Рекомбинантная вакцина вируса лейкемии кошек, содержащая оптимизированный ген оболочки вируса лейкемии кошек

Рекомбинантная вакцина вируса лейкемии кошек, содержащая оптимизированный ген оболочки вируса лейкемии кошек

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

[0001] Данная заявка заявляет приоритет для предварительной заявки США 61/509,912, поданной 20 июля 2011 года.

Область техники изобретения

[0002] Настоящее изобретение относится к композициям или вакцинам для борьбы с инфекциями у животных, вызываемыми вирусом лейкемии кошек. В частности, настоящее изобретение относится к векторам, которые содержат и экспрессируют in vivo или in vitro оптимизированные антигены к оболочке вируса лейкемии кошек, которые вызывают иммунную реакцию в организме животных против вируса лейкемии кошек, включая композиции, содержащие упомянутые векторы, способам вакцинации против вируса лейкемии кошек и наборам для применения с такими способами и композициями.

Уровень техники

[0003] Вирус лейкемии кошек (Feline Leukemia Virus (FeLV), ВЛК) является частой причиной заражения домашних кошек во всем мире и одной из причин значительной заболеваемости и смертности. Распространенность антигенемии может варьировать от 1 до 5 процентов у здоровых кошек до от 15 до 30 процентов у больных кошек (Hosie M.J. et al., Veterinary Records, 1989, 128, 293-297; Braley J., Feline Practice, 1994, 22, 25-29; Malik R. et al., Australian Veterinary Journal, 1997, 75, 323-327; Arjona A. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2000, 38, 3448-3449). Вирус может вызвать пожизненную инфекцию, характеризуемую персистентной вирусемией и летальным исходом. Большинство связанных с FeLV заболеваний персистентно встречается у зараженных животных, и они всегда являются серьезными и, скорее всего, со смертельным исходом. Среди наиболее часто диагностируемых заболеваний отмечаются лимфомы, миелоидные лейкозы, иммунодефицит и нерегенеративная анемия. Инфекцию может контролировать идентификацией и изолированием персистентно вирусемических кошек, которые являются источником инфекции. Вакцины также помогли предотвратить распространение вируса. Несколько FeLV-вакцин доступны. Большинство из них содержат либо инактивированный вирус, либо рекомбинантные субъединицы. Их эффективность является спорной (Sparkes A.H., Journal of Small Animal Practice, 1997, 38, 187-194). Отмечались случаи разложения вакцины.

[0004] Альтернативный способ заключается в использовании рекомбинантного вирусного вектора. Вектор вируса канареек и особенно вектор ALVAC были испытаны на экспрессию генов FeLV (Tartaglia J. et al., Journal of Virology, 1993, 67, 2370-2375; Poulet H. et al., Veterinary Record, 2003, 153, 141-145). Также доступна коммерческая рекомбинантная вакцина FELV (EURIFEL® FELV, Merial).

[0005] Геном FeLV кодирует три гена: ген GAG, кодирующий основные структурные компоненты вируса, ген ENV, который кодирует гликопротеин оболочки, и ген POL, кодирующий белок полимеразы (Thomsen D.R., et al., Journal of General Virology, 73, 1819-1824, 1992). Ген оболочки FELV (ENV) кодирует белок-предшественник gp85, который протеолитически обрабатывается клеточными ферментами с получением основного гликопротеина оболочки gp70 и связанного с ним трансмембранного белка р15Е (DeNoronha, F, et al., 1978, Virology 85:617-621; Nunberg, J.H., et al., 1983, PNAS 81:3675-3679). Трансмембранный белок р15Е содержит последовательность, консервативную среди гаммаретровирусов с иммуносупрессивными свойствами (Mathes, L.E. et al., 1978, Nature). Гликопротеин оболочки FELV является одним из основных иммуногенов и представляет собой мишень FELV-специфических цитотоксических Т-клеточных ответов, а также нейтрализующих антител (Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.). В заявке на патент США 2008/0008683 обсуждается полипептид, который способен модулировать иммуносупрессивные свойства вирусного белка против хозяина, в котором он экспрессируется. Ген GAG FeLV кодирует полипептид-предшественник, который расщепляется протеазой (ген PRO FeLV), чтобы генерировать белки капсида. Белки капсида являются также основным иммуногеном, вызывая FELV-специфические цитотоксические Т-клеточные ответы, а также нейтрализующие антитела (Flynn, J.N., et al., 2002, J. Virol.). Ген POL кодирует три белка: протеазу (PRO), обратную транскриптазу и интегразу. Автопроцессинг протеазой части гена приводит ко всем трем белкам области POL (Thomsen D.R., et al., 1992).

