Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор ix

Способ очистки витамин к-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор ix

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу очистки витамин К-зависимых белков, таких как коагуляционный фактор IX (сокращенно FIX), и фракции, содержащей витамин К-зависимый белок, такой как FIX, получаемой способом, описанным в настоящем изобретении.

Гемофилия представляет собой группу наследственных генетических заболеваний, при которых нарушается способность организма контролировать свертывание крови или коагуляцию. При одной из форм заболевания, гемофилии В, коагуляционный фактор IX (FIX) является дефектным. Гемофилия В встречается с частотой 1 на 25 000 новорожденных мальчиков. Фактор IX (или фактор Кристмаса) является одной из сериновых протеаз системы свертывания крови. Он является витамин К-зависимым белком плазмы крови, который участвует во внутреннем каскаде свертывания крови, переводя фактор Х в его активную форму в присутствии ионов кальция Ca²⁺, фосфолипидов и фактора VIIIa. Белок FIX является необходимым фактором свертывания крови, проявляющим многофункциональные свойства.

Фактор IX (FIX) представляет собой одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 461 аминокислоты. Он синтезируется в первую очередь в печени и секретируется в плазму крови. Молекула фактора IX состоит из нескольких дискретных функциональных доменов, включая сигнальный пептид, пропептид, Gla-домен, два домена, подобных эпидермальному фактору роста (EGF), активационный пептид и каталитический трипсин-подобный домен (домен сериновой протеазы). Пропептид расщепляется перед секрецией с получением зрелой молекулы FIX длиной 415 аминокислот. Далее белок процессируется в активную форму, в гетеродимер, состоящий из легкой и тяжелой цепей, соединенных дисульфидной связью.

Дефицит фактора IX может лечиться полученными из плазмы концентратами FIX или же рекомбинантно полученным FIX. Лечение концентратами FIX привело к нормализации жизни больных гемофилией. Исторически лечение гемофилии В проводилось с использованием FIX из плазмы крови человека. В плазме крови при нейтральных условиях молекула FIX циркулирует в нативной форме, тогда как она активируется с помощью сложного процесса, начинающегося в крови каскадом коагуляционных ферментов.

Продукты, содержащие FIX из плазмы крови, выходят на рынок, демонстрируя различную чистоту в зависимости от используемого способа очистки. Обычно способы очистки FIX представляли собой комбинацию различных хроматографических стадий (по большей части стадий ионообменной и аффинной хроматографии) для стадии(й) очистки и ультрафильтрации для концентрирования/обессоливания продукта.

Harrison и коллеги (S.Harrison et al. Sem Hematol 35 (Supl 2): 4-10 (1998)) описывают способ производства рекомбинантно полученного FIX (Benefix^®) в клетках СНО. Клетки собирают путем микрофильтрации и затем концентрируют на стадии ультрафильтрации/диафильтрации, в которой используемый буфер заменяется на Трис-буфер в целях обеспечения подходящего буфера для нанесения на первую хроматографическую колонку. Очистка рекомбинантно полученного FIX (rFIX) состоит из четырех независимых хроматографических стадий, первая из них - анионный обмен (Q Sepharose FF), который проводится в псевдо-аффинной форме. Колонка элюируется 10 мМ раствором хлорида кальция при pH 8,0. Хлорид кальция индуцирует изменение конформации в молекуле FIX, которое позволяет смыть ее с колонки.

После стадии с использованием смолы Q Sepharose идет стадия очистки на колонке со смолой Matrex на основе целлюфинсульфата, который является аналогом гепарина и используется для аффинной очистки белков с гепарин-связывающими доменами. Он также проявляет свойства катионообменной смолы благодаря наличию отрицательно заряженных сульфатных групп. Стадия очистки на целлюфинсульфатной смоле удаляет низкие концентрации белков клетки-хозяина.

Элюат целлюфинсульфатной колонки переносится на колонку с керамическим гидроксиапатитом, синтетической формой фосфата кальция. Эта колонка используется для разделения белков с различными зарядами, позволяя удалять формы rFIX с более низкой специфической активностью. Эта колонка элюируется с последовательным увеличением концентрации фосфата до финальной концентрации 0,5 М.

