Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8

Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение касается парамиксовирусов птиц (avian paramyxoviruses, APMV) и последовательностей APMV. Настоящее изобретение касается вирусных векторов для встраивания и экспрессии чужеродных генов для применения в качестве безопасных носителей при иммунизации для защиты от множества патогенов. Оно касается векторной вакцины в системе «обратной генетики» для производства живых ослабленных вакцин. Оно также касается полинуклеотидов, которые могут применяться для продукции субъединиц в экспрессионном векторе in vitro или последовательностей для интегрирования в вирусный или плазмидный тип экспрессионного вектора в системе in vivo.

Настоящее изобретение касается немодифицированного и модифицированного вируса APMV, способов его получения и применения и определенных последовательностей ДНК и белков. Более конкретно, настоящее изобретение касается вируса APMV, в котором исходный природный геном вируса был изменен («мутанты APMV» или «рекомбинантный APMV») и способов получения и применения таких мутантов APMV или рекомбинантного APMV.

Уровень техники

Вакцины на основе вирусных векторов представляют собой одну из наиболее быстро развивающихся областей в разработке вакцин. Многие вакцины, находящиеся на стадии клинических разработок, для основных глобальных инфекционных заболеваний, ВИЧ, туберкулеза и малярии, созданы на основе вирусных векторов. Вакцины на основе вирусных векторов для животных уже представлены на рынке, например, вакцины на основе авипоксвирусных векторов для домашних животных и домашней птицы, векторные вакцины на основе герпесвирусов птиц для домашней птицы и вакцины на основе вируса коровьей оспы для диких животных. Другие векторные вакцины для домашних животных находятся в стадии разработки. Преимущество вакцин на основе вирусных векторов заключается в том, что их можно безопасно применять, поскольку в них используется векторная основа, которая является сильно ослабленной и не может сама по себе вызвать заболевание у животного. Недостатком применяемых в настоящее время вирусных векторов является существование полученного от матери иммунитета или антител, появившихся в результате перенесенной инфекции. Эти антитела будут нейтрализовать векторный вирус и, следовательно, уменьшать успешность применения векторной вакцины. Одним из главных стимулов для разработки векторных вакцин было появление высокопатогенного вируса гриппа H5N1, появившегося сначала в Азии, а позднее в Европе и в Африке. Было разработано несколько векторных вакцин-кандидатов, включая векторные вакцины на основе поксвируса птиц (Taylor et al, 1988), вируса коровьей оспы (Chambers et al., 1988), вируса саркомы Рауса (Hunt et al, 1988), аденовирусов (Tang et al., 2002, Gao et al, 2006), вируса венесуэльского энцефалита лошадей (Schultz-Cherry et al, 2000), вируса болезни Ньюкасла (US6,719,979, Veits et al., 2006, Swayne et al, 2002, Park et al, 2006), герпесвируса инфекционного ларинготрахеита (Veits et al. 2003), герпесвируса индеек (Darteil et al., 1995) и аденовируса (Hoelscher et al, 2008, Того et al, 2007). Эффективность этих векторных вакцин была протестирована на незараженных птицах, но до настоящего времени не было опубликовано сообщений об эффективности этих векторных вакцин у птиц с уже имеющимся иммунитетом к вирусному вектору и/или к белку, кодируемому вставкой.

