежную последовательность локуса легкой цепи λ человека, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 и 3-12. В конкретном варианте осуществления локус V_L содержит смежную последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ3-12 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ и эндогенный локус легкой цепи λ делетирован частично или полностью. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ и эндогенный локус κ делетирован частично или полностью.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит 13-28 или более hVλ. В конкретном варианте осуществления hVλ включают 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, и 3-27. В конкретном варианте осуществления локус κ содержит смежную последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ3-27 до Vλ3-1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ и эндогенный локус легкой цепи λ делетирован частично или полностью. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ и эндогенный локус κ делетирован частично или полностью.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит 29-40 hVλ. В конкретном варианте осуществления локус κ содержит прилегающую последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ3-29 до Vλ3-1, и прилегающую последовательность локуса λ человека, которая простирается от Vλ5-52 до Vλ1-40. В конкретном варианте осуществления вся, или практически вся, последовательность между hVλ1-40 и hVλ3-29 в генетически модифицированной мыши состоит по существу из последовательности λ человека длиной приблизительно 959 п.о., встречающейся в природе (например, в человеческой популяции) в 5'-3' направлении генного сегмента hVλ1-40 (в прямом направлении 3'-нетранслируемой области), участок рестрикционного фермента (например, PI-SceI), за которым следует последовательность λ человека в 3'-5' направлении от генного сегмента hVλ3-29, длинной приблизительно 3431 п.о. встречающийся в природе. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ мыши. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ мыши и эндогенный локус легкой цепи λ мыши делетирован частично или полностью. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ мыши. В конкретном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ мыши и эндогенный локус κ мыши делетирован частично или полностью.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hJλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит совокупность hJλ. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, или 7 hJλ. В определенном варианте осуществления локус V_L содержит четыре hJλ. В определенном варианте осуществления данные четыре hJλ представляют собой hJλ1, hJλ2, hJλ3, и hJλ7. В одном из вариантов осуществления локус V_L представляет собой локус κ. В определенном варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ и эндогенный локус легкой цепи λ делетирован частично или полностью. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит один hJλ. В определенном варианте осуществления один hJλ представляет собой hJλ1. В одном из вариантов осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе κ. В определенном варианте локус V_L находится в эндогенном локусе κ и эндогенный локус легкой цепи λ делетирован частично или полностью. В другом варианте осуществления локус V_L находится в эндогенном локусе λ. В определенном варианте локус V_L находится в эндогенном локусе λ и эндогенный локус легкой цепи κ делетирован частично или полностью.

В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hVλ, по меньшей мере один hJλ, и ген Сκ мыши. В одном из вариантов осуществления локус V_L содержит по меньшей мере один hVλ, по меньшей мере один hJλ, и ген Сλ мыши. В определенном варианте осуществления ген Сλ мыши представляет собой Сλ2. В определенном варианте осуществления ген Сλ мыши по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, или, по меньшей мере на 99% идентичен Сλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену в эндогенном локусе κ мыши эндогенных генных сегментов Vκ мыши на один или несколько генных сегментов hVλ, где генные сегменты hVλ функционально связаны с эндогенной областью гена Сκ мыши, так что у мыши перегруппированы генные сегменты Vλ человека, и продуцируется обратная химерная легкая цепь иммуноглобулина, которая содержит домен Vλ человека и Сκ мыши. В одном из вариантов осуществления 90-100% неперегруппированных генных сегментов Vκ мыши заменены на, по меньшей мере, один неперегруппированный генный сегмент hVλ. В определенном варианте осуществления все, или практически все, эндогенные генные сегменты Vκ мыши заменены на, по меньшей мере, один неперегруппированный генный сегмент hVλ. В одном из вариантов осуществления замена составляет по меньшей мере 12, по меньшей мере 28 или по меньшей мере 40 неперегруппированных генных сегментов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит, по меньшей мере на 7 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ, по меньшей мере, на 16 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ, или, по меньшей мере, на 27 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ. В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену всех генных сегментов Jκ мыши на, по меньшей мере, один неперегруппированный генный сегмент hJλ. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент hJλ выбран из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, и их комбинации. В определенном варианте осуществления один или несколько генных сегментов hVλ выбран из генных сегментов hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 и их комбинации. В определенном варианте осуществления по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент hJλ выбран из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену эндогенных генных сегментов Vλ мыши в эндогенном локусе λ мыши на один или несколько генных сегментов Vλ человека в эндогенном локусе λ мыши, где данные генные сегменты hVλ функционально связаны с областью гена Сλ мыши, так что у мыши перегруппированы генные сегменты hVλ, и продуцируется обратная химерная легкая цепь иммуноглобулина, которая содержит домен hVλ и Сλ мыши. В определенном варианте осуществления ген Cλ мыши представляет собой Cλ2. В определенном варианте осуществления ген Сλ мыши, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или, по меньшей мере на 98% идентичен Сλ2 мыши. В одном из вариантов осуществления 90-100% неперегруппированных генных сегментов Vλ мыши заменены на, по меньшей мере, один неперегруппированный генный сегмент hVλ. В определенном варианте осуществления все, или практически все, эндогенные генные сегменты Vλ мыши заменены на, по меньшей мере, один неперегруппированный генный сегмент hVλ. В одном из вариантов осуществления замена составляет по меньшей мере 12, по меньшей мере 28 или по меньшей мере 40 неперегруппированных генных сегментов hVλ. В одном из вариантов осуществления замена происходит по меньшей мере на 7 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ, по меньшей мере на 16 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ или по меньшей мере на 27 функциональных неперегруппированных генных сегментов hVλ. В одном из вариантов осуществления мышь содержит замену всех генных сегментов Jλ мыши на по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент hJλ. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент hJλ выбран из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, и их комбинации. В определенном варианте осуществления один или несколько генных сегментов hVλ выбран из генных сегментов hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52, и их комбинации. В определенном варианте осуществления по меньшей мере один неперегруппированный генный сегмент hJλ выбран из Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, и их комбинации.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, которая содержит последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека, расположенную в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши.