На финальной стадии очистки при производстве препарата Benefix^® используется хелатная смола Chelate-EMD-Cu(II). Белки взаимодействуют с иммобилизованными металлами, удерживаемыми смолой. Связавшийся rFIX элюируется имидазолом, действующим в качестве вытеснителя, и остаточные примеси удаляются на этой стадии очистки, за которой следует стадия фильтрации вирусов (Viresolve-70) и финальная стадия ультрафильтрации/диафильтрации, на которой rFIX концентрируется, и используемый буфер заменяется на буфер, входящий в состав препарата.

Описанный выше способ производства rFIX является стабильным, были проанализированы 65 партий, и полученная специфическая активность равнялась 276±23 МЕ/мг вещества. Содержание Gla-белка составило 11,4±0,1 моль/моль rFIX и общее количество примесей составило 0,01±0,01% и 0,03±0,01% для обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа белков клетки-хозяина, соответственно.

Lindsay с коллегами (J Chrom A 1026: 149-157 (2004)) описывает способ очистки rFIX из молока трансгенных свиней. На первой стадии очистки использовалась гепариновая сефароза (Heparin Sepharose FF), после чего использовалась стадия анионного обмена.

Гепарин-связывающий домен фактора IX расположен в С-терминальном конце молекулы. В этом регионе не происходит посттрансляционных модификаций, и поэтому rFIX может быть полностью выделен одной стадией хроматографии с гепарином в качестве лиганда. Специфическая активность элюата равнялась 30-35 МЕ/мг, что показывает неактивность большей части фракции. Виды активного rFIX отделили от видов неактивного rFIX с помощью градиентного элюирования на анионообменной хроматографической колонке.

Kaufman с коллегами (JBC 261:9622-9628 (1986)) описывает экспрессию rFIX в клетках линии CHO и очистку данного белка. Среда, в которой выращивалась культура клеток, содержащих rFIX, была сконцентрирована с помощью ультрафильтрации и диализирована с буфером, содержащим 3 мМ CaCl₂, 0,05М Трис-HCl и 0,5М NaCl, перед нанесением на иммуноаффинную колонку с конформационно-специфическими антителами (антитела anti-FIX:Ca(II)). После этого колонка элюировалась раствором 10 мМ ЭДТА, 0,05М Трис-HCl и 0,15М NaCl.

Присутствие 3 мМ CaCl₂ в исходном материале перед нанесением на колонку позволило разделить активные и неактивные виды FIX. Неактивные виды не связывались со смолой колонки, а активные виды FIX могли элюироваться с колонки с помощью ЭДТА.

Патент WO-A-2009/007451 описывает способ очистки фактора FVIII с применением смешанной или мультимодальной смолы. Способ очистки основан на приведении в контакт белка FVIII с мультимодальной или смешанной смолой, содержащей лиганды с гидрофобной частью и отрицательно заряженной частью, и на элюировании указанного белка FVIII в элюирующем буфере с содержанием по меньшей мере, 1,5М концентрацией соли и по меньшей мере, 40% (масса/объем) концентрацией этиленгликоля, пропиленгликоля или их смеси, и ионов кальция.

Патент EP-A-1707634 описывает способ выделения рекомбинантно полученных белков с помощью таких способов, кроме прочих, как иммуноаффинная хроматография, аффинная хроматография, осаждение белков, смена буфера, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, смешанная гидрофобная/ионообменная хроматография, хелатная хроматография, углеводно-аффинная, такая как лектин- или гепарин-аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез, диализ, применение различных осадителей, таких как полиэтиленгликоль, сульфат аммония, этанол, адсорбция на гидроксиапатите, адсорбция на фильтровальной мембране, прикрепленные к магнитным частицам лиганды и т.д. Однако в указанном патенте не обозначены конкретные стадии хроматографической очистки.

Патент WO-A-2005-082483 описывает способ очистки антител от одной или более примесей, содержащихся в жидкости, способ, в котором указанная жидкость контактирует с первой хроматографической смолой, состоящей из носителя с иммобилизованными на нем мультимодальными лигандами для адсорбции антител на смоле, где каждый мультимодальный лиганд содержит по меньшей мере одну катионообменную группу и по меньшей мере одно ароматическое кольцо или систему гетероароматических колец. С помощью элюата антитела смываются со смолы, и полученный элюат контактирует со второй хроматографической смолой.

