Инсектицидные cry-токсины dig-3

Инсектицидные cry-токсины dig-3

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/170189, поданной 17 апреля 2009 года, включенной в качестве ссылки в настоящий документ.

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым инсектицидным Cry-токсинам и их применению для контроля насекомых.

Предпосылки изобретения

Bacillus thuringiensis (B.t.) является передающейся через почву бактерией, продуцирующей пестицидные кристаллические белки, известные как дельта-эндотоксины или Cry-белки. Cry-белки являются пероральными интоксикантами, действующими на клетки средней кишки восприимчивых насекомых. Подробный список дельта-эндотоксинов сохраняют и регулярно обновляют на http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html.

Мотылек кукурузный (ECB) Ostrinia nubilalis (Hϋbner) является наиболее вредоносным насекомым-вредителем кукурузы на всем протяжении Соединенных Штатов и Канады и вызывает потерю приблизительно 1 миллиарда долларов дохода каждый год по причине потери урожая и расходов на способы воздействия на насекомых-вредителей (Witkowski et al., 2002). Трансгенная кукуруза, экспрессирующая гены, кодирующие Cry-белки, прежде всего, Cry1Ab, Cry1Ac или Cry1F, обеспечивает коммерческие уровни эффективности против ECB.

Несмотря на успех ECB-устойчивой трансгенной кукурузы, возможность развития устойчивых популяций насекомых угрожает долговременной стойкости Cry-белков в контроле ECB и создает потребность обнаруживать и разрабатывать новые Cry-белки для контроля ECB и других насекомых-вредителей. Устойчивость насекомых к Cry-белкам B.t. может развиваться несколькими механизмами (Heckel et al., 2007, Pigott and Ellar, 2007). У насекомых идентифицировали многочисленные классы рецепторных белков для Cry-белков, и существуют многочисленные примеры в каждом классе рецепторов. Может развиваться устойчивость к конкретному Cry-белку, например, посредством мутации в токсин-связывающей части кадгеринового домена рецепторного белка. Дополнительные механизмы устойчивости могут опосредоваться через протоксин-процессирующую протеазу. Таким образом, устойчивость к Cry-токсинам в видах Lepidoptera обладает комплексной генетической основой, по меньшей мере, с четырьмя отдельными основными генами устойчивости. На практике устойчивость насекомых Lepidoptera к Cry-белкам развивается в видах Plutella xylostella (Tabashnik, 1994), Trichoplusia ni (Janmaat and Myers 2003, 2005) и Helicoverpa zea (Tabashnik et al., 2008). Разработка новых высокопотенциальных Cry-белков будет предоставлять дополнительные инструменты для воздействия на ECB и других насекомых-вредителей. Продуцируемые в трансгенной кукурузе в сочетании Cry-белки с различными способами действия будут предотвращать развитие устойчивости насекомых ECB и обеспечивать долговременную полезность технологии B.t. для контроля насекомых-вредителей.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к инсектицидным Cry-токсинам, включая токсин, обозначаемый в настоящем документе как DIG-3, а также вариантам DIG-3, нуклеиновым кислотам, кодирующим данные токсины, способам контроля насекомых-вредителей с применением токсинов, способам получения токсинов в трансгенных клетках-хозяевах, и трансгенным растениям, продуцирующим токсины. Предсказанная аминокислотная последовательность токсина DIG-3 дикого типа указана в SEQ ID NO: 2.

Как описано в Примере 1, нуклеиновую кислоту, кодирующую белок DIG-3, выделяют из штамма B.t., обозначаемого внутри Dow AgroSciences LLC как PS46L. Определяли последовательность нуклеиновой кислоты для полноразмерной кодирующей области и из последовательности нуклеиновой кислоты делали вывод о последовательности полноразмерного белка. Токсин DIG-3 обладает некоторым сходством с Cry1BII (образец в GenBank № AAM93496) и другими белками типа Cry1B B. thuringiensis (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).

Инсектицидно активные варианты токсина DIG-3 также описывают в настоящем документе и собирательно обозначают как токсины DIG-3.