В одном из вариантов осуществления последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека расположена в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, которая содержит генный сегмент hVλ и hJλ, и последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека расположена между генными сегментами hVλ и hJλ. В определенном варианте осуществления данные генные сегменты hVλ и hJλ способны к рекомбинации для формирования функционального вариабельного домена легкой цепи λ человека у мыши.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к мыши, которая содержит совокупность генных сегментов hVλ и один или несколько hJλ, и последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека расположена, относительно транскрипции, в 5'-3' направлении от самой проксимальной или 3' последовательности hVλ, и в 3'-5' направлении или 5' от первой последовательности hJλ.

В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ человека представляет собой область, расположенную приблизительно в 130 п.о. в 5'-3' направлении или 3' от генного сегмента Vκ4-1 человека, приблизительно в 130 п.о. в 5'-3' направлении от 3'-нетранслируемой области генного сегмента Vκ4-1 человека, и перекрывает приблизительно 600 п.о. в 3'-5' направлении или 5' от генного сегмента Jκ1 человека. В определенном варианте осуществления размер межгенной области Vκ-Jκ человека составляет приблизительно 22,8 т.п.о. В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ приблизительно на 90% или более, 91% или более, 92% или более, 93% или более, 94% или более, или приблизительно на 95% или более, идентична межгенной области Vκ-Jκ человека, простирающейся от конца 3'-нетранслируемой области генного сегмента Vκ4-1 человека до приблизительно 600 п.о. в 3'-5' направлении генного сегмента Jκ1 человека. В одном из вариантов осуществления межгенная область Vκ-Jκ содержит последовательность SEQ ID NO:100. В определенном варианте осуществления межгенная область Vκ-Jκ содержит функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO:100. В определенном варианте осуществления межгенная область Vκ-Jκ представляет собой последовательность SEQ ID NO:100.

В одном из аспектов изобретение относится к мыши, клеткам мыши (например, эмбриональная стволовая клетка мыши), эмбриону мыши и тканям мыши, которые содержат описанную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека, где последовательность межгенной области является эктопической. В определенном варианте осуществления эктопическая последовательность расположена в гуманизированном эндогенном локусе иммуноглобулина мыши.

В одном из аспектов изобретение относится к выделенной конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит описанную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека. В одном из вариантов осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит направляющие плечи для нацеливания последовательности межгенной области Vκ-Jκ человека на локус легкой цепи мыши. В определенном варианте осуществления локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ. В определенном варианте осуществления данные направляющие плечи нацеливают данную последовательность межгенной области Vκ-Jκ человека на модифицированный эндогенный локус κ мыши, где нацеливание относится к положению между последовательностью hVλ и последовательностью hJλ.