Патент WO-A-2005/121163 описывает способ выделения одного или более белков из раствора белков. Способ включает стадии получения раствора, содержащего один или более специфических белков и имеющего заданное значение рН и заданную ионную силу или проводимость, нанесения раствора белка на адсорбирующую колонку с частицами, которые по меньшей мере на высокоплотном непористом носителе содержат пористый материал, адсорбент, с плотностью частиц по меньшей мере, 1,5 г/мл и среднеобъемным диаметром частицы более 150 мкм. Необязательно колонка промывается перед элюированием белка(ов) с адсорбента.

Патент WO-A-2009/156430A1 описывает способ очистки фактора FVIII с использованием смешанной или мультимодальной смолы. Данный способ очистки основан на приведении в контакт белка FVIII в растворе с большой ионной силой с мультимодальной или смешанной смолой, содержащей лиганды с гидрофобной и отрицательно-заряженной частями, и элюировании обозначенного белка FVIII в элюирующем буфере с содержанием, по меньшей мере, одной аминокислоты, позитивно заряженной при рН 6-8.

Для улучшения продуктов, содержащих FIX, была использована аффинная хроматография, специфичная к молекуле FIX, эффективно удаляющая примеси и обеспечивающая FIX высокой степени чистоты. Недостаток часто используемой иммуно-аффинной хроматографии заключался в том, что она относительно дорогая и что в качестве лигандов использовались моноклональные антитела животного происхождения.

В середине 80-х были случаи передачи вирусов через продукты, содержащие FIX из плазмы крови. Даже если данная проблема решалась путем применения специальных стадий сокращения количества вирусов, именно это послужило началом для разработки продуктов с рекомбинантно полученным FIX (rFIX). В 90-е был зарегистрирован единственный на сегодняшний день продукт с rFIX.

Один объект изобретения относится к способу, с помощью которого можно избежать недостатков способов очистки витамин К-зависимых белков, в особенности FIX, при предшествующем уровне техники. Как известно из предшествующего уровня техники, одним недостатком обычных ионообменных хроматографических смол (к примеру, SP-, CM-, Q- или DEAE Sepharose FF ионообменных хроматографических смол) является то, что связывание белка со смолой может проводиться только при относительно низкой концентрации соли (проводимости) и рН, обычно в диапазоне концентрации соли 0,01-0,15М (NaCl и т.д.). Оптимальный диапазон рН зависит от того, используется ли катионо- или анионообменная смола, и от изоэлектрической точки целевого продукта, который связывается со смолой. Обычно диапазон рН, при котором целевой белок связывается с ионообменной смолой, как правило, составляет приблизительно плюс-минус одну единицу рН от изоэлектрической точки целевого белка.

В некоторых практических задачах необходимо иметь возможность использовать относительно мягкие условия очистки, которым на стадии ионообменной хроматографии подвергаются белки, а также напрямую (без дальнейшего разведения) хроматографическая смола при некоторой увеличенной ионной силе и при рН вне нейтрального диапазона, которые не могут быть использованы для обычной ионообменной хроматографии.

Мультимодальная (или смешанная) хроматография представляет собой способ очистки белков. Он описан, к примеру, в спецификации производителя GE Healthcare (11-0035-45AA) Capto Adhere, спецификации производителя GE Healthcare (28-9078-88AA) Capto MMC и в патенте WO-A-2009/024620 «Способ выделения и очистки целевого белка без содержания прионных белков». Недостатком способа является то, что элюирование часто проводится в жестких условиях, таких как, например, значение рН ниже или выше нейтрального, одном или в комбинации с другими условиями элюирования, такими как, например, этиленгликоль, и как, например, описанными в патенте WO-A-2009/007451.

Повышенная ионная сила может быть в значительной степени благоприятной для стабильности белка в растворе, в особенности в выработке неочищенного белка, такой как получение рекомбинантных белков или белков из плазмы крови, при которой в растворе присутствуют потенциальные протеазы, которые могут отрицательно влиять на целевой белок.

Лучше всего протеазы работают при физиологических условиях (как и в случае большинства клеточных систем), т.е. при приблизительном значении рН 7 и приблизительной концентрации соли 0,15М, смена этих условий может быть благоприятной для уменьшения действия протеаз. Такие изменения обычно могут достигаться добавлением соли и/или изменением рН. Оба эти параметра очень важны для проведения стадии обычной ионообменной хроматографии, и поэтому их изменения часто невыполнимы. Таким образом, другой объект изобретения относится к способу, в котором эта проблема решена и представлена возможность добавления соли и/или изменения рН в неочищенных образцах белка, потенциально содержащих протеолитические факторы, такие как протеазы, способные деградировать целевой белок. Описанный способ должен в дальнейшем позволить обработку раствора белка за как можно меньшее количество стадий и связывание целевого белка с хроматографической смолой. Этот способ будет оптимизированным стадией концентрации и очистки целевого белка из неочищенного образца или дальнейшей последующей очисткой с использованием, к примеру, других хроматографических стадий, таких как аффинная хроматография.

