Комбинации, включающие белки cry34ab/35ab и сry3ba, для предотвращения развития устойчивости у кукурузных корневых жуков (diabrotica spp.)

Комбинации, включающие белки cry34ab/35ab и сry3ba, для предотвращения развития устойчивости у кукурузных корневых жуков (diabrotica spp.)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Люди выращивают кукурузу для применения в пищу и в качестве источника энергии. Кукуруза представляет собой важную сельскохозяйственную культуру. Она является важным источником пищи, пищевых продуктов и корма для животных во многих регионах мира. Насекомые употребляют в пищу и повреждают растения и, таким образом, подрывают эти усилия людей. Ежегодно миллиарды долларов тратятся для борьбы с насекомыми-вредителями, и еще миллиарды теряются вследствие причиняемого ими ущерба.

Вред, приносимый насекомыми-вредителями, является основным фактором потери урожаев кукурузы во всем мире, несмотря на использование защитных мер, таких как химические пестициды. В связи с этим, в сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза, методами генной инженерии были введены гены устойчивости к насекомым для борьбы с ущербом, наносимым насекомыми, и для снижения потребности в традиционных химических пестицидах.

Ежегодно, более 10 миллионов акров (более 4050000 га) кукурузных полей в США заражаются комплексом видов кукурузного корневого жука. Комплекс видов кукурузного корневого жука включает северного кукурузного корневого жука (Diabrotica barberi), южного кукурузного корневого жука (D. undecimpunctata howardi) и западного кукурузного корневого жука (D. virgifera virgifera). (Другие виды включают Diabrotica virgifera zeae (Мексиканский кукурузный корневой жук), Diabrotica balteata (Бразильский кукурузный корневой жук), и комплекс Бразильского кукурузного корневого жука (Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa).

Обитающие в почве личинки этих видов Diabrotica питаются корнями растений кукурузы, вызывая полегание. Полегание, в конечном счете, снижает урожайность и часто приводит к гибели растения. Потребляя в пищу, пестичные столбики кукурузы, взрослые жуки уменьшают опыление и, поэтому, пагубно воздействуют на зерно кукурузного растения. Кроме того, взрослые особи и личинки рода Diabrotica атакуют тыквенные культуры (огурцы, дыни, тыквы и т.д.) и многие овощные и полевые культуры в промышленном растениеводстве, а также такие, которые выращиваются в приусадебных огородах.

Синтетические органические химические инсектициды были первоочередными инструментами, используемыми для борьбы с насекомыми-вредителями, но биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), играли важную роль в некоторых регионах. Способность получения устойчивых к насекомым растений посредством трансформации генами инсектицидного белка Bt радикально изменила современное сельское хозяйство и повысила значение и ценность инсктицидных белков и их генов.

Инсектицидные кристаллические белки из некоторых штаммов Bacillus thuringiensis (B.t.) хорошо известны в данной области техники. См., например, Hofte et al, Microbial Reviews, Vol. 53, No. 2, pp. 242-255 (1989). Эти белки обычно продуцируются бактериями в виде протоксинов с молекулярной массой приблизительно 130 кДа, которые затем расщепляются протеазами в средней кишке насекомых после попадания в пищеварительную систему насекомого для продукции корового токсина с молекулярной массой приблизительно 60 кДа. Эти белки известны как кристаллические белки, потому что в некоторых штаммах B.t. могут наблюдаться отчетливые кристаллические включения со спорами. Эти кристаллические включения часто составлены из нескольких различных белков.

Одной группой генов, которые использовались для получения трансгенных, устойчивых к насекомым культур, являются дельта-эндотоксины из Bacillus thuringiensis (B.t.). Дельта-эндотоксины были успешно экспрессированы в таких сельскохозяйственных культурах как хлопок, картофель, рис, подсолнечник, а также кукуруза, и, как оказалось, обеспечивают превосходный контроль над насекомыми-вредителями. (Perlak, F.J et al. (1990) Bio/Technology 8, 939-943; Perlak, F.J. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 313-321; Fujimoto H. et al. (1993) Bio/Technology 11: 1151-1155; Tu et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 1101-1104; PCT публикация международной патентной заявки WO 01/13731; и Bing J W et al. (2000) Efficacy of Cry IF Transgenic Maize, 14^th Biennial International Plant Resistance to Insects Workshop, Fort Collins, Colo.).