Токсины DIG-3 также можно применять в сочетании со способами РНКи для контроля других насекомых-вредителей. Например, DIG-3 можно применять в трансгенных растениях в сочетании с дцРНК для супрессии основного гена в диабротика или основного гена в насекомом-вредителе. Такие гены-мишени включают, например, вакуолярную АТФазу, ARF-1, Act42A, CHD3, EF-1α и TFIIB. Примером подходящего гена-мишени является вакуолярная АТФаза, как описывают в WO2007/035650.

Неожиданным результатом, опубликованным в настоящем документе, является то, что токсины DIG-3 являются активными против популяций мотылька кукурузного и моли капустной, устойчивых к токсинам Cry1F и Cry1A. Таким образом, токсины DIG-3 являются идеальными кандидатами для применения для контроля насекомых Lepidoptera. Токсины можно применять в отдельности или в сочетании с другими Cry-токсинами, такими как Cry1F, Cry1Ab и Cry1Ac, для контроля развития устойчивости популяций насекомых.

Инсектицидно активные фрагменты SEQ ID NO: 2 и нуклеотиды, кодирующие такие фрагменты, являются другим аспектом изобретения.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащему сегмент основного токсина, выбранный из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 113 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

В одном из вариантов осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащего сегмент основного токсина, выбранного из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 73 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду токсина DIG-3, содержащему сегмент основного токсина DIG-3, выбранный из группы, состоящей из

(a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 1 по 643 SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью из остатков с 1 по 643 ID NO: 2;

(c) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность из остатков с 1 по 643 SEQ ID NO: 2 с наличием до 20 замен, делеций или модификаций аминокислот, не обладающих неблагоприятным действием на экспрессию или активность токсина, кодируемого SEQ ID NO: 2.

Термином "выделенный" заявители обозначают, что молекулы полипептида или ДНК удаляют из их природного окружения и помещают в отличающееся окружение руками человека.

В другом варианте осуществления изобретение относится к растению, содержащему токсин DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к способу контроля популяции насекомого-вредителя, включающему контакт указанной популяции с пестицидно эффективным количеством токсина DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей токсин DIG-3.

В другом варианте осуществления изобретение относится к конструкции ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую токсин DIG-3, функционально связанную с промотором, получаемым не из Bacillus thuringiensis и способным запускать экспрессию в растении. Изобретение также относится к трансгенному растению, содержащему конструкцию ДНК, стабильно встроенную в его геном, и способу защиты растения от насекомого-вредителя, включающему встраивание конструкции в указанное растение.

Краткое описание последовательностей

Последовательность ДНК SEQ ID NO: 1, кодирующая полноразмерный токсин DIG-3; 3771 оснований.

SEQ ID NO: 2 Последовательность полноразмерного белка DIG-3; 1256 аминокислот.

SEQ ID NO: 3 Оптимизированная для растений последовательность ДНК полноразмерного DIG-3; 3771 оснований.

SEQ ID NO: 4 сегмент протоксина Cry1Ab; 545 аминокислот.

SEQ ID NO: 5 Химерный токсин: Сегмент основного токсина DIG-3/сегмент протоксина Cry1Ab; 1188 аминокислот.

SEQ ID NO: 6 Оптимизированная для двудольного растения последовательность ДНК, кодирующая сегмент протоксина Cry1Ab; 1635 оснований.

SEQ ID NO: 7 Оптимизированная для кукурузы последовательность ДНК, кодирующая сегмент протоксина Cry1Ab; 1635 оснований.

Подробное описание изобретения

Токсины DIG-3 и инсектицидно активные варианты. В дополнение к полноразмерному токсину DIG-3 SEQ ID NO: 2, данное изобретение относится к инсектицидно активным вариантам. Посредством термина "вариант" заявители намереваются включать фрагменты, конкретные делетационные и инсерционные мутации и конкретные слитые белки. DIG-3 является классическим трехдоменным Cry-токсином. В качестве предисловия к описанию вариантов токсина DIG-3, включенных в изобретение, будет полезно кратко рассмотреть архитектуру трехдоменных Cry-токсинов вообще и белкового токсина DIG-3 в частности.