Семейство вирусов Paramyxoviridae включает как патогены человека (вирусы кори, свинки, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус), так и животных (вирус болезни Ньюкасла и вирус чумы рогатого скота), которые оказывают значительное влияние на здоровье населения и на глобальную экономику (Lamb et al., 2007). Установлено, что члены этого семейства имеют однокомпонентный отрицательно направленный (с отрицательной полярностью) одноцепочечный РНК-геном. Семейство Paramyxoviridae состоит из двух подсемейств, а именно Paramyxovirinae и Pneumovirinae. Согласно недавней ревизии классификации подсемейство Paramyxovirinae включает пять родов, а именно Morbillivirus, Henipavirus, Rubulavirus, Respirovirus и Avulavirus, тогда как Pneumovirinae включает Pneumovirus и Metapneumovirus (Mayo, 2002). Парамиксовирусы птиц (APMV) относятся к роду Avulavirus и включают девять антигенно различающихся серотипов, которые были определены с помощью тестов ингибирования гемагглютинации (HI) (Alexander, 1988). Среди этих девяти серотипов изоляты, принадлежащие к подтипу APMV-1, могут вызывать опустошительное заболевание в промышленном птицеводстве и классифицируются как велогенный (с высокой вирулентностью) вирус болезни Ньюкасла (Newcastle disease virus, NDV). Более умеренные формы NDV обозначаются как мезогенные (средней вирулентности) и лентогенные (со сниженной вирулентностью) изоляты, где последняя форма у домашней птицы является обычно бессимптомной. Изоляты, относящиеся к APMV-2, 3, 6 и 7, также являются связанными с заболеванием домашней птицы. В частности, инфекции изолятами APMV-2 и 3 могут вызывать умеренное респираторное заболевание и проблемы с качеством и количеством яиц (Bankowski et al., 1981; Redmann et al., 1991; Tumova et al., 1979; Zhang et al., 2007). Известно, что изоляты APMV-6 и 7 инфицируют индеек, уток и перелетных птиц и могут вызывать респираторное заболевание, которое может осложняться вторичной инфекцией (Saif et al., 1997; Shortridge et al., 1980). С другой стороны, изоляты APMV-4, 5, 8 и 9 были выделены из уток, водоплавающей птицы и других диких птиц, но эти птицы редко демонстрируют клинические признаки, характерные для вирусной инфекции (Alexander et al., 1983; Capua et al., 2004; Gough et al., 1984; Maldonado et al., 1995; Shortridge et al., 1980).

Были получены полные геномные последовательности нескольких изолятов NDV, которые использовали для выявления различных детерминант вирулентности NDV (de Leeuw et al., 1999; Krishnamurthy et al., 1998; Zou et al., 2005). В последние два года было опубликовано несколько последовательностей APMV, которые отличаются от APMV1, такие как GenBank accession number EU338414 для APMV-2, EU403085 для APMV-3, FJ177514 для APMV-4, EU622637 для APMV-6, FJ231524 для APMV-7, FJ215863, FJ215864 и FJ619036 для APMV-8, EU910942 для APMV-9. Кроме информации о последовательностях, о факторах вирулентности известно не очень много. Изоляты APMV 2-9 главным образом были выделены из перелетных птиц. Интересно отметить, что имеется всего несколько сообщений об экспериментальном заражении цыплят такими изолятами (Saif et al., 1997). Поскольку эти APMV широко циркулируют среди диких птиц и в некоторых случаях были выделены из промышленных популяций домашней птицы (Zhang et al., 2007), что иногда вызывает заболевание в этих популяциях (Saif et al., 1997; Shihmanter et al., 1998; Shihmanter et al., 1998), знание их вирулентности в отношении домашней птицы является необходимым.

Большинство из изолятов APMV вызывает относительно слабое заболевание, которое может усиливаться в присутствии сопутствующих бактериальных или вирусных инфекций, что может приводить к экономическим потерям. В частности, APMV-2 был впервые изолирован как вторичный патоген в 1956 году в Южной Калифорнии из цыплят, пораженных острым ларинготрахеитом (Bankowski et al., 1960). Впоследствии были выделены многочисленные штаммы этого серотипа из нескольких видов птиц, что означает, что APMV-2 является широко распространенным по всему миру (Andral et al., 1984; Bradshaw et al., 1979; Fleury et al., 1979; Goodman et al., 1988; Lang et al., 1975; Lipkind et al., 1982; Lipkind et al., 1979; Zhang et al., 2006). Bankowski et. al. сообщили, что естественное или искусственное экспонирование несущихся индеек с APMV-2 вызывает резкое снижение вылупляемости птенцов и выхода птицы (Bankowski et al., 1981).