Несколько белков Bt использовались для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые были успешно зарегистрированы и в настоящее время запущены в серийное производство. Они включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1F, Cry3Aa и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке и Cry3A в картофеле. Имеется также SMART STAX в кукурузе, который содержит Cry1A.105 и Cry2Ab.

Выпускаемые в промышленном масштабе продукты, экспрессирующие эти белки, экспрессируют один белок, за исключением случаев, где желателен комбинированный инсектицидный спектр из 2 белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в кукурузе, комбинированные для обеспечения устойчивости к чешуекрылым вредителям и блошке длинноусой? соответственно), или где независимое действие белков делает их полезными в качестве инструмента для задержки развития устойчивости у популяций восприимчивых насекомых (например, Cry1Ac и Cry2Ab в хлопке, комбинированные для обеспечения управления устойчивостью в отношении табачной совки).

Некоторые из качеств устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широко распространенному принятию этой технологии, также вызывают озабоченность, что у популяций вредителей разовьется устойчивость к инсектицидным белкам, продуцируемым этими растениями. Было предложено несколько стратегий для сохранения полезности признаков устойчивости к насекомым на основе Bt, которые включают размещение белков в высокой дозе в комбинации с резерватом, чередование с различными токсинами или совместное размещение с ними (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management," Nature Biotechnol. 16: 144-146).

Белки, выбранные для использования в пакете Управления устойчивости к насекомым (IRM) должны быть активными с тем, чтобы устойчивость, развившаяся к одному белку, не придавала устойчивость ко второму белку (т.е. перекрестная устойчивость к белкам отсутствует). Если, например, популяция вредителей, выбранная для устойчивости к «белку A», чувствительна к «белку B», то можно сделать вывод, что нет перекрестной устойчивости, и что комбинация белка A и белка B будет эффективной в задержке устойчивости к одному белку A.

В отсутствие устойчивых к насекомым популяций, оценки могут осуществляться на основании других характеристик, считающихся связанными с потенциалом перекрестной устойчивости. При идентификации инсектицидных белков с вероятностью отсутствия проявления перекрестной устойчивости было предложено использование рецепторно опосредованного связывания (van Mellaert et al. 1999). Ключевым прогностическим показателем отсутствия перекрестной устойчивости, присущим этому подходу, является то, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у чувствительного вида насекомых.

В случае, когда токсины Bt конкурируют за один и тот же рецептор, то если этот рецептор мутирует в этом насекомом, так что один из токсинов больше не связывается с этим рецептором и, таким образом, больше не является инсектицидным против насекомого, то в этом случае, насекомое будет также устойчиво ко второму токсину (который конкурентно связан с тем же рецептором). То есть, насекомое считается перекрестно устойчивым к обоим токсинам Bt. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это может быть показателем того, что насекомое не будет одновременно устойчивым к этим двум токсинам.

Относительно более новая система инсектицидного белка была выявлена у Bacillus thuringiensis, как описано в международном патенте WO 97/40162. Эта система содержит два белка - один массой приблизительно 15 кДа, и другой массой приблизительно 45 кДа. См. также патенты США 6083499 и 6127180. Теперь эти белки были отнесены к их собственному классу и, соответственно, получили обозначение Cry соответственно Cry34 и Cry35. См. Crickmore et al. сайт интернета (biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время обнаружены многие другие родственные белки этого типа системы. См., например, патент США 6372480; международные патенты WO 01/14417 и WO 00/66742. Были также описаны оптимизированные для растений гены, которые кодируют такие белки, где гены созданы методами генной инженерии для использования кодонов для оптимизированной экспрессии у растений. См. например патент США 6218188.

Точный тип действия системы Cry34/35 еще предстоит определить, но полагают, что она образует поры в мембранах клеток кишечника насекомых. См. Moellenbeck et al, Nature Biotechnology, vol. 19, p. 668 (July 2001); Masson et al., Biochemistry, 43 (12349-12357) (2004). Точный механизм действия остается неясным, несмотря на трехмерные атомарные координаты и структуры кристаллов, известные для белка Cry34 и Cry35. См. патенты США 7524810 и 7309785. Например, неясно, один или оба из этих белков связываются с конкретным видом рецептора, такого как щелочная фосфатаза или амиопептидаза.