Большинство кристаллических белковых молекул дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis состоит из двух функциональных сегментов. Устойчивый к протеазе основной токсин является первым сегментом и относится приблизительно к первой половине молекулы белка. Полная молекула протоксина с молекулярной массой 130 кДа быстро процессируется протеазами в кишечнике насекомого до устойчивого основного сегмента. Удаляемый посредством данного процессинга сегмент будут обозначать в настоящем документе как "сегмент протоксина". Полагают, что сегмент протоксина участвует в образовании кристалла токсина (Arvidson et al., 1989). Таким образом, сегмент протоксина может передавать частичную специфичность к насекомому токсину, ограничивая доступность основы насекомому посредством снижения процессинга протеазами молекулы токсина (Haider et al., 1986) или посредством снижения растворимости токсина (Aronson et al, 1991). Даже внутри конкретного класса токсины B.t. до некоторой степени варьируются по длине и по точной локализации перехода от сегмента основного токсина к сегменту протоксина. Переход от сегмента основного токсина к сегменту протоксина, как правило, находится в приблизительно от 50% до приблизительно 60% полноразмерного токсина. SEQ ID NO: 2 описывает последовательность 1256 аминокислот полноразмерного полипептида DIG-3, 643 N-концевые аминокислоты которого содержат сегмент основного токсина DIG-3. 1929 5'-концевых нуклеотидов SEQ ID NO: 1 содержат кодирующую область сегмента основного токсина.

Определяли трехмерные кристаллические структуры для Cry1Aa1, Cry2Aa1, Cry3Aa1, Cry3Bb1, Cry4Aa, Cry4Ba и Cry8Ea1. Данные структуры для основных токсинов являются исключительно схожими и состоят из трех отдельных доменов с описанными ниже свойствами (обзор в de Maagd et al., 2003).

Домен I является узлом из семи альфа-спиралей, где α-спираль 5 окружают шесть амфипатических спиралей. Данный домен вовлечен в образование поры и обладает гомологией с другими образующими поры белками, включая гемолизины и колицины. Домен I белка DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 56 по 278 SEQ ID NO: 2.

Домен II образуют три антипараллельных бета-слоя, упакованных вместе в бета-призму. Петли данного домена играют важную роль в связывании рецепторов средней кишки насекомого. В белках Cry1A поверхностные петли у верхушек бета-слоев домена II вовлечены в связывание с кадгериновыми рецепторами Lepidoptera. Петли домена II Cry3Aa аналогично связывают мембрано-связанную металлопротеазу Leptinotarsa decemlineata (Say) (колорадского жука) (Ochoa-Campuzano et al., 2007). Домен II обладает гомологией с конкретными углевод-связывающими белками, включая вителлин и джакалин. Домен II белка DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 283 по 493 SEQ ID NO: 2.

Домен III является бета-сэндвичем из двух анти-параллельных бета-слоев. Структурно данный домен относится к углевод-связывающим доменам белков, таких как глюканазы, галактозоксидаза, сиалидаза и других. Домен III связывает конкретные классы рецепторных белков и, возможно, участвует во встраивании олигомерной пре-поры, взаимодействующей со вторым классом рецепторов, примерами которых являются аминопептидаза и щелочная фосфатаза в случае белков Cry1A (Pigott and Ellar, 2007). Аналогичный Cry-домен в рецепторах необходимо идентифицировать в Coleoptera. Сохраненные блоки 2 и 3 последовательности B.t. картировали вблизи N-конца и C-конца домена 2, соответственно. Таким образом, данные сохраненные блоки последовательности 2 и 3 являются приблизительными пограничными областями между тремя функциональными доменами. Данные области сохраненной гомологии ДНК и белка применяли для конструирования токсинов B.t. (патент США № 6090931, WO 91/01087, WO 95/06730, WO 1998022595). Домен в белке DIG-3 содержит аминокислотные остатки с 503 по 641 SEQ ID NO: 2.