Первыми примерами изоляции APMV-4 были таковые из убитых охотниками диких уток на путях перелета на Миссисипи и Соединенных Штатах (Webster et al., 1976) и из кур, уток и гусей в Гонконге в ходе программ мониторинга гриппа у домашней птицы (Alexander et al., 1979). Не считая изолята из кольчатого чирка, пораженного геморрагическим энтеритом (Gough et al., 1984), все другие изоляты из домашней птицы были по внешним признакам непатогенными и, как было установлено, имеют широкое распространение среди водоплавающей птицы по всему миру (Stanislawek et al., 2002; Tumova et al., 1989; Yamane et al., 1982). Gough et al. сообщили, что после внутриназальной инокуляции однонедельным утятам и двухнедельным цыплятам изолята из кольчатого чирка не наблюдалось клинических проявлений и были получены очень низкие титры HI (1:8 или ниже) (Gough et al., 1984). Подобно этому, первые изоляты APMV-6 были также получены из домашней птицы в Гонконге в результате проведения программы мониторинга гриппа и сообщалось, что у кур они являются непатогенными на основании низких титров HI из экспериментально зараженных кур (Shortridge et al., 1980). Однако были сообщения о том, что инфекция APMV-6 у индеек приводит к умеренному респираторному заболеванию и проблемам с производством яиц (Alexander, 2003).

APMV-8 (Goose/Delaware/1053/76) был впервые изолирован в США из убитой охотниками Канадской казарки {Branta canadensis) (Rosenberger et al., 1974). Серологические исследования (с 1990 по 1992 годы) пернатой дичи в южной Испании показали значительное преобладание антител против APMV-8 в до 43% протестированных сывороток (Maldonado et al., 1995). Другое серологическое исследование, направленное на выяснение статуса живых здоровых крякв в Новой Зеландии в отношении инфицирования APMV, выявило присутствие антител против APMV-8 в 56% протестированных сывороток (Stanislawek et al., 2002). Warke et al (2008) сообщили, что от 16% до 31% из исследованных сывороток кур могут содержать антитела против APMV-8. Но вследствие наличия высоких титров против APMV1 существует вероятность ложноположительного теста HI, поскольку сыворотки не реагируют высокоспецифично при анализе HI. За исключением нескольких изолятов из водоплавающей птицы, изоляты APMV-8 были получены из популяций при их исследовании на вирус птичьего гриппа (Stallknecht et al., 1991), и сохраняется недостаток информации о широкой распространенности и патогенности этого вируса.

Развитие систем «обратной генетики» (условий обратной транскрипции) для РНК-генома с отрицательной полярностью NDV сделало возможным встраивание последовательностей чужеродных генов в такой геном, таким образом, обеспечивая возможность создания рекомбинантных NDV векторов для вакцинации и генной терапии (Krishnamurthy et al., 2000; Peeters et al., 1999; Roemer-Oberdoerfer et al., 1999). Сообщалось о рекомбинантных NDV векторах, экспрессирующих чужеродные вирусные белки, такие как белок НА подтипа HI вируса гриппа A (Nakaya et al., 2001), VP2 белок вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Huang et al., 2004), гемагглютинин подтипа Н5 (Veits et al., 2006; Ge et al., 2007) и подтипа H7 (Park et al., 2006) вируса гриппа птиц. Однако эффективность большинства из таких вакцин была продемонстрирована только на свободных от специфических патогенов (SPF) птицах. NDV вызывает опустошительное заболевание у домашней птицы, приводящее к серьезным экономическим потерям в промышленном птицеводстве. Таким образом, куры в промышленном птицеводстве обычно вакцинируются против NDV в большинстве стран мира. Вследствие этого, цыплята от иммунизированных родителей в промышленных популяциях кур имеют высокий уровень полученных от матери антител. Обычные живые NDV вакцины обеспечивают защиту даже в присутствии этих антител. Однако рекомбинантные NDV вакцины (с вставками чужеродных генов) обычно являются более ослабленными по сравнению с живыми NDV вакцинами, и их эффективность может быть ослаблена в присутствии материнских антител против NDV. Таким образом, существует необходимость в платформе векторной вакцины, которая может обеспечить основу для безопасных вакцин для экспрессии гетерологических антигенов. В идеале рекомбинантная вакцина может индуцировать сильный гуморальный иммунный ответ, может применяться для массового введения и является недорогой.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение касается вакцины или композиции, включающей (i) рекомбинантный APMV и (ii) фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель. Настоящее изобретение включает способы модификации генома APMV для получения рекомбинантного вируса APMV или вирусного вектора на основе APMV; модифицированный APMV, полученный такими способами; последовательности ДНК и белков; и способы инфицирования клеток и животных-хозяев таким рекомбинантным APMV для индукции амплификации экзогенной ДНК и белков, кодируемых экзогенной ДНК, включая антигенные белки, указанными клетками и животными-хозяевами.