Кроме того, ввиду того, что существуют различные механизмы, посредством которых у насекомого может развиться устойчивость к белку Cry (такие как измененным гликозилированием рецептора [см. Jurat-Fuentes et al. (2002) 68 AEM 5711-5717], удалением рецепторного белка [см. Lee et al. (1995) 61 AEM 3836-3842], мутированием рецептора или другими механизмами [см. Heckel et al., J. Inv. Pathol. 95 (2007) 192-197]), было невозможно заведомо прогнозировать, будет ли существовать перекрестная устойчивость между Cry34/35 и другими белками Cry. Прогнозирование конкурентного связывания для системы Cry34/35 также дополнительно осложняется тем, что два белка вовлечены в бинарную систему Cry34/35. Кроме того, неясно, связываются ли и насколько эффективно связываются эти белки с кишечником/клетками кишечника, и взаимодействуют ли они и как взаимодействуют или связываются друг с другом.

Другие варианты для борьбы с жесткокрылыми насекомыми включают следующие белки: Cry3Bb, Cry3C, Cry6B, ET29, ET33 с ET34, TIC407, TIC435, TIC417, TIC901, TIC1201, ET29 с TIC810, ET70, ET76 с ET80, TIC851 и другие. Были также предложены подходы РНКi (интерференции РНК). См. например, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится частично к Cry34Ab/35Ab в комбинации с Cry3Ba. Настоящее изобретение относится частично к удивительному открытию, что Cry34Ab/Cry35Ab и Cry3Ba могут использоваться для предотвращения развития устойчивости (к любой системе инсектицидного белка отдельно) у популяции кукурузного корневого жука (Diabrotica spp.). Как будет понятно специалисту в данной области после ознакомления с благоприятными аспектами раскрытого в настоящем описании изобретения, растения, продуцирующие эти инсектицидные Cry-белки, могут использоваться для уменьшения опасений того, что может развиться популяция кукурузного корневого жука, которая может быть устойчивой к любой из этих систем инсектицидного белка отдельно.

Настоящее изобретение частично подтверждается обнаружением того, что компоненты этих систем белка Cry не конкурируют друг с другом за связывание с рецепторами кишечника кукурузного корневого жука.

Настоящее изобретение также частично относится к тройным пакетам или «пирамидам» из трех (или более) систем токсинов, причем парой оснований являются Cry34Ab/Cry35Ab и Cry3Ba. Таким образом, растения (и посевная площадь, засаженная такими растениями), которые продуцируют эти две системы инсектицидных белков, включены в объем настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Подробное описание фигур в частности относится к сопровождающим фигурам, на которых:

Фиг.1A. Связывание ¹²⁵I-Cry35Ab1 как функция внесенных меченных радиоактивным изотопом Cry-токсинов в BBMV (мембранных пузырьках щеточной каемки), полученных из личинок западных кукурузных корневых жуков. Специфическое связывание=общее связывание-неспецифическое связывание, «усы»=SEM (стандартная ошибка средней).

Фиг.1В. Связывание ¹²⁵I-Cry35Ba1 как функция внесенных меченных радиоактивным изотопом Cry-токсинов в BBMV, полученных из личинок западных кукурузных корневых жуков. Специфическое связывание=общее связывание-неспецифическое связывание, «усы»=SEM (стандартная ошибка средней).

На Фиг.1А-1В указано связывание ¹²⁵I-Cry35Abl (А) и ¹²⁵I-Cry3Bal (В) как функция внесенных меченых радиоактивным изотопом Cry-токсинов (нМ) в BBMV (мембранных пузырьках щеточной каемки) в концентрации 0,1 мг/мл, полученных из личинок западных кукурузных корневых жуков. Специфическое связывание = общее связывание - неспецифическое связывание, «усы» = SEM (стандартная ошибка средней). Cry35Abl: химотрипсинизированная сердцевина (40 кДа); и Cry3Bal: трипсинизированная сердцевина (55 кДа).

Фиг.2. Связывание ¹²⁵I-Cry35Ab1 с BBMV, полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, при различных концентрациях немеченого конкурента (log 0,1=-1,0, log 10=1,0, log100=2,0, log1000=3,0).