[0006] Существует общая потребность в улучшении эффективности и безопасности вакцин FeLV и в более эффективной защите в полевых условиях.

Сущность изобретения

[0007] Задачей настоящего изобретения может быть любой или все предлагаемые рекомбинантные векторы или вирусы, а также способы получения таких вирусов и предоставление композиций и/или вакцин, а также способов для лечения и профилактики инфекции, вызванной FeLV

[0008] Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, такому как рекомбинантный вирус, например, рекомбинантный поксвирус, который содержит и экспрессирует по меньшей мере одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере одна экзогенная молекула нуклеиновой кислоты может содержать молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес иммуноген или эпитоп из FeLV белков, таких как ENV FeLV и/или GAG/PRO FeLV.

[0009] В частности, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, такому как рекомбинантный вирус, например, рекомбинантный поксвирус, который содержит и экспрессирует по меньшей мере одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты и, по меньшей мере одна экзогенная молекула нуклеиновой кислоты может содержать полипептиды FeLV и/или их варианты или фрагменты.

[0010] Настоящее изобретение дополнительно относится к композициям или вакцине, содержащим такой вектор экспрессии или продукт(ы) экспрессии такого вектора экспрессии.

[0011] Настоящее изобретение дополнительно относится к способам индукции иммунологического (или иммуногенного) или защитного ответа против FeLV, а также к способам предотвращения FeLV или болезненного состояния(ий), вызываемого FeLV, содержащим введение вектора экспрессии или продукта экспрессии экспрессирующего вектора, или композиции, содержащей вектор экспрессии, или композиции, содержащей продукт экспрессии экспрессирующего вектора.

[0012] Настоящее изобретение также относится к продуктам экспрессии из вируса, а также антителам, полученным из продуктов экспрессии, или экспрессии их т vivo и применениям для таких продуктов и антител, например, в диагностических применениях.

[0013] Данные и другие варианты осуществления раскрыты или очевидны из приведенного ниже подробного описания и охватываются им.

Краткое описание чертежей

[0014] Нижеследующее подробное описание, приведенное в качестве примера, и которое не предназначено для ограничения изобретения описанными определенными вариантами осуществления, можно понимать в сочетании с прилагаемыми фигурами, включенными в настоящее описание посредством ссылки, в которых:

[0015] На фигуре 1 представлена таблица, идентифицирующая номер SEQ ID NO, присвоенный полинуклеотидной и белковой последовательности.

[0016] На фигуре 2 изображена карта плазмиды pH6C5env (208.2).

[0017] На фигуре 3 представлены последовательности для фрагмента плазмиды pCXL208.2 (pH6C5env), содержащего ДНК ENV FELV и левые и правые "плечи" (SEQ ID NO:36) и белок ENV FELV (SEQ ID NO:7) из плазмиды pHCMV-ENV FeLV.

[0018] На фигуре 4 представлена рестрикционная карта для плазмиды рРВ713.

[0019] На фигуре 5 представлены выравнивания последовательностей ДНК ENV FeLV и белков.

[0020] На фигуре 6 представлена рестрикционная карта плазмиды рРВ712.

[0021] На фигуре 7 показано выравнивание последовательности ДНК между ДНК GAG/PRO дикого типа (SEQ ID NO:11) и кодон-оптимизированной ДНК GAG/PRO (SEQ ID NO:10).

[0022] На фигуре 8 представлена схема клонирования.

[0023] На фигуре 9 представлена рестрикционная карта плазмиды pJY1874.1.

[0024] На фигуре 10 представлена последовательность белка GAG-PRO FELV.

[0025] На фигуре 11 показана нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, содержащего "плечи" pJY1874.1 и вставку (SEQ ID NO:38).

[0026] На фигуре 12 представлена схема клонирования для изготовления плазмиды vCP2294.

[0027] На фигуре 13 показана карта области СЗ плазмиды vCP2294 с местоположением праймеров.

[0028] На фигуре 14 приведена последовательность плазмиды vCP2294 (аннотированная).

[0029] На фигуре 15 представлена схема клонирования для изготовления плазмиды VCP2296.

[0030] На фигуре 16 показана карта области С5уплазмиды СР2296 с местоположением праймеров.