Эта необходимость крайне важна, поскольку деградация целевого белка во время очистки будет предотвращаться или как минимум снижаться.

Этот способ дает возможность удалить протеазы и другие примеси, которые могут присутствовать в неочищенном образце, перед элюированием целевого белка.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу очистки витамин К-зависимого белка, такого как FIX; в частности, начиная со сбора культуры клеток, содержащих рекомбинантно полученный FIX.

Согласно настоящему изобретению объект настоящего изобретения относится к способу очистки витамин К-зависимого белка, такого как FIX в последовательной очистке с использованием хроматографии, в которой

- по меньшей мере, одну стадию хроматографии выполняют с использованием мультимодальной смолы,

- витамин К-зависимый белок, такой как FIX, связывается с указанной мультимодальной смолой, и

- витамин К-зависимый белок, такой как FIX, элюируют с мультимодальной смолы при рН 6-9 буфером, содержащим аргинин.

Известно семь гликопротеинов плазмы крови, биосинтез которых зависит от витамина К. Эти белки - протромбин (фактор II), фактор VII, фактор IX, фактор X, C-белок, S-белок и Z-белок. Наличие Gla-домена является общей структурной особенностью всех указанных витамин К-зависимых белков и сразу после Gla-домена у каждого из указанных белков (за исключением протромбина) идет один или более доменов, подобных эпидермальному фактору роста. Для выполнения своей физиологической функции витамин К-зависимым белкам требуются ионы кальция Ca²⁺, и кальций-связывающие сайты включают в себя как минимум Gla-домены и домены, подобные эпидермальному фактору роста. Присоединение кальция обеспечивает у данных белков возможность связываться с фосфолипидами/клеточными мембранами и таким образом проявлять свою биологическую активность.

Настоящее изобретение с использованием мультимодальной смолы в качестве стадии связывания/очистки относится к возможности регулирования концентрации соли и значения рН до значений, снижающих до минимума риск наличия активных протеаз в растворе белка во время связывания целевого белка на стадии мультимодальной хроматографии.

Преимуществом способа, описанного в настоящем изобретении, является возможность дальнейшего использования стадии очистки перед элюированием целевого белка после связывания целевого белка с мультимодальной смолой, используемого, к примеру, в качестве стадии связывания в рекомбинантном процессе. Достигается это использованием мультимодальной смолы для промывки и выбором подходящего промывочного буфера с целью удаления протеаз и других примесей, которые осаждаются на мультимодальной смоле, перед элюированием целевого белка. Подходящий промывочный буфер, предпочтительно, содержит соль, или аминокислоту, или буферное соединение, или их смесь при рН, все же достаточном для ингибирования протеазной активности на стадии очистки.

Способ, описанный в настоящем изобретении, дает возможность элюировать целевой белок, связанный с мультимодальной смолой, в мягких условиях с особыми характеристиками элюирования (к примеру, в как можно меньшем объеме). Это было достигнуто повышением значения рН, или повышением концентрации соли, или добавлением аминокислоты, или их комбинации. Способ, описанный в настоящем изобретении, имеет такие преимущества, как ингибирование агрегатов, сохранение изначальной структуры молекулы и получение малого объема для дальнейших последующих манипуляций.

Настоящее изобретение также обеспечивает проведение способа очистки без добавления стабилизирующих добавок человеческого или животного происхождения и применение способа очистки без их использования (иммуно-аффинные смолы на основе моноклональных антител). Использование мультимодальной смолы, в особенности на стадии связывания целевых белков, обеспечивает также более высокую связывающую способность по сравнению с обычными ионообменными смолами, что дает в результате более концентрированный элюат продукта с колонки, что в свою очередь является благоприятным фактором для стабильности продукта.

Согласно одному воплощению настоящего изобретения мультимодальная хроматография проводится на хроматографической колонке. Это может выступать в качестве первой стадии связывания целевых белков. Способ, описанный в настоящем изобретении, может также проводиться в несколько стадий.