Связывание ¹²⁵I-Cry35Abl в присутствии Cry34Abl (1:50 = молярное отношение ¹²⁵I-Cry35Abl: Cry34Abl) как функция вносимого меченого радиоактивным изотопом Cry35Abl (нМ) в BBMV в концентрации 0,03 мг/мл, полученных из личинок западных кукурузных корневых жуков. Специфическое связывание = общее связывание - неспецифическое связывание, «усы» = SEM (стандартная ошибка средней). Cry35Abl: химотрипсинизированная сердцевина (40 кДа)

Фиг.3А. Связывание в процентах ¹²⁵I-Cry35Abl с BBMV,

полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, в отсутствие Cry34Ab1.

Фиг.3В. Связывание в процентах ¹²⁵I-Cry35Ab1 с BBMV, полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, в присутствии Cry34Ab1.

Процентная доля первоначального специфического связывания ¹²⁵I-Cry35Abl с BBMV в концентрации 0,1 мг/мл (панель А) или в концентрации 0,03 мг/мл (панель В), полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, при различных концентрациях немеченых конкурентов, инкубированных с 5 нМ ¹²⁵I-Cry35Abl отдельно (панель А) или с 250 нМ Cry34Abl+5 нМ Cry35Abl (панель В). Cry34Abl: полной длины (14 кДа); Cry35Abl: химотрипсинизированная сердцевина (40 кДа); и Cry3Bal: трипсинизированная сердцевина (55 кДа); Iog0,1=-1,0, log1=0, log10=1,0, log100=2,0, log1000=3,0.

Фиг.4. Связывание в процентах ¹²⁵I-Cry3Ba1 с BBMV, полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, в присутствии различных концентраций варьирующихся немеченых конкурентов.

Процентная доля первоначального специфического связывания ¹²⁵I-Cry3Bal с BBMV в концентрации 0,1 мг/мл, полученными из личинок западных кукурузных корневых жуков, при различных концентрациях немеченых конкурентов, инкубированных с 5 нМ ¹²⁵I-Cry3Bal. Cry34Abl: полной длины (14 кДа); Cry35Abl: химотрипсинизированная сердцевина (40 кДа); и Cry3Bal: трипсинизированная сердцевина (55 кДа); log 0,1=-1,0, log 1=0, log10=1,0, log100=2,0, log1000=3,0.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO:1: Полная последовательность нативного белка Cry35Ab1.

SEQ ID NO:2: Усеченная химотрипсином последовательность коревого белка Cry35Ab1.

SEQ ID NO:3: Полная последовательность нативного белка Cry3Ba1.

SEQ ID NO:4: Последовательность коревого белка Cry3Ba1 трипсина.

SEQ ID NO:5: Полная последовательность нативного белка Cry34Ab1.

Подробное описание

Последовательности белка Cry34Ab/35Ab могут быть получены, например, из изолята Bacillus thuringiensis PS149B1. Другие гены, белковые последовательности и изоляты-источники для использования в соответствии с настоящим изобретением описаны, например, Crickmore et al. на сайте интернета (lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro.html).

Настоящее изобретение включает использование инсектицидных белков Cry34Ab/35Ab в комбинации с токсином Cry3Ba для защиты кукурузы от повреждения и потери урожайности, вызванных поеданием кукурузным корневым жуком, популяциями кукурузных листоедов, у которых может развиться устойчивость к любому из этих систем белков Cry по отдельности (без другого).

Таким образом, в настоящем изобретении речь идет о пакетах Управления устойчивости насекомых (IRM) для предотвращения развития у кукурузного корневого жука устойчивости к Cry3Ba и/или Cry34Ab/35Ab.

Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с вредителями-корневыми жуками, содержащим клетки, которые продуцируют белок токсина Cry3Ba и систему токсина Cry34Ab/35Ab.

Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для продукции и белка Cry3Ba, и бинарного токсина Cry34Ab/35Ab, где указанный хозяин представляет собой микроорганизм или растительную клетку.

Дополнительно предполагается, что изобретение относится к способу борьбы с вредителями-корневыми жуками, включающему приведение в контакт указанных вредителей или среды обитания указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит белок Cry3Ba, и дополнительно содержит бинарный токсин Cry34Ab/35Ab.

Вариант осуществления изобретения включает маис, содержащий экспрессируемый растением ген, кодирующий бинарный токсин Cry34Ab/35Ab, и экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry3Ba, и семена такого растения.

Дополнительный вариант осуществления изобретения включает маис, где экспрессируемый растением ген, кодирующий бинарный токсин Cry34Ab/35Ab, и экспрессируемый растением ген, кодирующий белок Cry3Ba, были интрогрессированы в указанный маис, и семена такого растения.