Один аспект настоящего изобретения касается вируса APMV, последовательностей ДНК и белков, применяемых при получении модифицированного или рекомбинантного вируса. Одно воплощение настоящего изобретения касается геномной и белковой последовательности APMV-2, 4, 6 или 8.

Другой аспект настоящего изобретения касается модифицированного рекомбинантного вируса APMV, где указанные вирусы имеют повышенную безопасность, сильный гуморальный иммунный ответ, и способа получения таких рекомбинантных вирусов.

Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантной APMV вирусной вакцины или композиции, имеющей повышенный уровень безопасности по сравнению с известными APMV или другими рекомбинантными вакцинами.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет немодифицированный и модифицированный APMV вирусный вектор для экспрессии продукта гена в хозяине.

Другой аспект настоящего изобретения направлен на рекомбинантный APMV вирус, модифицированный путем вставки в него ДНК из любого источника в межгенный участок или в несущественный участок генома APMV. Синтетически модифицированные рекомбинанты APMV вируса, несущие гетерологические гены, кодирующие и экспрессирующие антиген, применяются согласно настоящему изобретению для создания новых композиций или вакцин.

Другой аспект настоящего изобретения касается APMV вирусного вектора, который предоставляет обратную генетическую систему (систему обратной транскрипции), где указанный вектор может быть применен в качестве каркаса для рекомбинантных вакцин или композиций в различных животных-хозяевах.

В одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции или вакцины для индукции иммунологического ответа в животном-хозяине, инокулированном данной композицией или вакциной, композиции или вакцины, включающей фармацевтически приемлемый носитель и модифицированный APMV рекомбинантный вирус или вирусный вектор. В еще одном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный APMV вирус или вирусный вектор включает, в пределах несущественного участка вирусного генома, гетерологическую ДНК, которая кодирует антигенный белок, происходящий из патогена, где композиция или вакцина при введении хозяину является способной индуцировать иммунологический ответ, специфичный в отношении белка, кодируемого данным патогенном.

Другой аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного на антиген, где способ включает инокуляцию животного вакциной или фармацевтической композицией, содержащей модифицированный рекомбинантный APMV вирус или вирусный вектор, который включает и экспрессирует антигенную детерминанту патогена для указанного животного. Еще один аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного на антиген в режиме «прайм-буст».

Другой аспект настоящего изобретения касается способа экспрессии продукта гена в клеточной культуре in vitro путем введения в клетку модифицированного рекомбинантного APMV вируса, где ген может представлять собой ген антигенного белка, происходящий из патогена.

Краткое описание фигур

Следующее далее «Осуществление изобретения», выполненное в виде примеров, которое не направлено на ограничение настоящего изобретения описанными конкретными воплощениями, может быть понятным с привлечением сопровождающих фигур, среди которых:

Фигура 1 представляет собой таблицу, показывающую изоляцию вируса из нескольких органов кур после экспериментального инфицирования APMV-2, 4, 6 зародышей куриных яиц.

Фигура 2 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистологического исследования некоторых органов кур после экспериментального инфицирования APMV-2, 4, 6.

Фигура 3 показывает титры HI антител у SPF кур (свободных от специфических патогенов), экспериментально инокулированных APMV-2, 4 или 6. Образцы сыворотки крови кур, собранные в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования, подвергали тесту HI для анализа присутствия HI антител.