Сообщали, что α-спираль 1 домена I удаляется после связывания рецептора. Aronson et al. (1999) показывали, что Cry1Ac, связанный с BBMV, защищен от расщепления протеиназой K, начинающегося на остатке 59, сразу после α-спирали 1; схожие результаты приводят для Cry1Ab. Gomez et al. (2002) обнаруживали, что олигомеры Cry1Ab, образующиеся после связывания рецептора BBMV, не обладали частью α-спирали 1 домена I. Кроме того, Soberon et al. (2007) показывали, что мутанты Cry1Ab и Cry1Ac с N-концевой делецией без приблизительно 60 аминокислот, включающих α-спираль 1 в трехмерной структуре Cry, способны к сборке мономеров с молекулярной массой приблизительно 60 кДа в пре-поры в отсутствие связывания кадгерина. Сообщали, что данные мутанты по N-концевой делеции являются активными по отношению к Cry-устойчивым личинкам насекомых. Кроме того, Diaz-Mendoza et al. (2007) описывали фрагменты Cry1Ab 43 кДа и 46 кДа, сохраняющие активность по отношению к средиземноморскому мотыльку кукурузному (Sesamia nonagrioides). Показывали, что данные фрагменты включают аминокислотные остатки с 116 по 423; однако точные аминокислотные последовательности не выяснены, и механизм активности данных протеолитических фрагментов является неизвестным. Результаты Gomez et al. (2002), Soberon et al. (2007) и Diaz-Mendoza et al. (2007) отличаются от таковых Hofte et al. (1986), сообщавших, что делеция 36 аминокислот из N-конца Cry1Ab приводила к потере инсектицидной активности.

Заявители расшифровывали начала и концы α-спирали 1, α-спирали 2A, α-спирали 2B и α-спирали 3 и положение спейсерных областей между ними в домене I токсина DIG-3 посредством сравнения последовательности белка DIG-3 с последовательностью белка Cry8Ea1, для которого структура известна. Данные положения описывают в таблице 1.

Варианты DIG-3 с амино-концевой делецией. В одном из аспектов изобретение относится к вариантам DIG-3, в которых вся или часть α-спирали 1, α-спирали 2A и α-спирали 2B делетирована для улучшения инсектицидной активности и во избежание развития устойчивости у насекомых. Данные модификации осуществляли для предоставления вариантов DIG-3 с улучшенными свойствами, такими как улучшенный спектр целевых насекомых-вредителей и контроль устойчивости насекомых. В некоторых вариантах осуществления изобретения заявленные модификации могут действовать на эффективность активации протоксина и образования поры, приводя к интоксикации насекомого. Более конкретно, для предоставления вариантов DIG-3 с улучшенными свойствами описывали пошаговые делеции, удаляющие часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей N-конец белка DIG-3. Посредством делеций удаляли всю α-спираль 1 и всю или часть α-спирали 2 в домене I, в то же время поддерживая структурную целостность α-спиралей с 3 по 7. Таким образом, заявленное изобретение частично относится к усовершенствованиям эффективности белка Cry, осуществляемым посредством конструирования α-спирального компонента домена 1 для более эффективного образования пор. Более конкретно, заявленное изобретение частично относится к улучшенным белкам DIG-3, сконструированным с N-концевыми делециями в областях с предполагаемой гомологией вторичной структуры с α-спиралью 1 и α-спиралью 2 в домене I белков Cry1.

Делеции для улучшения инсектицидных свойств токсинов DIG-3 можно вводить до прогнозируемого начала α-спирали 2A и можно заканчивать после конца α-спирали 2B, но предпочтительно не продлевать в α-спираль 3.

При конструировании кодирующих последовательностей для вариантов с N-концевой делецией инициирующий кодон ATG, кодирующий метионин, встраивают на 5'-конец нуклеотидной последовательности, сконструированной для кодирования варианта с делецией. Для последовательностей, сконструированных для применения в трансгенных растениях, может являться полезным соблюдать "N-концевое правило" Варшавского (1997). Научно известно, что некоторые аминокислоты могут способствовать нестабильности и деградации белка в эукариотических клетках, если представлены в качестве N-концевого остатка белка. Например, данные, полученные при наблюдениях за дрожжами и клетками млекопитающих, свидетельствуют, что N-концевыми дестабилизирующими аминокислотами являются F, L, W, Y, R, K, H, I, N, Q, D, E и, возможно, P. В то время как особенности механизмов деградации белка могут до некоторой степени отличаться между организмами, сохранение идентичности указанных выше N-концевых дестабилизирующих аминокислот означает, что схожие механизмы могут функционировать в растительных клетках. Например, Worley et al. (1998) обнаруживали, что в растениях N-концевое правило включает основные и ароматические остатки. Возможно, протеолитическое расщепление растительными протеазами вблизи начала α-спирали 3 заявленных инсектицидных белков B.t. может раскрывать дестабилизирующую N-концевую аминокислоту. Такой процессинг может иметь целью расщепленные белки для быстрого разрушения и ограничения накопления инсектицидных белков B.t. до уровней, недостаточных для эффективного контроля насекомых. Таким образом, для вариантов с N-концевой делецией, начинающихся с одной из дестабилизирующих аминокислот, заявители предпочитают добавлять кодон, специфический для аминокислоты G (глицин), между инициирующим трансляцию метионином и дестабилизирующей аминокислотой.