Как описано в разделе «Примеры», исследования конкурентного связывания с рецепторами с использованием меченого радиоактивным изотопом корового токсинного белка Cry35Ab показывают, что коровый токсинный белок Cry3Ba не конкурирует за связывание в образцах ткани насекомых CRW (кукурузных корневых жуков), с которыми связывается Cry35Ab. См. фиг.2. Эти результаты указывают на то, что комбинация белков Cry3Ba и Cry34Ab/35Ab представляет собой эффективное средство для уменьшения развития устойчивости у популяций CRW к любой белковой системе отдельно.

Таким образом, частично на основании данных, описанных выше, и в других местах настоящего описания, белки Cry34Ab/35Ab и Cry3Ba могут использоваться для получения комбинаций IRM для предотвращения и уменьшения развития устойчивости у CRW. Другие белки могут добавляться к этой комбинации, например, для расширения спектра борьбы с насекомыми. Рассматриваемая комбинация (белков Cry34Ab/35Ab и Cry3Ba) может также использоваться в некоторых предпочтительных «тройных пакетах» или «пирамидах» в комбинации с еще одним белком для борьбы с корневыми жуками, таким как Cry3Aa и/или Cry6Aa; следовательно, такие дополнительные комбинации будут обеспечивать множественные типы действия против корневого жука. РНКi против корневых жуков представляет собой еще один вариант. См., например, Baum et al., Nature Biotechnology, vol. 25, no. 11 (Nov. 2007) pp. 1322-1326.

В свете описания заявки USSN 61/327240 (поданной 23 апреля 2010 г.), относящейся к комбинациям белков Cry34Ab/35Ab и Cry3Aa, USSN 61/388273 (поданной 30 сентября 2010 г.), относящейся к комбинациям белков Cry34Ab/35Ab и Cry6Aa, и USSN 61/477447 (поданной 20 сентября 2011 г.), относящейся к комбинациям белков Cry3Aa и Cry6Aa, некоторые предпочтительные «тройные пакеты» или «множественные типы пакетов действия» настоящего изобретения включают белок Cry3Ba в комбинации с белками Cry34Ab/35Ab, вместе с белком Cry6Aa и/или белком Cry3Ba. Трансгенные растения, включая кукурузу, содержащие ген cry3Ba, гены cry34Ab/35Ab и третью или четвертую систему токсинов (например, ген(ы) cry3Aa и/или cry6Aa), включены в объем настоящего изобретения. Таким образом, такие варианты осуществления нацелены на насекомое, по меньшей мере, тремя типами действия.

Варианты размещения по настоящему изобретению включают использование белков Cry3Ba и Cry34Ab/35Ab в местах выращивания кукурузы, где Diabrotica spp. являются проблематичными. Другим вариантом размещения может быть использование одного или обоих белков Cry3Ba и Cry34Ab/35Ab в комбинации с другими признаками.

Специалисту в данной области будет понятно, что токсины Bt, даже в пределах определенного класса, такие как Cry3Ba и Cry34Ab/35Ab, могут в некоторой степени варьироваться.

Гены и токсины. Термин «изолированный» относится к полинуклеотиду в не встречающемся в природных условиях конструкту или к белку в очищенном или иным образом не встречающемуся в природных условиях состоянию. Гены и токсины, используемые в соответствии с настоящим изобретением, включают не только полные описанные последовательности, но также фрагменты этих последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют характерную пестицидную активность токсинов, конкретно проиллюстрированных в настоящем описании. Используемые в настоящем описании термины «варианты» или «изменения» генов относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют те же токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидной активностью. Используемый в настоящем описании термин «эквивалентные токсины» относится к токсинами, обладающим такой же или по существу такой же биологической активностью против вредителей-мишеней как заявленные токсины. Это относится к Cry3 и Cry34/35, а также Cry6 (при использовании в тройных/множественных пакетах) в соответствии с настоящим изобретением. Домены/субдомены этих белков могут быть обменены для получения химерных белков. См. например, патенты США 7309785 и 7524810 в отношении белков Cry34/35. В патенте '785 речь также идет об усеченных белках Cry35. Усеченные токсины также проиллюстрированы в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин «границы» представляет идентичность последовательностей приблизительно 95% (Cry3Ba и Cry34Ab и Cry35Ab), 78% (Cry3B и Cry 34A и Cry35A) и 45% (Cry6 и Cry34 и Cry35) в соответствии с «Revision of Nomenclature for Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins» N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, и D.H. Dean. Microbiology и Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. То же относится к Cry3A и/или Cry6 при использовании в тройных пакетах/множественных пакетах, например, в соответствии с настоящим изобретением.