Фигура 4 показывает титры HI антител у SPF кур и уток, экспериментально инфицированных APMV-8. Куры и утки были инфицированы ороназально в дозе 10⁶ EID₅₀ APMV-8. Образцы сыворотки крови были взяты в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования и проанализированы в тесте HI с антигеном APMV-8. Титры HI сывороток крови (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси.

Фигура 5 показывает развитие титров антител HI у SPF кур в ходе схемы вакцинирования «прайм-буст» с APMV-8. Однодневные SPF цыплята были инфицированы в день 1 (первично) и в день 14 (буст) в дозе 10⁶ EID₅₀ APMV-8. Образцы сыворотки крови были взяты в дни 7 и 14 после первого инфицирования и в дни 7 и 14 после вторичного инфицирования. Сыворотку исследовали в тесте HI. Титры HI сывороток (в логарифмической шкале log₂) показаны на левой оси.

Фигура 6 показывает исследование продуктов ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей ПЦР) с помощью электрофореза в агарозном геле. Ткани трахеи были взяты в день 2 после инфицирования у неинфицированных уток (С1-С5) и инфицированных APMV-8 уток (11-15). Ткани гомогенизировали и готовили РНК для ОТ-ПЦР. Параллельно ставили контроль с водой (W). Продукты реакции разделяли на 1,5% агарозном геле. Размер фрагмента контролировали с использованием лестницы маркеров в 100 п.о. (New England Biolabs). Размеры фрагментов ДНК показаны справа.

Фигура 7 представляет собой таблицу, показывающую выделение вируса из кур и уток, экспериментально инфицированных APMV-8. Выделение вируса из тканей кур было проведено на зародышах куриных яиц, и определение вирусной РНК в тканях уток проводили с помощью ОТ-ПЦР.

Фигура 8 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистологического исследования некоторых органов после инфицирования кур и Пекинских уток APMV-8.

Фигура 9 показывает развитие титров HI антител у SPF кур после инфицирования разными дозами APMV-8. Однодневные SPF цыплята были инфицированы в день 1 разными инфицирующими дозами (ID) APMV-8 или ложно инфицированы средой для переноса вируса (virus transport medium, VTM). Кровь брали в дни 7 и 14 после инфицирования, и полученные образцы сывороток крови анализировали в тесте HI. Титры HI сывороток (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси. Средний геометрический титр (geometric mean titer, GMT) образцов сывороток показан в самом нижнем ряду.

Фигура 10 показывает развитие титров антител HI у Пекинских уток после инфицирования разными дозами APMV-8. Однодневные SPF Пекинские утки были инфицированы в день 1 разными инфекционными дозами (ID) APMV-8 или были ложно инфицированы средой для переноса вируса (VTM). Кровь брали в дни 7 и 14 после инфицирования, и полученные образцы сывороток анализировали в тесте HI. Титры сывороток HI (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси. Средний геометрический титр (GMT) образцов сывороток показан в самом нижнем ряду.

Фигура 11 представляет собой таблицу, показывающую SEQ ID Nos соответствующих последовательностей ДНК и белков.

Фигура 12 показывает полную геномную последовательность штамма APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: МА-7, изолирован из кряквы) и генетическую карту полноразмерного генома APMV-8.

Фигура 12А показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:2), кодирующую Нуклеопротеин (NP) APMV-8 и последовательность белка NP (SEQ ID NO:3).

Фигура 13 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:4), кодирующую Фосфопротеин (Р) APMV-8 и последовательность белка Р (SEQ ID NO:5).

Фигура 14 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:6), кодирующую Матрикспротеин (М) APMV-8 и последовательность белка М (SEQ ID NO:7).

Фигура 15 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:8), кодирующую Фьюженпротеин (F) APMV-8 и последовательность белка F (SEQ ID NO:9).

Фигура 16 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:10), кодирующую Гемагглютинин/нейраминидазу (HN) APMV-8 и последовательность белка HN (SEQ ID NO:11).