В одном воплощении настоящего изобретения хроматография на мультимодальной смоле объединяется с хроматографией на смоле с аффинным лигандом, экспрессированным в дрожжах, предоставляя чистоту витамин К-зависимого белка, такого как FIX, после элюирования более 90%.

В другом дальнейшем воплощении настоящего изобретения стадия с использованием мультимодальной смолы и стадия хроматографии с использованием смолы с аффинным лигандом, экспрессированным в дрожжах, объединяются с другой стадией очистки, чтобы достичь окончательной чистоты более чем 99% витамин К-зависимого белка, такого как белок FIX.

Объектом изобретения является также композиция, содержащая очищенный витамин К-зависимый белок, такой как FIX, полученный способом, описанным в настоящем изобретении (без добавления или применения любых добавок человеческого или животного происхождения, таких как альбумин или иммунноаффинные лиганды на основе моноклональных антител).

В другом воплощении настоящего изобретения мультимодальная смола содержит части, связанные с матрицей, и части, способные взаимодействовать с витамин К-зависимым белком, таким как FIX, содержащимся в смеси, с помощью ионных взаимодействий и взаимодействий другого типа, таких как водородная связь, гидрофобное или тиофильное взаимодействие.

В другом воплощении настоящего изобретения аффинный лиганд представляет собой экспрессированный в дрожжах фрагмент F_ab антитела к витамин К-зависимому белку, такому как FIX.

В еще одном воплощении настоящего изобретения стадия с использованием мультимодальной смолы применяется для связывания витамин К-зависимого белка, такого как FIX, из неочищенного раствора белка, на котором после обработки финального элюата с мультимодальной хроматографической смолой на стадии аффинной хроматографии с применением лиганда, экспрессированного в дрожжах, и дальнейшего элюирования витамин К-зависимого белка, такого как FIX, после описанной стадии аффинной хроматографии достигает чистоты более 90% по отношению к белкам и ДНК.

В другом последующем воплощении настоящее изобретение характеризуется чистотой конечного продукта более 99% в том случае, если стадия с использованием мультимодальной смолы проводится для связывания витамин К-зависимого белка, такого как FIX, из неочищенного раствора белка, где полученный с мультимодальной хроматографической смолой элюат проходит обработку на дополнительной хроматографической стадии(ах), выбранной из эксклюзионной хроматографии, анионного обмена, катионного обмена, гидрофобного взаимодействия и аффинной хроматографии на основе иммобилизованного металла и аффинных лигандов, экспрессированных в дрожжах.

Также в другом воплощении настоящего изобретения смесь, содержащая витамин К-зависимый белок, такой как FIX, присутствует в растворе.

В другом воплощении настоящего изобретения витамин К-зависимый белок, такой как FIX, содержится в растворе неочищенного белка, возможно включающем протеазы, которые могут деградировать продукт.

Значительное преимущество может давать нанесение промывочного буфера на мультимодальную смолу для очистки примесей (протеаз, ДНК и т.д.) и задерживания витамин К-зависимого белка, такого как FIX, до элюирования с колонки.

В дополнительном воплощении настоящего изобретения мультимодальная смола промывается промывочным буфером с рН 6-9 перед элюированием витамин К-зависимого белка, такого как FIX.

В следующем воплощении настоящего изобретения элюирование проводится с использованием аргинина в качестве элюирующего агента. Согласно настоящему изобретению, элюирующий агент может комбинироваться с повышенной концентрацией соли, где соль выбирается из ряда Гофмейстера. Согласно настоящему изобретению элюирование может проводиться либо только с аргинином, либо в комбинации с повышенной концентрацией соли, либо только с повышенной концентрацией соли, и в любом из этих вариантов рН равно 6-9, в частности, рН равно 7,0.

Согласно настоящему изобретению предпочтительно использование NaCl и KCl из солей ряда Гофмейстера, к которым, к примеру, относятся натрий, калий, аммоний, магний, кальций, барий, ацетат, фосфат и сульфат.

Согласно настоящему изобретению концентрация аргинина лежит, в частности, в промежутке от приблизительно 0,1М до приблизительно 2М, и от 0,1М до 4М разнится концентрация соли из ряда Гофмейстера; в частности, в промежутке от приблизительно 0,4М до приблизительно 1,5М для аргинина, и от 0,6М до 2М концентрация соли из ряда Гофмейстера или в промежутке от приблизительно 0,3М до приблизительно 0,7М для аргинина, и от 0,8М до 1,2М для соли из ряда Гофмейстера.