В примере 2 приведены конкретные примеры вариантов DIG-3 с амино-концевой делецией по изобретению. Дополнительные применимые фрагменты, сохраняющие токсичность, можно идентифицировать расщеплением трипсином или химотрипсином полноразмерного растворимого кристаллического белка. Фрагменты кодирующей области DIG-3 могут кодировать дополнительные примеры токсических фрагментов белка DIG-3. Активные в отношении насекомых варианты DIG-3, в основном, обладают коротким N-концевым укорочением и длинным C-концевым укорочением. N-конец наименьшего токсического фрагмента общепринято определяют посредством определения N-концевой аминокислотной последовательности обработанного трипсином или химотрипсином растворимого кристаллического белка общепринято доступными в данной области способами.

Химерные токсины. Ранее сообщали о химерных белках, задействующих сегмент основного токсина одного Cry-токсина, слитый с сегментом протоксина другого Cry-токсина. Варианты DIG-3 включают токсины, содержащие N-концевой сегмент основного токсина токсина DIG-3 (который может являться полноразмерным или обладать описанными выше N-концевыми делециями), слитый с гетерологичным сегментом протоксина в некоторой точке после конца сегмента основного токсина. Переход в гетерологичный сегмент протоксина может иметь место приблизительно в природном соединении основной токсин/протоксин или, альтернативно, может сохранять часть природного протоксина (продолжающуюся после сегмента основного токсина) с находящимся ниже переходом в гетерологичный протоксин. В качестве примера, химерный токсин по заявленному изобретению обладает полным сегментом основного токсина DIG-3 (аминокислоты 1-643) и гетерологичным сегментом протоксина (аминокислоты с 643 до C-конца). В предпочтительном варианте осуществления гетерологичный сегмент протоксина получают из дельта-эндотоксина Cry1Ab, как показано в SEQ ID NO: 5.

В SEQ ID NO: 4 описывают 545-аминокислотную последовательность сегмента протоксина Cry1Ab, применимую в вариантах DIG-3 по изобретению. Привлекают внимание приблизительно от 100 до 150 последних аминокислот данного сегмента протоксина, являющихся наиболее критичными для включения в химерный токсин по заявленному изобретению.

Варианты чувствительности протеазы. Протеазы кишечника насекомого, как правило, функционируют, помогая насекомому получать необходимые аминокислоты из белка пищи. Наиболее распространенными пищеварительными протеазами насекомых являются сериновые протеазы, вероятно, являющиеся наиболее распространенным типом (Englemann and Geraerts (1980)), в частности, в видах Lepidoptera. Насекомые Coleoptera обладают средой кишечника от более нейтральной до более кислой, чем кишечник Lepidoptera. Большинство личинок и взрослых особей Coleoptera, например, колорадского жука, обладают слегка кислой средой средней кишки, и цистеиновые протеазы обеспечивают основную протеолитическую активность (Wolfson и Murdock, 1990). Более точно, Thie и Houseman (1990) идентифицировали и охарактеризовывали цистеиновые протеазы, катепсин B-подобную и катепсин H-подобную, и аспартатную протеазу, катепсин D-подобную, у колорадского жука. Gillikin et al. (1992) охарактеризовывали протеолитическую активность в кишечнике личинок западного кукурузного жука и обнаруживали, главным образом, цистеиновые протеазы. В патенте США № 7230167 описывают, что протеазная активность, приписываемая катепсину G, существует у западного кукурузного жука. Разнообразие и различные уровни активности протеаз кишечника насекомых могут влиять на чувствительность насекомого к конкретному токсину B.t.