Фигура 17 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:12), кодирующую Полимеразу (L) APMV-8 и последовательность белка L (SEQ ID NO:13). Этот белок L(1) APMV-8 транслируется, начиная с кодона ATG, расположенного в положениях 8273-8275 bSEQ ID NO:1.

Фигура 18 показывает последовательность белка (2) APMV-8 Полимеразы (L) (SEQ ID NO:14). Этот белок L(2) APMV-8 транслируется, начиная с кодона ATG, расположенного в положениях 8297-8299 в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:14 не содержит первых 8 аминокислот SEQ ID NO:13.

Фигура 19А представляет собой схему системы обратной генетики для вируса APMV-8. Фигура 19В показывает результат репликации вируса APMV-8 в клетках MDCK.

Фигура 20 показывает результат теста HI у коммерчески приобретенных кур-бройлеров через 2 недели после вакцинации APMV-8.

Фигура 21 показывает результат теста HI у коммерчески приобретенных кур-бройлеров через 4 недели после вакцинации APMV-8.

Фигура 22 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 18 (исследование 1).

Фигура 23 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 19 (исследование 2).

Фигура 24 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 18 (исследование 3).

Фигура 25 показывает последовательности 5'-полноразмерного генома (5'-FLG) и 3'-полноразмерного генома (З'-FLG), включая фланкирующие последовательности.

Фигура 26 показывает карты плазмид pcNDA-NP, pcNDA-P, pcDNA-L и pcDNA3-Т7.

Фигура 27 показывает карты плазмид pUC 18-MG-APMV-8 и pCITE4A-EGFP.

Фигура 28 показывает карту плазмиды pUC57-FL-APMV-8.

Фигура 29 показывает последовательность минигенома APMV-8.

Фигура 30 показывает выравнивание последовательностей белка NP и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Фигура 31 показывает выравнивание последовательностей белка Р и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Фигура 32 показывает выравнивание последовательностей белка М и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Фигура 33 показывает выравнивание последовательностей белка F и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Фигура 34 показывает выравнивание последовательностей белка HN и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Фигура 35 показывает выравнивание последовательностей белка L и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.

Осуществление изобретения

Следует указать, что в настоящем «Осуществлении изобретения», и в особенности в «Формуле изобретения», такие термины как «включает», «включено», «включая» и тому подобное должны иметь значение, приписываемое им Законом о Патентах США; например, они могут означать «содержит в себе», «включает в себя», «включая в себя» и тому подобное; и что термины, такие как «состоя по существу из» и «состоит по существу из» имеют значение, приписываемое им Законом о Патентах США, например они позволяют элементам, которые не были в точности перечислены, входить в них, за исключением элементов, которые известны из предшествующего уровня техники, или которые влияют на основные или новые характеристики настоящего изобретения.

Если не указано по-другому, технические термины используются в соответствии с их обычным значением. Определения обычных терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V., опубликованной Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Термины в единственном числе включают и множественное число, если из контекста четко не следует другое. Подобно этому, слово «или» включает в себя «и», если контекст четко не указывает на другое. Слово «или» обозначает любого одного члена из определенного списка и также включает любую комбинацию из членов такого списка.

Следует указать, что в настоящем «Осуществлении изобретения» и в прилагаемой «Формуле изобретения» и/или в пунктах, термины «Парамиксовирусы птиц» или «APMV» используются взаимозаменяемо и обозначают и включают в себя APMV-1, APMV-2, APMV-3, APMV-4, APMV-5, APMV-6, APMV-7, APMV-8 и APMV-9.

Термин «животное» в используемом здесь значении включает в себя всех млекопитающих, птиц и рыб. Животное в используемом здесь значении может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), псовых (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие крупные кошки, и другие кошачьи, включая гепарда и рысь), бычьих (например, крупный рогатый скот), свиней (например, домашняя свинья), овечьих (например, овцы, козы, ламы, бизоны?), птичьих (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, мелкие птицы (вьюрки), сокол, ворона, африканский страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяны, долгопят, мартышка, гиббон, человекообразная обезьяна), людей и рыб. Термин «животное» также включает индивидуальное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональные и зародышевые стадии.

Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из соединенных последовательно аминокислотных остатков.

Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к РНК, ДНК, кДНК (комплементарной ДНК) или кРНК (комплементарной РНК) и их производным, таким как таковые, содержащие модифицированные каркасы. Необходимо понимать, что настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, включая последовательности, комплементарные к таковым, которые здесь описаны. Описываемые в настоящем изобретении «полинуклеотиды» включают как прямо направленную цепь (от 5' к 3'-концу), так и обратно направленную комплементарную цепь (от 3' к 5'-концу). Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены разными способами (например, химическим синтезом, клонированием генов, и т.д.) и могут принимать различные формы (например, линейные или ветвящиеся, одноцепочечные или двухцепочечные, или их гибриды, праймеры, зонды и т.д.).

Термин «геномная ДНК» или «геном» используется взаимозаменяемо и относится к передаваемой по наследству генетической информации организма-хозяина. Геномная ДНК включает ДНК ядра (также обозначается как хромосомная ДНК), а также ДНК пластид (например, хлоропластов) и других клеточных органелл (например, митохондрий). Термины геномная ДНК или геном, применяемые в настоящем изобретении, также относятся к РНК вируса. РНК может представлять собой положительную (положительной полярности) цепь или отрицательную (отрицательной полярности) цепь РНК. Термин «геномная ДНК», применяемый в настоящем изобретении, включает геномную ДНК, содержащую последовательности, которые комплементарны к описываемым здесь последовательностям. Термин «геномная ДНК» также относится к информационной (матричной) РНК (мРНК), комплементарной ДНК (кДНК) и комплементарной РНК (кРНК). Термин «Геномная НК (нуклеиновая кислота)» в используемом здесь значении включает РНК, мРНК, кРНК, ДНК и кДНК.

Термин «ген» широко используется для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены или полинуклеотиды включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК, такие как открытая рамка считывания (open reading frame, ORF), начиная со стартового кодона (метионинового кодона) и заканчивая сигналом терминации (стоп-кодоном). Гены и полинуклеотиды также могут включать участки, которые регулируют их экспрессию, например, на уровне инициации транскрипции, трансляции и терминации транскрипции. Таким образом, в данный термин также включаются промоторы и участки связывания с рибосомой (обычно эти регуляторные элементы лежат примерно между 60 и 250 нуклеотидами, расположенными выше стартового кодона кодирующей последовательности или гена; Doree S M et al; Pandher К et al; Chung J Y et al), терминаторы транскрипции (обычно терминатор располагается в пределах примерно 50 нуклеотидов ниже стоп-кодона в кодирующей последовательности или гене; Ward CKef al). Геном или полинуклеотидом также называется фрагмент нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК, или кодирует определенный белок, и который включает регуляторные последовательности.

Термин «гетерологическая ДНК» в используемом здесь значении относится к ДНК, которая происходит из другого организма, такого как другой тип клеток или другой вид по отношению к реципиенту. Данный термин также относится к ДНК или ее фрагменту из того же самого генома ДНК хозяина, когда гетерологическая ДНК вставлена в участок генома, который отличается от места ее исходной локализации.

В используемом здесь значении термин «антиген» или «иммуноген» обозначает субстанцию, которая индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный индуцировать иммунный ответ при презентации в животном-хозяине; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно этому, иммуноген или антиген могут включать в себя токсин или антитоксин.