Согласно другому воплощению настоящего изобретения витамин К-зависимый белок, такой как FIX, связывается с мультимодальной смолой при рН 6-9, в частности, при рН 7,0.

В следующем воплощении настоящего изобретения используемое буферное вещество содержит предпочтительно, по меньшей мере, одно вещество, выбранное из группы, состоящей из цитрата натрия, гистидина, 2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил)этансульфоновой кислоты (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), Трис-основания и ацетата натрия, в частности в промежутке значений рН от приблизительно 6 до приблизительно 9.

В способе, описанном в настоящем изобретении, неионный детергент может присутствовать в любом используемом буфере, указанный неионный детергент, в частности, выбран из группы, состоящей из Полисорбата (Полисорбат 20, 40, 60, 80) и Плюроника F68.

В элюирующем буфере значение рН равно 6-9, предпочтительно, рН 7,0, количество аргинина обычно находится в пределах от 0,1 до 2М, в частности 0,5М.

В элюирующем буфере значение рН равно 6-9, предпочтительно, рН 7,0, хлорид натрия добавлен в концентрации 0,1-4М, в частности в пределах от 0,05 до 0,3М.

В элюирующем буфере значение рН равно 6-9, предпочтительно, рН 7,0, аргинин и хлорид натрия добавлены в пределах 0,1-0,5М, в частности в пределах от 0,3 до 0,7М.

В промывочном буфере значение рН равно 6-9, предпочтительно, рН 7,0, хлорид натрия добавлен в пределах 0,01-0,3М, в частности в пределах от 0,05 до 0,15М.

Количество неионного детергента обычно находится в пределах от 0,001 до 1%, в частности в буферах для мультимодальной хроматографии 0,02%.

Мультимодальная хроматографическая смола, которая может применяться в соответствии с настоящим изобретением, может содержать, по меньшей мере, одно из следующих соединений:

а) положительно заряженный лиганд N-бензил-N-метилэтаноламина,

b) отрицательно заряженный лиганд 2-(бензоиламино)бутановой кислоты,

с) лиганд фенилпропила,

d) лиганд N-гексила,

e) лиганд 4-меркаптоэтилпиридина,

f) лиганд 3-((3-метил-5-((тетрагидрофуран-2-илметил)амино)фенил)амино)бензойной кислоты, или их комбинаций.

В частности, для использования в соответствии с настоящим изобретением мультимодальная хроматографическая смола выбирается из коммерчески доступных смол HEP Hypercel^TM; PPA Hypercel^TM; Capto Adhere^TM; Capto MMC^TM; MEP Hypercel^TM.

В другом воплощении способа, описанного в настоящем изобретении, стадия мультимодальной хроматографии объединяется со стадией аффинной хроматографии витамин К-зависимого белка, такого как FIX, в котором аффинность обеспечивается белковым лигандом, таким как фрагмент экспрессированного, к примеру, в дрожжах, антитела.

В другом воплощении настоящего изобретения последовательность очистки может далее содержать стадии удаления/инактивации патогенов, состоящих из стадии химической инактивации, стадии эксклюзионной хроматографии, хроматографические стадии или их комбинации, основанные на различных физиологических свойствах удаляемого патогена. Подробно описанным в литературе примером стадии инактивации патогена является химический способ растворителя/детергента, к примеру, на основе три-N-бутилфосфата и Triton X-100, разрушающих все вирусы с липидной оболочкой, который описан в патенте ЕР-А-131 740. Примером стадии удаления патогена в зависимости от размера является нанофильтр со средним размером поры приблизительно 20 нм, такой как фильтр Planova 20. В основе другого примера удаления патогена лежит хроматография. К примеру, известно, что аффинная хроматография в общем случае повышает качество удаления патогена, к примеру, хроматография витамин К-зависимого белка, такого как FIX, с использованием смолы с лигандом, экспрессированным в дрожжах.

В частном воплощении способа, описанного в настоящем изобретении, последовательность очистки дополнительно включает следующие стадии:

1) катионая мультимодальная смола, такая как Capto MMC;

2) стадия химической инактивации вирусов с липидной оболочкой, в частности, в процессе инактивации способом растворителя/детергента, включающего три-N-бутилфосфат и Triton X-100, как описано в патенте ЕР-А-131 740;

3) аффинная смола, на основе лиганда, экспрессированного в дрожжах;

4) катионообменная смола, такая как SP Sepharose или Resource S;

5) стадия удаления патогена через фильтр со средним размером пор приблизительно 20 нм, таким как Planova 20N;

6) стадия смены буфера и/или концентрирования, такая как ультрафильтрация с пределом исключения 10 кДа;

7) смола для эксклюзионной хроматографии, такая как Superdex 200.