В другом варианте осуществления изобретения участки расщепления протеазами можно конструировать в желаемых положениях для воздействия на процессинг белка внутри средней кишки восприимчивых личинок конкретных насекомых-вредителей. Данные участки расщепления протеазами можно встраивать такими способами, как химический синтез гена или ПЦР по способу перекрывающегося сплайсинг-расширения (Horton et al., 1989). Последовательности распознавания сериновых протеаз, например, необязательно можно встраивать в специфические участки в структуре Cry-белка для воздействия на процессинг белка в желаемых точках делеции внутри средней кишки восприимчивых личинок. Сериновые протеазы, которые можно применять, таким образом, включают сериновые протеазы средней кишки Lepidoptera, такие как трипсин или трипсин-подобные ферменты, химотрипсин, эластаза и т.д. (Christeller et al., 1992). Кроме того, для воздействия на активацию белка можно конструировать участки делеции, эмпирически идентифицированные секвенированием продуктов расщепления Cry-белков, полученных с помощью нефракционированных препаратов протеаз личиночной средней кишки или связывания с мембранными везикулами щеточной каймы. Модифицированные Cry-белки, получаемые делецией гена или встраиванием участков расщепления протеаз, обладают улучшенной активностью по отношению к насекомым-вредителям Lepidoptera, включая Ostrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Helicoverpa zea, Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Diatraea saccharalis, Loxagrotis albicosta и другим целевым насекомым-вредителям.

Сериновые протеазы Coleoptera, такие как трипсин, химотрипсин и катепсин G-подобная протеаза, цистеиновые протеазы Coleoptera, такие как катепсины (B-подобные, L-подобные, O-подобные и K-подобные протеазы) (Koiwa et al., (2000) и Bown et al, (2004)], металлопротеазы Coleoptera, такие как ADAM10 [Ochoa-Campuzano et al., (2007)), и аспартатные протеазы Coleoptera, такие как катепсин D-подобные и E-подобные, пепсин, плазмепсин и химозин, можно дополнительно применять посредством конструирования соответствующих последовательностей распознавания в желаемых участках процессинга для воздействия на процессинг Cry-белка в средней кишке восприимчивых личинок конкретных насекомых-вредителей.

Предпочтительная локализация для встраивания таких участков расщепления протеазой может находиться внутри "спейсерной" области между α-спиралью 2B и α-спиралью 3, например, между аминокислотами с 109 по 113 полноразмерного белка DIG-3 (SEQ ID NO: 2 и таблица 1). Модифицированные Cry-белки, получаемые делецией гена или встраиванием участков расщепления протеазой, обладают улучшенной активностью по отношению к насекомым-вредителям, включая, в качестве неограничивающих примеров, западного кукурузного жука, 11-точечную блошку Говарда, блошку длинноусую и т.п.

Существуют различные технологии, делающие возможным определение последовательности аминокислот, включающей N-концевые или C-концевые остатки полипептидов. Например, автоматизированный способ деградации по Эдману можно последовательно применять для определения N-концевой аминокислотной последовательности до 30 аминокислотных остатков с 98% точностью на остаток. Кроме того, также является возможным определение последовательности аминокислот, включающей карбоксильный конец полипептидов [Bailey et al., (1992); патент США № 6046053]. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления можно охарактеризовывать Cry-белки B.t., активированные средствами протеолитического процессинга, например, полученными из кишечника насекомого протеазами, и идентифицировать N-концевые или C-концевые аминокислоты фрагмента активированного токсина. В объем изобретения включены варианты DIG-3, получаемые встраиванием или удалением участков процессинга протеазами в соответствующих положениях кодирующей последовательности для того, чтобы делать возможным или устранять протеолитическое расщепление большего варианта белка протеазами насекомого, растения или микроорганизма. Конечным результатом такой манипуляции следует понимать получение молекул фрагмента токсина, обладающих такой же или лучшей активностью, чем интактный (полноразмерный) белок токсина.