Для специалиста в данной области будет очевидно, что гены, кодирующие активные токсины, могут быть идентифицированы и получены несколькими способами. Определенные гены или части генов, проиллюстрированные в настоящем описании, могут быть получены из изолятов, депонированных в депозитарии культур. Эти гены или их части или варианты, также могут быть конструированы синтетически, например, путем использования генного синтезатора. Варианты генов могут быть легко сконструированы с использованием стандартных технологий получения точечных мутаций. Также, фрагменты этих генов могут быть получены с использованием коммерчески доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз, в соответствии со стандартными методиками. Например, ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез могут использоваться для систематической отсечки нуклеотидов от концов этих генов. Гены, которые кодируют активные фрагменты, могут также быть получены с использованием разнообразных рестрикционных ферментов. Протеазы могут использоваться для непосредственного получения активных фрагментов белковых токсинов.

Фрагменты и эквиваленты, которые сохраняют пестицидную активность иллюстративных токсинов, будут входить в объем настоящего изобретения. Также, ввиду избыточности генетического кода, разнообразие различных последовательностей ДНК может кодировать аминокислотные последовательности, раскрытые в настоящем описании. Специалист в данной области вполне может создать эти альтернативные последовательности ДНК, кодирующие одинаковые или по существу одинаковые токсины. Эти вариантные последовательности ДНК входят в объем настоящего изобретения. Используемая в настоящем описании ссылка на «по существу одинаковую» последовательность относится к последовательностям, которые имеют аминокислотные замещения, делеции, добавления или вставки, которые существенно не воздействуют на пестицидную активность. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также включены в это определение. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также включены в настоящее изобретение.

Дополнительный способ идентификации генов, кодирующих токсины, и частей генов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, осуществляют путем использования олигонуклеотидных зондов. Эти зонды представляют собой детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности могут быть детектированы посредством соответствующей метки или могут быть получены эндогенно флуоресцентными, как описано в международной патентной заявке № WO 93/16094. Как хорошо известно в данной области, молекула зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются с образованием прочной связи между двумя молекулами, то можно резонно предположить, что зонд и образец имеют существенную гомологию. Предпочтительно, гибридизацию проводят в жестких условиях методиками, хорошо известными в данной области, как описано, например, в публикации Keller, G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры солевых концентраций и температурных комбинаций следующие (в порядке увеличения жесткости условий): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 42°C; 0,1X SSPE или SSC при 65°C. Выявление зонда обеспечивает средство для определения известным образом, произошла ли гибридизация. Такой зондовый анализ обеспечивает быстрый способ идентификации кодирующих токсин генов настоящего изобретения. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов в соответствии с изобретением, могут быть синтезированы с использованием синтезатора ДНК и стандартных методик. Эти нуклеотидные последовательности могут также использоваться в качестве затравок ПЦР для амплификации генов по настоящему изобретению.

Вариантные токсины. В настоящем описании были специально проиллюстрированы определенные токсины по настоящему изобретению. Поскольку эти токсины просто иллюстрируют токсины по настоящему изобретению, то должно быть вполне очевидно, что настоящее изобретение включает вариантные или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же или подобной пестицидной активностью как иллюстрируемый токсин. Эквивалентные токсины имеют гомологию аминокислот с иллюстрируемым токсином. Эта аминокислотная идентичность обычно составляет более чем 75%, или, предпочтительно, более чем 85%, предпочтительно, более чем 90%, предпочтительно, более чем 95%, предпочтительно, более чем 96%, предпочтительно, более чем 97%, предпочтительно, более чем 98%, или в некоторых вариантах осуществления, предпочтительно, более чем 99%. Аминокислотная идентичность обычно самая высокая в критических областях токсина, которые отвечают за биологическую активность или участвуют в определении трехмерной конфигурации, которая, в конечном счете, ответственна за биологическую активность. В этом отношении, приемлемы и могут ожидаться некоторые аминокислотные замещения, если эти замещения происходят в областях, которые не имеют решающего значения для активности или представляют собой консервативные аминокислотные замещения, которые не воздействуют на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты могут быть размещены в следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислотные. Консервативные замещения, посредством которых аминокислота одного класса замещается другой аминокислотой того же типа, входят в объем настоящего изобретения, пока замещение существенно не изменяет биологическую активность соединения. В таблице 1 представлен список примеров аминокислот, относящихся к каждому классу.