[0031] На фигуре 17 представлена схема клонирования для изготовления плазмиды VCP2295.

[0032] На фигуре 18 приведена последовательность плазмиды VCP2295.

[0033] Фигура 19 представляет собой график, показывающий эволюцию среднего уровня провирусемии в пересчете на группу после заражения.

[0034] Фигура 20 представляет собой график, показывающий эволюцию среднего уровня провирусемии в пересчете на группу и статус р27 после заражения.

[0035] Фигура 21 представляет собой график, показывающий провирусемию в костном мозге, коррелирующую со статусом р27.

[0036] На фигуре 22 показан специфический IFN-ответ FELV на D35.

[0037] На фигуре 23 показан FELV-специфический (ENV-пептидный пул №1) IFNγ-ответ на D35.

[0038] На фигуре 24 показана FELV-специфический (ENV-пептидные пулы) IL-10-ответ на D35.

[0039] На фигуре 25 показано FELV-специфический (пептидные пулы GAG/PRO) - IL-20-ответ на D35.

[0040] На фигурах 26 a-b представлено FELV-специфическое (стимуляция ENV) - отношение IFNγ/IL-10 на D35.

[0041] На фигуре 27 представлен FELV-специфический (стимуляция GAG/PRO) - IFNγ-ответ на D126.

[0042] На фигуре 28а представлен FELV-специфический (стимуляция ENV) - IL-10-ответ на D126. На фигуре 28b представлен FELV-специфический (стимуляция GAG/PRO) - IL-10-ответ на D126.

[0043] На фигуре 29 представлено FELV-специфическое отношение IFNγ/IL-10 пептидных пулов ENV и GAG/PRO FELV на D35.

Подробное описание

[0044] Следует отметить, что в данном описании и, в особенности, в формуле изобретения, такие понятия, как "содержит", "содержащийся", "содержащий" и т.п. могут иметь значения, присвоенные им в патентном законодательстве США, например, они могут означать "включает в себя", "включено", "включающий" и т.п., и что такие понятия, как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательстве США, например, они позволяют, чтобы элементы прямо не перечислялись, но исключают элементы, которые находимы в предшествующем уровне техники или которые влияют на или основную или новую характеристику изобретения.

[0045] Если не указано иное, технические термины используются в соответствии с обычным употреблением. Определения общих терминов в области молекулярной биологии можно найти у Benjamin Lewin, Genes V. опубликовано Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.). The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликовано Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликовано VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0046] Артикли единственного числа "a", "an" и "the" включают в себя множественное число, если в контексте явно не указано иное. Сходным образом, слово "или" предназначено для включения "и", если из контекста явно не следует иное. Слово "или" означает любой член определенного списка, а также включает в себя любую комбинацию членов данного списка.

[0047] Термин "полипептид или ДНК ENV FeLV" относится к любому нативному или оптимизированному/мутированному полипептиду или ДНК ENV FeLV и их производным и вариантам. Например, оптимизированная/мутированная ДНК ENV FeLV может быть кодон-оптимизированной ДНК FeLV, ДНК ENV FeLV может быть оптимизирована для получения единичной аминокислотной мутации в полипептиде FeLV. Оптимизированный/мутированный полипептид ENV FeLV может содержать мутацию одной аминокислоты или мутацию двух аминокислот или мутацию многих аминокислот.

[0048] Термин "животное" используется здесь, чтобы включить всех млекопитающих, птиц и рыб. Животное в целях настоящего изобретения может быть выбрано из группы, состоящей из семейства лошадиных (например, лошадь), семейства собачьих (например, собаки, волки, лисы, волки, шакалы), семейства кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие большие кошки и другие животные из семейства кошачьих, включая гепардов и рысей), семейства жвачных (например, крупный рогатый скот), семейства свиней (например, свинья), семейства овец (например, овцы, козы, ламы, зубры), семейства птичьих (например, курица, утка, гусь, индейка, перепела, фазаны, попугаи, зяблики, ястреб, ворона, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяна, долгопят, обезьяна, гиббон, обезьяны), людей и рыб. Термин "животное" также включает в себя отдельное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональный и фетальный стадии.

[0049] Термины "полипептид" и "белок" используются в данном описании взаимозаменяемо для обозначения полимера последовательных аминокислотных остатков.