Домены токсина DIG-3. Ожидают, что отдельные домены токсина DIG-3 (и варианты, на 90%, 95% или 97% идентичные таким доменам) будут применимы в образовании комбинаций с доменами из других Cry-токсинов для предоставления новых токсинов с расширенным спектром токсичности для насекомых-вредителей, улучшенной эффективностью или повышенной стабильностью белка. Домен I белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 56 по 278 SEQ ID NO: 2. Домен II белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 283 по 493 SEQ ID NO: 2. Домен III белка DIG-3 состоит из аминокислотных остатков с 503 по 641 SEQ ID NO: 2. Обмен доменами или перетасовка доменов является механизмом для получения измененных белков дельта-эндотоксина. Домены II и III могут обмениваться между белками дельта-эндотоксина, приводя к гибридным или химерным токсинам с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Домен II вовлечен в связывание рецептора, и домен II DIG-3 является очень дивергентным по отношению к другим Cry1B-токсинам. Домен III связывает конкретные классы рецепторных белков и, возможно, участвует во встраивании олигомерной пре-поры токсина. Показано, что некоторые замены в домене III вызывают лучшую токсичность против Spodoptera exigua (de Maagd et al., 1996), и существует руководство по конструированию замен доменов Cry-токсина (Knight et al., 2004).

Способы получения рекомбинантных белков и их тестирования на пестицидную активность хорошо известны в данной области (см., например, Naimov et al., (2001), de Maagd et al., (1996), Ge et al., (1991), Schnepf et al., (1990), Rang et al., (1999)). Домен I из белков Cry1A и Cry3A исследовали на способность встраиваться и образовывать поры в мембранах, α-спираль 4 и α-спираль 5 домена I играют ключевую роль во встраивании в мембрану и образование поры [Walters et al., (1993), Gazit et al., (1998)]; Nunez-Valdez et al., (2001)], и полагают, что другие альфа-спирали контактируют с поверхностью мембраны подобно ребрам зонта (Bravo et al., (2007); Gazit et al., (1998)).

Варианты DIG-3, создаваемые посредством осуществления ограниченного количества делеций, замен или добавлений аминокислот. Делеции, замены и добавления аминокислот в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 легко можно получать последовательным образом, и с помощью биологического анализа можно тестировать эффекты таких изменений на инсектицидную активность. При условии, что количество изменений является ограниченным, такое тестирование не включает чрезмерную экспериментальную работу. Изобретение включает инсектицидно активные варианты сегмента основного токсина (аминокислоты 1-643 SEQ ID NO: 2 или аминокислоты 73-643 SEQ ID NO: 2), в которых можно осуществлять до 10, до 15 или до 20 независимых добавлений, делеций или замен аминокислот.

Изобретение включает варианты DIG-3, обладающие сегментом основного токсина, на 90%, 95% или 97% идентичным аминокислотам 1-643 SEQ ID NO: 2 или аминокислотам 73-643 SEQ ID NO: 2.

Можно получать варианты посредством осуществления случайных мутаций или можно конструировать варианты. В случае сконструированных мутантов существует большая вероятность получения вариантов со схожей с природным токсином активностью, если идентичность аминокислот сохраняется в критичных областях токсина, объясняющих биологическую активность или вовлеченных в определение трехмерной конфигурации, в конечном итоге ответственной за биологическую активность. Также существует высокая вероятность сохранения активности, если замены являются консервативными. Аминокислоты можно разделять на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Наименее вероятно, что консервативные замены существенно изменяют биологическую активность варианта, при условии что аминокислоту одного класса заменяют аминокислотой того же типа. В таблице 2 приводят список примеров аминокислот, принадлежащих каждому классу.

В некоторых случаях также можно осуществлять неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что данные замены не должны значительно снижать биологическую активность токсина. Варианты включают полипептиды, отличающиеся по аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. Варианты белков, включенные в настоящее изобретение, являются биологически активными, т.е. они продолжают обладать желаемой биологической активностью природного белка, а именно, сохраняют пестицидную активность.

Также можно конструировать варианты белков, отличающиеся на уровне последовательности, но сохраняющие ту же или схожую общую основную трехмерную структуру, распределение поверхностного заряда и т.п. См., например, патент США № 7058515; Larson et al. (2002); Stemmer (1994a,1994b, 1995); и Crameri et al. (1996a, 1996b, 1997).