В частном воплощении способ, описанный в настоящем изобретении, может содержать следующие стадии;

- Мультимодальная смола Capto MMC^TM помещена в колонку и уравновешена буфером, содержащим 20 мМ цитрата натрия, 0,1М NaCl, 0,02% Полисорбат-80 со значением рН 7,0;

- Образец неочищенного витамин К-зависимого белка, такого как FIX, наносился в условиях, приблизительно схожих с условиями уравновешивающего буфера, описанного выше, и целевой белок с некоторыми дополнительными белковыми примесями связывался с колонкой;

- Стадия очистки, согласно настоящему изобретению, в которой уравновешивающий буфер наносился на колонку для ингибирования протеолитической активности и удаления протеаз, ДНК и других примесей, при этом витамин К-зависимый белок, такой как FIX, оставался связанным на колонке;

- Витамин К-зависимый белок, такой как FIX, элюировался, согласно настоящему изобретению, уравновешивающим буфером с добавлением 0,5М аргинина и откорректированным значением рН 7,0 для достижения стабильного, без агрегатов, витамин К-зависимого белка, такого как FIX, в малом объеме.

Мультимодальная (или смешанная) хроматография представляет собой способ очистки белков. Способ описан, к примеру, в спецификации производителя GE Health Care (11-0035-45АА) Capto Adhere, в спецификации производителя GE Health Care (28-9078-88АА) Capto MMC и в патенте WO-A-2009/024620 «Способ выделения и очистки целевого белка без содержания прионных белков».

Ранее описанного недостатка мультимодальной хроматографии можно избежать с помощью мягких условий элюирования в диапазоне рН, близкого к нейтральному, который сохраняет активность витамин К-зависимого белка, такого как молекула FIX, и дает возможность объединять мультимодальную хроматографию со стабилизирующим эффектом повышенной концентрации соли, описанным, к примеру, в патенте ЕР-А-1707634.

Согласно одному из воплощений настоящего изобретения мультимодальная хроматография может проводиться на хроматографической колонке. Это может относиться к первой стадии связывания молекул. Способ, описанный в настоящем изобретении, может проходить в несколько стадий. Настоящее изобретение также обеспечивает способ очистки без добавления стабилизирующих добавок человеческого или животного происхождения, и к применению всего способа очистки без их использования (иммуно-аффинные смолы на основе моноклональных антител). Применение мультимодальной смолы, в особенности на стадии связывания молекул, способствует более высокой связывающей способности по сравнению с обычными ионообменными смолами, что в результате дает более концентрированный элюат продукта на этой стадии, что в свою очередь благоприятно влияет на стабильность продукта.

Способ, описанный в настоящем изобретении, как правило, относится к очистке рекомбинантного витамин К-зависимого белка, такого как FIX (rFIX).

В другом воплощении способа, описанного в настоящем изобретении, стадия мультимодальной хроматографии комбинируется со стадией аффинной хроматографии витамин К-зависимого белка, такого как FIX, в котором аффинность обеспечивается белковым лигандом, таким как фрагмент антитела, экспрессированный в дрожжах.

Также объектом изобретения является композиция, содержащая очищенный рекомбинантный витамин К-зависимый белок, такой как FIX, полученный способом, описанным в настоящем изобретении (без добавления или использования добавок человеческого или животного происхождения, таких как иммуноаффинные лиганды на основе альбумина или моноклональных антител).

Настоящее изобретение описывается, но не ограничивается, нижеследующими примерами.

Примеры

ОПИСАНИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ СПОСОБОВ

Анализ биологической активности фактора IX (одностадийный анализ коагулирующей активности)

Биологическая активность фактора IX оценивалась одностадийным анализом коагулирующей активности, и количество фактора IX выражалось в Международных единицах измерения (МЕ), как требует действующий стандарт Всемирной организации здравоохранения для концентрата фактора IX.