[0050] Термин "нуклеиновая кислота", "нуклеотид" и "полинуклеотид" относится к РНК или ДНК и их производным, таким как аналоги, содержащие модифицированные остовы. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим последовательности, комплементарные тем, которые описаны в настоящем документе. Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть получены различными способами (например, химическим синтезом, клонированием генов и т.д.) и могут принимать различные формы (например, линейная или разветвленная, одно- или двухцепочечная или их гибрид, праймеры, зонды и т.д.).

[0051] Термин "ген" используется в широком смысле для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены или полинуклеотиды включают в себя интроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК, такие как открытой рамки считывания (open reading frame (ORF), начиная от стартового кодона (метионин-кодон) и заканчивая сигналом терминации (стоп-кодон). Гены и полинуклеотиды также могут включать в себя области, которые регулируют их экспрессию, например, инициации транскрипции, трансляции и терминации транскрипции. Таким образом, также включены промоторы и области связывания рибосомы (обычно эти регуляторные элементы лежат приблизительно от 60 до 250 нуклеотидов выше по направлению транскрипции от стартового кодона кодирующей последовательности или гена; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), терминаторы транскрипции (обычно, терминатор находится в пределах приблизительно 50 нуклеотидов ниже по направлению транскрипции от стоп-кодона кодирующей последовательности или гена; Ward С K et al.). Ген или полинуклеотид также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует специфический белок, и который включает в себя регуляторные последовательности.

[0052] Термин "иммуногенный полипептид" или "иммуногенный фрагмент", используемый здесь, относится к полипептиду или фрагменту полипептида, который содержит аллель-специфической мотив, эпитоп или другую последовательность таким образом, что полипептид или фрагмент связываются с молекулой МНС и индуцируют цитотоксический ответ Т-лимфоцитов ("cytotoxic Т lymphocyte, CTL") и/или ответ В-клеток (например, продуцирование антител), и/или ответ лимфоцитов Т-хелперов и/или ответ гиперчувствительности замедленного типа (delayed type hypersensitivity, DTH) против антигена, из которого получен иммуногенный полипептид или иммуногенный фрагмент. DTH-ответ представляет собой иммунную реакцию, в которой зависимая от Т-клеток активация макрофагов и воспаление являются причиной повреждения тканей. DTH-реакция на подкожную инъекцию антигена часто используется в качестве анализа на клеточно-опосредованный иммунитет.

[0053] По определению, эпитоп представляет собой антигенную детерминанту, которая является иммунологически активной в том смысле, что, будучи только введенным хозяину, он способен вызывать иммунный ответ гуморального (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки). Это определенные химические группы или пептидные последовательности на молекуле, которые являются антигенными. Антитело специфически связывается с определенным антигенным эпитопом на полипептиде. Определенные, не ограничивающие примеры эпитопа включают в себя последовательность из от четырех до пяти пептидных остатков в полипептиде, последовательность из от трех до пяти гликозидных остатков в полисахариде. В животном организме большинство антигенов представит несколько или даже много антигенных детерминант одновременно. Такой полипептид также может быть квалифицирован как иммуногенный полипептид, и эпитоп может быть идентифицирован, как описано далее.

[0054] "Изолированный" биологический компонент (например, нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который был по существу отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в котором данный компонент встречается естественным образом, для примера, от других хромосомной и экстра-хромосомной ДНК и РНК, белков и органелл. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были "изолированы", включают в себя нуклеиновые кислоты и белки, очищенные стандартными способами очистки. Данный термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантной техники, а также химического синтеза.

[0055] Понятие "очищенный" в целях настоящего изобретения не требует абсолютную чистоту, а скорее, он предназначен как относительное понятие. Так, например, препарат очищенного полипептида представляет собой препарат, в котором полипептид более обогащен, чем полипептид в своем природном окружении. Препарат полипептида по существу очищен так, что данный полипептид представляет несколько вариантов осуществления, составляя по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% от общего содержания полипептидов в препарате. То же самое относится к полинуклеотидам. Полипептиды, описанные здесь, могут быть очищены любым из способов, известных в данной области.

[0056] Рекомбинантный полинуклеотид представляет собой такой полинуклеотид, который имеет последовательность, которая не встречается в природе или имеет последовательность, которая сделана искусственным объединением двух, в иных случаях, разделенных сегментов последовательности. Такое искусственное сочетание часто осуществляется химическим синтезом или, чаще, искусственным манипулированием изолированными сегментами нуклеиновых кислот, например, с использованием способов генетической инженерии. В одном варианте осуществления рекомбинантный полинуклеотид кодирует слитый белок.