Термин «иммуногенный белок или пептид» в используемом здесь значении включает в себя полипептиды, которые являются иммунологически активными в том смысле, что при введении такого белка хозяину он способен вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против этого белка. Предпочтительно белковый фрагмент является таким, что он обладает практически такой же иммунологической активностью, как и целый белок. Таким образом, белковый фрагмент согласно настоящему изобретению включает в себя или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный белок или пептид» в используемом здесь значении включает в себя полноразмерную последовательность белка, ее аналог или ее иммуногенные фрагменты. Под «иммуногенным фрагментом» понимается фрагмент белка, который включает в себя один или более эпитопов и, таким образом, вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с использованием любого набора методов эпитопного картирования, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, путем конкурентного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих участкам белковой молекулы, и анализа реагирования этих пептидов с антителами в условиях, когда пептиды еще остаются связанными с подложками. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в Патенте США No. 4708871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Подобно этому, конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот с помощью, например, рентгеновской кристаллографии и двухмерного ядерного магнитного резонанса. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, supra.

Термин «иммуногенный белок или пептид» дополнительно включает в себя делеции, вставки и замены в последовательности, до тех пор, пока полипептид функционирует в плане индукции иммунологического ответа, как здесь определено. Термин «консервативная вариация (замена)» означает замену аминокислотного остатка на другой биологически сходный остаток, или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, такую, что кодируемый аминокислотный остаток не изменится или будет заменен на другой биологически сходный остаток. В этом отношении особенно предпочтительные замены будут, как правило, консервативными в природе, то есть, это такие замены, которые имеют место в пределах одного семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяются на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) щелочные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цист(е)ин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируются как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, и тому подобное; или подобную консервативную замену одной аминокислоты на структурно сходную аминокислоту, что не будет оказывать значительного влияния на биологическую активность. Белки, имеющие в значительной степени одинаковую аминокислотную последовательность в качестве референтных (эталонных) молекул, но имеющие минорные аминокислотные замены, которые не влияют значительно на иммуногенность белка, попадают, таким образом, под определение референтного полипептида. Все полипептиды, полученные путем таких модификаций, являются включенными в это определение. Термин «консервативная вариация» также включает использование замененной аминокислоты на месте незамененной исходной аминокислоты, при условии, что антитела, полученные против полипептида с заменой, также являются иммунореактивными в отношении незамещенного полипептида.

Термин «клетка-хозяин» обозначает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или способна быть генетически измененной путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. При обозначении генетически измененных клеток данный термин относится как к исходно измененной клетке, так и к ее потомству. Полинуклеотиды, включающие желаемую последовательность, могут быть вставлены в подходящий вектор для клонирования или экспрессионный вектор, и данный вектор в свою очередь может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации. Полинуклеотиды могут быть введены в клетку-хозяина любым способом, известным в данной области техники. Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина с помощью любого набора подходящих методов, включая прямой перенос (поглощение), эндоцитоз, трансфекцию, спаривание (f-mating), электропорацию, трансфекцию с помощью хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или других соединений; бомбардировку микропулями; липофекцию; и инфицирование (когда вектор является инфекционным, например, как в случае ретровирусного вектора). Выбор вводимых в клетку векторов или полинуклеотидов часто будет зависеть от свойств клетки-хозяина.

«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунологический ответ» включает, но этим не ограничивается, один или более из следующих эффектов: продукцию антител, В-клеток, клеток Т-хелперов и/или цитотоксичных Т-клеток, нацеленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, хозяин будет демонстрировать либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет повышена и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижена. Такая защита будет проявляться либо в ослаблении, либо в отсутствии симптомов, обычно наблюдаемых у инфицированного хозяина, более быстром времени восстановления и/или сниженном титре вируса у инфицированного хозяина.

Одно воплощение настоящего изобретения предоставляет последовательность геномной ДНК и кодирующие белковые последовательности APMV-8. Последовательность комплементарной геномной ДНК (кДНК) штамма APMV-8 настоящего изобретения имеет полинуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO:1. Последовательность геномной кДНК APMV-8 (SEQ ID NO:1) имеет 48% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-1 (SEQ ID NO:15), 61% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-2 (SEQ ID NO:16), 47,2% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-3 (SEQ ID NO:17), 47,6% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-4 (SEQ ID NO:18), 52% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-6 (SEQ ID NO:19), 53% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-7 (SEQ ID NO:20), 99,1% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-8 (SEQ ID NO:37), 96,5% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-8 (SEQ ID NO:38), 96,4% идентичности после