Нуклеиновые кислоты. Одним из аспектов настоящего изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие токсины DIG-3. Они включают нуклеиновые кислоты, кодирующие SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 5, и комплементарные им, а также другие нуклеиновые кислоты, кодирующие инсектицидные варианты SEQ ID NO: 2. Из-за вырожденности генетического кода, многообразие различных последовательностей ДНК может кодировать описываемые в настоящем документе аминокислотные последовательности. Специалист в данной области может создавать данные измененные последовательности ДНК, кодирующие те же или по существу те же токсины.

Синтез гена. Последовательности ДНК, кодирующие описываемые в настоящем документе улучшенные Cry-белки, можно получать множеством хорошо известных в данной области способов. Например, синтетические сегменты гена и синтетические гены можно получать фосфит-триэфирным и фосфорамидитным способами (Caruthers et al, 1987) и существуют коммерческие производители для осуществления синтеза ДНК по заказу. Последовательности, кодирующие полноразмерные белки DIG-3, можно собирать множеством способов, включая, например, лигирование рестрикционных фрагментов или сборку посредством полимеразной цепной реакции с перекрывающимися олигонуклеотидами (Stewart и Burgin, 2005). Кроме того, последовательности, кодирующие концевые делеции, можно получать амплификацией ПЦР с применением сайт-специфических концевых олигонуклеотидов.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие токсины DIG-3, можно получать, например, синтетическим конструированием способами, применяемыми в настоящее время любым из отдельных коммерческих поставщиков. (См., например, патент США № 7482119 B2). Данные нуклеиновые кислоты или их части или варианты также можно конструировать синтетически, например, с применением синтезатора ДНК и способов конструирования, например, по патенту США № 5380831. Альтернативно, варианты синтетических или природных генов легко можно конструировать с применением стандартных техник молекулярной биологии для получения точечных мутаций. Фрагменты данных генов также можно получать стандартными способами с применением коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз. Например, для систематического отрезания нуклеотидов с концов данных генов можно применять ферменты, такие как Bal31, или сайт-специфический мутагенез. Кроме того, фрагменты генов, кодирующие активные фрагменты токсина, можно получать с применением множества ферментов рестрикции.

С учетом аминокислотной последовательности токсина DIG-3 кодирующую последовательность можно конструировать посредством обратной трансляции кодирующей последовательности с применением кодонов, предпочтительных для предполагаемого хозяина, и затем оптимизации последовательности с применением альтернативных кодонов для удаления последовательностей, которые могут вызывать проблемы и привносить периодические стоп-кодоны, для удаления длинных открытых кодирующих последовательностей в некодирующих рамках считывания.

Количественный анализ идентичности последовательности. Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновой кислоты последовательности выравнивают в целях оптимального сравнения. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей (т.е. процент идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающиеся положения)Ч100). В одном из вариантов осуществления две последовательности обладают одной и той же длиной. Процент идентичности между двумя последовательностями можно определять с применением техник, схожих с описанными выше, с допусканием пропусков или без него. При вычислении процента идентичности, как правило, подсчитывают точные соответствия.

Определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществлять с применением математического алгоритма. Неограничивающим примером такого алгоритма является таковой Karlin и Altschul (1990), модифицированный в Karlin и Altschul (1993), и включенный в программное обеспечение BLASTN и BLASTX. Поиски в BLAST удобно применять для идентификации последовательностей, гомологичных (схожих) поисковой последовательности в базах данных нуклеиновых кислот или белков. Поиски в BLASTN можно осуществлять (баллы=100, длина слова=12) для идентификации нуклеотидных последовательностей, обладающих гомологией с заявляемыми молекулами нуклеиновой кислоты по изобретению. Поиски в BLASTX можно осуществлять (баллы=50, длина слова=3) для идентификации аминокислотных последовательностей, обладающих гомологией с заявляемыми инсектицидными молекулами белка по изобретению.

BLAST с пропусками (Altschul et al., 1997) можно применять для получения выравниваний с пропусками в целях сравнения. Альтернативно, PSI-Blast можно применять для осуществления итерационного поиска, определяющего отдаленные взаимосвязи между молекулами (Altschul et al., 1997). При применении программного обеспечения BLAST, BLAST с пропусками и PSI-Blast можно применять параметры по умолчанию соответствующего программного обеспечения. См. www.ncbi.nlm.nih.gov.

Неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, явля