[0057] Один объект настоящего изобретения относится к оптимизированным или мутантным полипептидам из FeLV. Другой объект настоящего изобретения относится к оптимизированным или мутантным полипептидам ENV FeLV. Еще один объект настоящего изобретения относится к оптимизированному белку ENV FeLV, в котором мутация происходит, но не ограничиваясь этим, в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43 или в положении аминокислоты 533 в SEQ ID NO:7. Еще один объект настоящего изобретения относится к мутации, которая представляет собой замену аргинина (R), аспарагиновой кислоты (D) или метионина (М) на глутаминовую кислоту (Е) в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43 или в положении аминокислоты 533 в SEQ ID NO:7. Специалисту в данной области следует понимать, что на основе выравнивания последовательностей описанная мутация охватывает мутацию в соответствующем положении аминокислоты в других полипептидах ENV FeLV, которые не перечислены в настоящей заявке, где соответствующее положение аминокислоты эквивалентно положению аминокислоты 527 в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43 или аминокислоты в положении 533 в SEQ ID NO:7. Выравнивание белковых последовательностей некоторых из полипептидов ENV FeLV иллюстрируется на фигуре Id. В одном варианте осуществления оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV содержит аминокислотную мутацию в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты белков ENV FeLV. В еще одном варианте осуществления оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV содержит замену аминокислоты R, D или М на Е в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты полипептида ENV FeLVa. В еще одном варианте осуществления оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV содержит аминокислотную замену R на Е в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты полипептида ENV FeLVa. В еще одном варианте осуществления мутантный полипептид ENV FeLV имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 7 или 43.

[0058] Кроме того, гомологи полипептидов из FeLV предназначены, чтобы быть в пределах объема настоящего изобретения. В целях настоящего изобретения, термин "гомологи" включает в себя ортологи, аналоги и паралоги. Термин аналоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют такую же или аналогичную функцию, но которые эволюционировали порознь в неродственных организмах. Термин "ортологи" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам из разных видов, но которые произошли от общего гена-предшественника видообразованием. Как правило, ортологи кодируют полипептиды, имеющие такие же или аналогичные функции. Термин "паралоги" относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны с друг другом процессом дупликации гена в геноме. Паралоги обычно имеют разные функции, но данные функции могут быть родственны друг другу. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида FeLV дикого типа могут отличаться от полипептида FeLV дикого типа посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотной последовательности или тем и другим. В частности, гомологи по данному изобретению будут обычно проявлять по меньшей мере от 80 до 85%, от 85 до 90%, от 90 до 95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательностей со всеми или частью полипептидной или полинуклеотидной последовательностями FeLV дикого типа и будет демонстрировать аналогичную функцию.

[0059] Другой объект настоящего изобретения относится к оптимизированному или мутированному полипептиду ENV FeLV, имеющему по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34.

[0060] Еще один объект настоящего изобретения относится к фрагментам и вариантам оптимизированных или мутированных полипептидов ENV FeLV, упомянутых выше, которые могут быть легко получены специалистом в данной области с использованием хорошо известных способов молекулярной биологии.

[0061] Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную аминокислотной последовательности, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34.

[0062] Варианты включают в себя аллельные варианты. Термин "аллельный вариант" относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют в природной популяции (например, вид или разновидность вируса). Такие природные аллельные вариации могут обычно приводить к от 1 до 5% дисперсии в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы секвенированием последовательности интересующей нуклеиновой кислоты в ряде различных видов, которое может быть легко осуществлено с помощью гибридизационных зондов для определения того же генетического локуса гена в данных видах. Любые и все такие вариации нуклеиновых кислот и получаемые в результате полиморфизмы аминокислот или изменения, которые являются результатом изменения природных аллелей и которые не изменяют функциональную активность интересующего гена, предназначены, чтобы быть в пределах объема настоящего изобретения.

[0063] В целях настоящего изобретения, термин "производное" или "вариант" относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который имеет одно или более изменений консервативных аминокислот или другие незначительные изменения, такие, что (1) соответствующий полипептид имеет по существу эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитело, выработанное против полипептида, является иммунореактивным с полипептидом дикого типа. Данные варианты или производные включают в себя полипептиды, имеющие незначительные модификации первичных аминокислотных последовательностей оптимизированного или мутированного полипептида ENV FeLV, которые могут привести к появлению пептидов, имеющих по существу эквивалентную активность по сравнению с немодифицированным аналогом полипептида. Такие модификации могут быть преднамеренными, как с помощью сайт-направленного мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин "вариант" дополнительно предусматривает делеции, добавления и замены в последовательности, до тех пор пока полипептид функционирует для получения иммунного ответа, как определено здесь. Модификациями могут быть любое изменение аминокислоты в положениях аминокислот, отличных от положения 527 из SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43, или в положении 533 аминокислоты из SEQ ID NO:7.