Таблица 1
Классы аминокислот с примерами аминокислот, относящихся к каждому классу
Класс аминокислот	Примеры аминокислот
Неполярные	Ala, Val, Leu, Ile, Pro Met, Phe, Trp
Незаряженные полярные	Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Кислотные	Asp, Glu
Основные	Lys, Arg, His

В некоторых случаях могут также осуществляться неконсервативные замещения. Решающим фактором является то, что эти замещения не должны значительно снижать биологическую активность токсина.

Рекомбинантные хозяева. Гены, кодирующие токсины настоящего изобретения, могут быть введены в широкое разнообразие микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина приводит, прямо или косвенно, к внутриклеточной продукции и поддержанию пестицида. Конъюгальный перенос и рекомбинантный перенос можно использовать для создания штамма Bt, который экспрессирует оба токсина настоящего изобретения. Другие организмы хозяев могут также трансформироваться одним или более генами токсина, используемым затем для оказания синергического эффекта. С подходящими микробными хозяевами, например, Pseudomonas, микробы могут наноситься на местонахождение вредителя, где они пролиферируют и употребляются в пищу. Результатом является контроль над вредителем. Альтернативно, микроб, несущий ген токсина, может быть подвергнут обработке в условиях, которые продлевают активность токсина и стабилизируют клетку. Обработанная клетка, которая сохраняет токсическую активность, затем может вноситься в среду обитания вредителя-мишени. В предмет настоящего изобретения включены нерегенерируемые/нетотипотентные растительные клетки из растения по настоящему изобретению (содержащие, по меньшей мере, один из рассматриваемых генов IRM).

Трансформация растения. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является трансформация растений генами, кодирующими рассматриваемый инсектицидный белок или его варианты. Трансформированные растения устойчивы к атаке целевым насекомым-вредителем за счет присутствия контролирующих количеств рассматриваемого инсектицидного белка или его вариантов в клетках трансформированного растения. При включении генетического материала, который кодирует инсектицидные свойства инсектицидных токсинов B.t., в геном растения, употребляемого в пищу определенным насекомым-вредителем, взрослые особи или личинки погибнут после употребления в пищу растения. Были трансформированы многочисленные члены односемядольных и двудольных классификаций. Трансгенные агрономические культуры, а также фрукты и овощи представляют промышленный интерес. Такие культуры включают, но без ограничения, маис, рис, сою, канолу, подсолнечник, люцерну, сорго, пшеницу, хлопок, арахис, томаты, картофель и тому подобное. Существует несколько технологий введения инородного генетического материала в клетки растений и для получения растений, которые стабильно поддерживают и экспрессируют введенный ген. Такие технологии включают акселерацию генетического материала, нанесенного на микрочастицы, непосредственно в клетки (патент США 4945050 и патент США 5141131). Растения могут быть трансформированы с использованием технологии Agrobacterium, см. патент США 5177010, патент США 5104310, Европейскую патентную заявку № 0131624B1, Европейскую патентную заявку № 120516, Европейскую патентную заявку № 159418B1, Европейскую патентную заявку № 176112, патент США 5149645, патент США 5469976, патент США 5464763, патент США 4940838, патент США 4693976, Европейскую патентную заявку № 116718, Европейскую патентную заявку № 290799, Европейскую патентную заявку № 320500, Европейскую патентную заявку № 604662, Европейскую патентную заявку № 627752, Европейскую патентную заявку № 0267159, Европейскую патентную заявку № 0292435, патент США 5231019, патент США 5463174, патент США 4762785, патент США 5004863 и патент США 5159135. Другая технология трансформации включает технологию WHISKERS™, см. патент США 5302523 и патент США 5464765. Технология электропорации также использовалась для трансформации растений, см. Международный патент WO 87/06614, патент США 5472869, патент США 5384253, Международный патент WO 9209696 и Международный патент WO 9321335. Все эти патенты и публикации, относящиеся к трансформации, включены в настоящее описание посредством ссылки. В дополнение к многочисленным технологиям трансформации растений, тип ткани, которая контактирует с инородными генами, также может изменяться. Такая ткань включает, но не ограничивается ими, эмбриогенную ткань, I и II типы каллюсной ткани, гипокотиль, меристему и тому подобное. Почти все растительные ткани могут быть трансформированы во время дедифференциации с использованием соответствующих технологий в пределах квалификации специалиста в данной области.