В одном из аспектов изобретение относится к генетически модифицированной мыши, где мышь содержит не более, чем две аллели легкой цепи, где данные аллели легкой цепи содержат (a) неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина человека в эндогенном локусе легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши; и, (b) неперегруппированный генный сегмент V_L и J_L иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи мыши, который содержит ген C_L мыши.

В одном из вариантов осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус κ. В другом варианте осуществления эндогенный локус легкой цепи мыши представляет собой локус λ.

В одном из вариантов осуществления не более двух аллелей легкой цепи выбрано из аллеля κ и аллеля λ, двух аллелей κ, и двух аллелей λ. В определенном варианте осуществления один из двух аллелей легкой цепи представляет собой аллель λ, который содержит ген Сλ2.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит один функциональный локус легкой цепи иммуноглобулина и один нефункциональный локус легкой цепи иммуноглобулина, где функциональный локус легкой цепи содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина человека в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит один функциональный локус легкой цепи иммуноглобулина и один нефункциональный локус легкой цепи иммуноглобулина, где функциональный локус легкой цепи содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина человека в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит ген Сκ мыши. В одном из вариантов осуществления ген Сλ представляет собой Сλ2. В определенном варианте осуществления ген Сλ мыши по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% идентичен Сλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь дополнительно содержит по меньшей мере один аллель тяжелой цепи иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один аллель тяжелой цепи иммуноглобулина содержит генный сегмент V_H человека, и генный сегмент D_H человека, и генный сегмент J_H в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши, который содержит ген тяжелой цепи человека, который экспрессирует тяжелую цепь человек/мышь. В определенном варианте осуществления мышь содержит два аллеля тяжелой цепи иммуноглобулина, и мышь экспрессирует тяжелую цепь человек/мышь.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит первый аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVκ и неперегруппированный hJκ в эндогенном локусе κ мыши, содержащем эндогенный ген Сκ; и второй аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ в эндогенном локусе κ мыши, содержащем эндогенный ген Сκ. В определенном варианте осуществления первый и второй аллели легкой цепи являются единственными функциональными аллелями легкой цепи генетически модифицированной мыши. В определенном варианте осуществления мышь содержит нефункциональный локус λ. В одном из вариантов осуществления генетически модифицированная мышь не экспрессирует легкую цепь, которая содержит константную область λ.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит первый аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVκ и неперегруппированный hJκ в эндогенном локусе κ мыши, содержащем эндогенный ген Сκ; и второй аллель легкой цепи, который содержит неперегруппированный hVλ и неперегруппированный hJλ в эндогенном локусе λ мыши, содержащем эндогенный ген Сλ. В определенном варианте осуществления первый и второй аллели легкой цепи являются единственными функциональными аллелями легкой цепи генетически модифицированной мыши. В одном из вариантов осуществления ген Сλ представляет собой Сλ2. В определенном варианте осуществления ген Сλ мыши, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98% идентичен Сλ2 мыши.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит шесть аллелей иммуноглобулина, где первый аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши, второй аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vκ и Jκ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи κ мыши, который содержит ген Сκ мыши, третий аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит ген Сλ мыши, четвертый и пятый аллели, каждый независимо друг от друга, содержат неперегруппированный генный сегмент V_H и D_H и J_H в эндогенном локусе тяжелой цепи мыши, который содержит ген тяжелой цепи мыши, и шестой аллель содержит либо (а) неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, содержащем ген Сλ мыши, либо (b) локус λ, который является нефункциональным, либо (с) делецию всего или части локуса λ.

В одном из вариантов осуществления первый аллель содержит неперегруппированные hVλ и hJλ. В одном из вариантов осуществления второй аллель содержит неперегруппированные hVκ и hJκ. В одном из вариантов осуществления третий аллель содержит неперегруппированные hVλ и hJλ. В одном из вариантов осуществления четвертый и пятый аллели, каждый независимо друг от друга, содержат неперегруппированный hV_H и hD_H, и hJ_H. В одном из вариантов осуществления шестой аллель содержит эндогенный локус λ мыши, который делетирован полностью или частично.

В одном из вариантов осуществления мышь содержит шесть аллелей иммуноглобулина, где первый аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит ген Сλ мыши, второй аллель содержит неперегруппированный генный сегмент Vλ и Jλ иммуноглобулина в эндогенном локусе легкой цепи λ мыши, который содержит