[0064] Термин "консервативный вариант" означает замену аминокислотного остатка другим биологически аналогичным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты таким образом, что закодированный аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой другой биологически аналогичный остаток. В этом отношении особенно предпочтительные замены обычно будут консервативными по своей природе, т.е. те замены, которые имеют место внутри семейства аминокислот. Например, аминокислоты в целом разделены на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариантов включают в себя замещение одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой гидрофобный остаток, или замещение одного полярного остатка на другой полярный остаток, такое как замещение аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и тому подобное, или аналогичное консервативное замещение аминокислоты структурно родственными аминокислотами, которые не будут иметь существенное влияние на биологическую активность. Белки, имеющие по существу такую же аминокислотную последовательность, как эталонная молекула, но обладающие незначительными заменами аминокислот, которые существенно не влияют на иммуногенность белка, находятся, таким образом, в рамках определения эталонного полипептида. Все полипептиды, полученные в результате таких модификаций, включены в данный документ. Термин "консервативный вариант" также включает в себя применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной родительской аминокислоты при условии, что антитела, выработанные к замещенному полипептиду, также имеют иммунную реакцию по отношению к незамещенному полипептиду.

[0065] Иммуногенный фрагмент полипептида ENV FELV содержит по меньшей мере 8, 10, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере 21 аминокислот, по меньшей мере 23 аминокислот, по меньшей мере 25 аминокислот или по меньшей мере 30 аминокислот из полипептида ENV FeLV, имеющие последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43, или их варианты. В другом варианте осуществления фрагмент полипептида ENV FELV включает в себя специфический антигенный эпитоп, найденный на полноразмерном полипептиде ENV FeLVa.

[0066] Процедуры для определения фрагментов полипептида и эпитопа, такие как генерирование библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer В. et al.), Pepscan (Geysen H. M. et al., 1984; Geysen H. M. et al., 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen H. M.) и алгоритмы (De Groot A. et al.; Hoop T. et al.; Parker K. et al.), могут быть использованы в практике настоящего изобретения без ненужного экспериментирования. Как правило, антитела специфически связываются с определенным антигенным эпитопом. Определенные, не ограничивающие примеры эпитопов включают в себя последовательность из от четырех до пяти пептидных остатков в полипептиде, последовательность из от трех до пяти гликозидных остатков в полисахариде. У животных большинство антигенов представит несколько или даже много антигенных детерминант одновременно. Предпочтительно, где эпитоп представляет собой белковый фрагмент более крупной молекулы, он будет иметь по существу ту же иммунологическую активность как и весь белок.

[0067] Один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид ENV FeLV. Другой объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, кодирующему мутантный или оптимизированный полипептид ENV FeLV, в котором мутация происходит в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:2, 4, 6, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43, или в положении аминокислоты 533 в SEQ ID NO:7. Еще один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, кодирующему оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV, где мутация представляет собой замену аргинина (R), аспарагиновой кислоты (D) или метионина (М) на глутаминовую кислоту (Е) в положении аминокислоты 527 из SEQ ID NO:2, 4, 6, 7, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43, или в положении аминокислоты 533 в SEQ ID NO:7. Еще один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, кодирующему оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV, имеющий аминокислотную мутацию в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты белков ENV FeLV. Другой объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, кодирующему оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV, имеющий аминокислотную замену Е на R, D или М в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты полипептида ENV FeLV. Еще один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, кодирующему оптимизированный или мутантный полипептид ENV FeLV, имеющий аминокислотную замену Е на R в положении аминокислоты 527 в SEQ ID NO:6 или в соответствующем положении аминокислоты полипептида ENV FeLVa. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид ENV FeLV кодирует полипептид ENV FeLV, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 7 или 43. В еще одном варианте осуществления полинуклеотид ENV FeLV кодирует полипептид ENV FeLV, имеющий по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, 4, 6, 7, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 43, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере восемь или по меньшей мере десять последовательных аминокислот одного из данных полипептидов или комбинацию данных полипептидов.