Гены, кодирующие любой из рассматриваемых токсинов, могут быть вставлены в клетки растения с использованием разнообразных способов, которые хорошо известны в данной области, как описано выше. Например, доступно большое число векторов клонирования, содержащих маркер, который обеспечивает возможность отбора трансформированных микробных клеток, и репликационная система, функциональная у Escherichia coli, для получения и модификации инородных генов для вставки в высшие растения. Такие манипуляции могут включать, например, введение мутаций, усечений, добавлений или замещений, как желательно для предполагаемого использования. Векторы включают, например, pBR322, группу pUC, группу M13mp, pACYC184 и т.д. Соответственно, последовательность, кодирующая Cry-белок или варианты, может быть вставлена в вектор в подходящий сайт рестрикции. Полученная плазмида используется для трансформации клеток E. coli, клетки которых культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют с тем, чтобы было извлечено годное для обработки количество плазмиды. Анализ последовательности, анализ фрагментов рестрикции, электрофорез и другие биохимические-молекулярно-биологические способы в целом проводят в качестве способов анализа. После каждой манипуляции, используемая последовательность ДНК может быть расщеплена и соединена со следующей последовательностью ДНК. Каждая подвергнутая манипулированию последовательность ДНК может быть клонирована в одну и ту же или другие плазмиды.

Использование содержащих T-ДНК векторов для трансформации клеток растений интенсивно исследовалось и достаточно описано в Европейском патенте EP 120516; публикациях Lee и Gelvin (2008), Fraley et al. (1986), и An et al. (1985), и достаточно установлено в данной области.

Как только вставленная ДНК интегрируется в геном растения, она становится относительно устойчивой во всех последующих поколениях. Вектор, используемый для трансформации клетки растения, обычно содержит выбранный маркерный ген, кодирующий белок, который придает трансформированным клеткам растений устойчивость к гербициду или антибиотику, такому как, наряду с другими, биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин. Соответственно, отдельно используемый выбранный маркерный ген должен обеспечить возможность выбора трансформированных клеток, в то время как рост клеток, которые не содержат вставленную ДНК, подавляется селекционным соединением.

Доступно большое число способов вставки ДНК в клетку растения-хозяина. Эти способы включают трансформацию T-DNA, доставленную Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве агента трансформации. Дополнительно, можно использовать слияние протопластов растения с липосомами, содержащими подлежащую доставке ДНК, прямую инъекцию ДНК, трансформацию биологической баллистикой (бомбардировкой микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные способы.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения трансформируются генами, где использование кодона кодирующей белок области было оптимизировано для растений. См., например, патент США 5380831, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Также, преимущественно используются растения, кодирующие усеченный токсин. Усеченный токсин обычно кодирует примерно от 55% до примерно 80% токсина полной длины. Способы создания синтетических генов B.t. для использования в растениях известны в данной области (Stewart, 2007).

Независимо от методики трансформации, ген предпочтительно включают в вектор переноса гена, адаптированный для экспрессирования генов инсектицидного токсина B.t, и варианты в растительной клетки включением в вектор растительного промотора. В дополнение к растительным промоторам, в растительных клетках для экспрессирования чужеродных генов можно эффективно использовать промоторы из разнообразных источников. Например, возможно использование промоторов бактериального происхождения, таких как промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы и промотор маннопинсинтазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления могут использоваться промоторы, не связанные с Bacillus thuringiensis. Могут использоваться промоторы, происходящие из растительных вирусов, например, промоторы 35S и 19S вируса мозаики цветной капусты, промотор из вируса мозаики жилок кассавы и тому подобное. Растительные промоторы включают, но без ограничения, малую субъединицу (ssu), промотор бета-конглицинина, промотор фазеолина, промотор ADH (алкогольдегидрогеназы), промоторы теплового шока, промотор ADF (деполимеризации актина), промотор убиквитина, промотор актина и тканеспецифические промот