Способ одностадийного анализа коагулирующей активности описан в Европейской Фармакопее. Принцип данного анализа основан на способности образца, содержащего фактор IX, корректировать время коагуляции плазмы с дефицитом фактора IX в присутствии фосфолипидов, контактного активатора и ионов кальция. Время образования сгустка фибрина определяется за одну стадию. Активность фактора IX обратно пропорциональна времени коагуляции. Анализ проводился на приборе Siemens BCS XP.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-Page) (молекулярно-массовое распределение)

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) предполагает разделение белков в соответствии с их размером. Этот способ описывает SDS-PAGE белков в восстанавливающих условиях. Нагревание образца в денатурирующих и восстанавливающих условиях приводит к разворачиванию белка и связыванию с ним молекул анионного детергента додецилсульфата натрия (SDS), обеспечивающих высокий суммарный отрицательный заряд, пропорциональный длине полипептидной цепи. При нанесении на матрицу полиакриламидного геля и приложении электрического поля, отрицательно заряженные молекулы белка движутся к позитивно заряженному электроду и разделяются благодаря эффекту молекулярного сита, т.е. в соответствии со своим молекулярным весом. Полиакриламидный гель задерживает большие молекулы, не позволяя им двигаться так же быстро, как более мелкие молекулы. Поскольку у SDS-денатурированных полипептидов отношение заряда к массе примерно одинаково, конечное разделение белков зависит практически полностью от различий относительной молекулярной массы полипептидов. В однородном геле относительное расстояние перемещения белка (R_f) обратно пропорционально логарифму его массы. Если белки известной массы движутся вместе с неизвестными белками, то возможно определить зависимость между R_f и массой и вычислить массы неизвестных белков. Полоски разделенных в электрофорезе белков визуализируются с помощью окрашивания серебром. Результаты оцениваются визуально по проявлению стандартных, референсных (контрольных) и анализируемых образцов.

Фактор IX из плазмы крови

Материалом для описанных экспериментов служит коммерчески доступный продукт Nanotiv^®, который представляет собой обработанный способом растворителя/детергента и прошедший нанофильтрацию концентрат фактора IX.

Рекомбинантный фактор IX

Приготовление суспензии клеток, содержащих FIX

Клетки

Используемая клеточная линия представляет собой человеческие эмбриональные клетки почки 293 (НЕК 293), адаптированные к росту в бессывороточной среде. Клетка-хозяин, НЕК 293F, была стабильно трансфицирована экспрессионным конструктом, несущим кодирующую последовательность кДНК человеческого FIX и человеческого фурина (согласно методологии PACE получения продукта отличного качества и с оптимальной продолжительностью цикла). Оба конструкта содержат одинаково сильный промотор. Основные принципы способа также описаны в патенте ЕР-А-1739179 (Schroder и коллеги).

Способ культивирования

Клетки культивировались в бессывороточной среде на стандартном оборудовании и с использованием стандартных способов, известных в данной области техники, к примеру, качания или перемешивания культур в культуральных флаконах (Т-колбах), культуральных колбах и биореакторах (одноразовых системах и обычных контейнерах с системой перемешивания) в периодических, подпитываемых, проточных или непрерывных хемостатных культурах (Freshney, R I (2000), Culture of animal cells: a manual of basic technique, 4^th ed, Wiley-Liss; Spier, R E ed (2000), Encyclopedia of cell technology, Wiley, New York, S-O and Haggstrom, L (2000), Bioprocess technology: fundamentals and applications, Hogskoletryckeriet, Royal Institute of Technology, Stockholm; Vinci, V A and Parekh, S R (2003), Handbook of industrial cell culture: mammalian, microbial, and plant cells, Humana Press, USA). Обычно использовалась проточная доставка среды для повышения числа клеток и концентрации продукта по сравнению с показателями стандартной периодической культуры. Выход продукта и количество белков клетки-хозяина отличаются в зависимости от способа культивирования:

- концентрация продукта обычно увеличивается с числом клеток

- общее содержание белка и ДНК увеличивается с числом клеток

- общее содержание белка и ДНК также увеличивается с продолжительностью роста культуры

- в периодических культурах накапливается белок и ДНК; ничего не добавляется, ничего не удаляется

- проточная среда промывает культуру клеток от метаболитов, белка, ДНК и других примесей; для сбора клеток обычно использовались фильтры или клеточные центрифуги.

Рекомбинантно полученный продукт высвобождается из клеток, и суспензия клеток или ее супернатант собираются. Качества собранного материала (концентрации продукта и примесей, как указано выше) отличаются в зависимости от спо