[0068] Другой объект настоящего изобретения относится к полипептиду GAG-PRO FeLV, имеющему по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:12.

[0069] Другой объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, имеющему нуклеотидную последовательность, как указано в SEQ ID NO:1, 3 или 5, или его варианту. Еще один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду ENV FeLV, имеющему по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полинуклеотидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, 3 или 5, или его вариантом.

[0070] Еще один объект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду GAG-PRO FeLV, имеющему по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полинуклеотидом, имеющим последовательность, представленную в SEQ ID NO:10 или 11, или его вариантом.

[0071] Данные полинуклеотиды могут включать в себя последовательности ДНК, кДНК и РНК, которые кодируют полипептиды ENV или GAG-PRO FeLV. Понятно, что все полинуклеотиды, кодирующие полипептиды ENV или GAG-PRO FeLV, также включены в данном документе, пока они кодируют полипептид с распознанной активностью, такой как связывание с антителом, которое распознает полипептид, индукция иммунного ответа на полипептид, или воздействие на выживаемость при заболевании лейкемией, когда его вводят субъекту, который подвергается воздействию паразита или у которого наблюдается уменьшение в проявлении или симптоме FeLV-инфекции.

[0072] Полинуклеотиды настоящего раскрытия включают в себя последовательности, которые являются вырожденными как результат генетического кода, например, с использованием кодона, оптимизированного для определенного хозяина. В целях настоящего изобретения "оптимизированный" относится к полинуклеотиду, который генетически модифицируют, чтобы увеличить его экспрессию в данном виде. Чтобы обеспечить оптимизированные полинуклеотиды, кодирующие полипептид ENV или GAG-PRO FeLV, последовательность ДНК гена ENV или GAG-PRO FeLV могут быть изменены с тем, чтобы 1) содержать ко доны, предпочитаемые генами, характеризующимися высоким уровнем экспрессии генов в определенном виде; 2) характеризоваться содержанием А+Т или G+С в составе нуклеотидных оснований, которое по существу найдено в упомянутом виде; 3) образовать последовательность инициации упомянутого вида; или 4) удалить последовательности, которые вызывают дестабилизацию, неуместное полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК или которые образуют шпильки вторичной структуры или участки сплайсинга РНК. Повышенная экспрессия белка FeLV в упомянутом виде может быть достигнута за счет использования частоты распределения использования кодонов у эукариот и прокариот, или в определенном виде. Термин "частота предпочтительного использования кодонов" относится к предпочтению, проявляемому определенной клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов для указания данной аминокислоты. Имеется 20 природных аминокислот, большинство из которых определяются более чем одним кодоном. Таким образом, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в данное раскрытие до тех пор, пока аминокислотная последовательность полипептида FeLV, кодируемая нуклеотидной последовательностью, функционально не изменяется.

[0073] Идентичность последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена попарным сравнением по алгоритму BLAST NCBI (National Center for Biotechnology Information, Национальный центр биотехнологической информации) и матрице BLOSUM62, используя стандартные параметры (см., например, алгоритм BLAST или BLASTX, доступные на сайте сервера "National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, США), а также у Altschul et al.; и, таким образом, в данном документе алгоритмы или BLAST или BLASTX с матрицей BLOSUM62 обозначены термином "бласты").

[0074] Идентичность последовательностей между двумя нуклеотидными последовательностями также можно определить, используя программу "Align" Myers and Miller, ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) и доступную в NCBI, а также ту же или другие программы, доступные через Интернет на сайтах с ними, таких как сайт NCBI.

[0075] Альтернативно или дополнительно, термин "идентичность", например, по отношению к нуклеотидной или аминокислотной последовательности, может указывать на количественную меру гомологии между двумя последовательностями. Процент гомологии последовательности может быть вычислен как:

[0076] (N_ref-N_dif)*100/N_ref, где N_dif представляет собой общее число неидентичных остатков в двух последовательностей при выравнивании и где N_ref представляет собой количество остатков в одной из последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК AGTCAGTC будет иметь 75% идентичности последовательности с последовательностью ААТСААТС (N_ref=8; N_dif=2).

[0077] Альтернативно или дополнительно, "идентичность" в отношении последовательностей может относиться к числу позиций с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, разделенному на число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, где выравнивание двух последовательностей может определяется в соответствии с алгоритмом Уилбур и Липман (Wilbur and Lipman), например, с использованием размера окна в 2